İnsan Tümör Hücrelerinde ve Tümör-ksinografted Farelerde Makropinositoz Aracılı ATP İçselleştirme için Floresan Mikroskopi

Kanser hücreleri, ATP gibi besinleri hücre dışı ortamdan içselleştirme konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Protokolümüz, ATP içselleştirmesini göstermemize ve atp yerelleştirmesini hücreler içinde görselleştirmemize izin verir. Makropynozomlar içinde içselleştirilmiş ATP'nin bu yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, especial lokalizasyonu anlamak ve içselleştirme analizi miktarını tamamlamak için idealdir.

Protokol, ATP içselleştirmesini incelemek için farklı deneysel uygulamaları açıklar. Bu yöntem, makropinositoz ve eksozom aracılı endositoz da dahil olmak üzere farklı hücresel içselleştirme mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. Metabolik hastalıklar için kanser dışı hücrelerde ATP içselleştirmesi bu protokol ile incelenebilir.

Başlamak için, kanser hücrelerini FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş DMEM içeren 225 santimetrekarelik bir şişeye tohumlamak. Hücrelerin hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte büyümesine izin verin. %80'lik bir izdiham elde edildikten sonra, hücreleri ayırın ve çekirdeği santrifüjleme ile ayırın ve 100 mikrolitre PBS başına 5 kez 10 ila 6 hücre arasında hücre yoğunluğu elde etmek için hücreleri buz gibi PBS'de yeniden depolayın.

Hücre süspansiyonu 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İmmün yetmezlikli bir farenin kanadındaki enjeksiyon bölgesini% 75 etanol ile temizleyin ve fazla etanolleri hassas bir görev silme ile silin. Hücreleri, 27 kalibrelik hassas kayma iğnesi ile donatılmış bir mililitre lateks içermeyen şırıngaya çekin.

Deri altı enjeksiyonu için, iğneyi cilde yaklaşık 10 derecelik bir açıyla tutun ve iğne ucunu, eğimi derinin altına bakacak şekilde yerleştirin ve iğnenin sadece bir ila iki milimetresini cildin dışında tutun. Hücreleri şırınnadan yaklaşık 10 saniye boyunca yavaşça dağıtın. Tüm hacmi enjekte ettikten sonra, iğneyi üç ila beş saniye yerinde tutun ve ardından iğneyi geri çekin.

Enjekte edilen içeriğin sızmasını önlemek için enjeksiyon bölgesine parmaklarla üç ila beş saniye boyunca yumuşak ama sıkı bir basınç uygulayın. Tümörler 200 ila 500 milimetreküp hacme ulaşana kadar Vernier kaliperleri kullanarak tümör büyümesini izleyin ve ölçün. Mililitre yüksek moleküler ağırlıklı floresan dektran ve serumsuz DMEM başına 16 miligramlık 300 mikrolitreyi çözün ve 37 santigrat derecede 30 dakika temperlenmiş bir su banyosunda kuluçkaya yatırın, ardından dektran çözeltisini santrifüjleyin ve süpernatantı yeni bir 1,5 mililitre mikrosensürifuge tüpüne aktarın.

40 mikrolitrede, 0,2 milimolar sulanamayan floresan ATP çözeltisi yapmak için 160 mikrolitre serumsuz DMEM'e bir milimolar hidrolizezeze uygun olmayan floresan ATP analog stoğu. DMEM'de 100 mikromolar nonhidrolize edilebilir floresan ATP olsun veyamesin, mililitre başına DMEM veya mililitre başına sekiz miligram tedavi çözümlerini, daha önce hazırlanan stok çözeltilerini karıştırarak hazırlayın. Bir tedavi çözeltisinin 50 mikrolitresini toplamak için bir mililitre şırınga kullanın.

Çözeltiyi doğrudan ksinograft tümörüne enjekte edin ve her tedavinin dört biyolojik tekrarı için tekrarlayın. Fareyi ötenazi yaptıktan ve tümör dokusunu izole ettikten sonra, yeniden kesilmiş tümör dokusunu kepçeyle almak için delikli bir kaşık kullanın ve dokuyu hemen dondurucu bir ortama yerleştirin ve dokuyu yuvarlayın, dokunun orta banyolarda, tüm doku yüzeylerinde su altında kalmasını sağlayın. Dokuyu, dondurucu ortamı içeren gömme kalıbına dikkatlice yerleştirin.

İlgili etiket etiketini dikey olarak dondurma ortamına veya kalıbına yerleştirin ve yazılı etiketin ortamın dışında görünür olmasını sağlayın. Donma ortamı opak beyaza döndüğünde, doku bloğunu kalıptan çıkarın, doku bloğunu kuru buza yerleştirin ve her tümör bölümü için dondurmayı tekrarlayın. Doku bloklarını kriyoseksiyon işleminden önce birkaç ay boyunca eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Doku bloklarının slaytlarını yaptıktan sonra, doku bölümü slaytlarını beş dakika boyunca eksi 18 santigrat derecede% 95 etanolde sabitleyin. Sabit bölümü PBS ile beş dakika yıkayın. Bölümlerin büyüklüğüne göre doku bölümlerine DAPI ile 10 ila 50 mikrolitre sulu montaj ortamı ekleyin ve doku bölümünün üzerine bir cam kapak kayması yerleştirin.

12 ila 24 saatlik montajdan sonra, sabit tümör bölümlerinin ilgi alanlarını belirleyin ve daha önce gösterildiği gibi floresan mikroskopi kullanarak görüntüleri elde edin. İnsan tümör hücresi fiksasyonundan iki ila 24 saat sonra ve DAPI ile ayakta kaldıktan sonra, görüntüleri bir epifluoresans görüntüleme sistemi ve veri toplama yazılımı kullanarak yakalayın. Slaytı dürbün modunda dik bir epiflorescence mikroskobun aşamasına yerleştirin.

Görüntüleme programını açın, 10 kez hedefi seçin ve odağı tanımlamak için sahneyi ayarlayın. İlgi alanlarını belirlemek için slaydı soldan sağa serpantin bir şekilde tarayın. 40 kez hedefi seçin ve dürbünden görüntü yakalama moduna geçmek için mikroskop üzerindeki düğmeyi kullanın.

Görüntüleri görüntülemek ve daha sonra elde etmek için canlı kalite simgesine tıklayın. Her filtre küpü veya floresan kanalın pozlama parametrelerini tanımlamak için edinme araç çubuğundaki OC panelini kullanın, ardından, tanımlanan pozlama ayarlarına sahip üç kanallı bir görüntü elde etmek için çok kanallı alma araç çubuğunu kullanın. Alternatif olarak, çok kanallı görüntüler filtre küpleri arasında geçiş yaparak, pozlama süresini ayarlayarak, her kanal için görüntü alımı arasında deklanşörü kapatarak veya açarak ve tek tek kanallar için çekilen her görüntüyü kaplayarak manuel olarak elde edilebilir.

Görüntüyü nd2 dosyası olarak kaydedin. Birleştirilmiş kanal görüntüsü ve tek tek kanal görüntüleri de dahil olmak üzere TIF dosyalarını kaydedin. Kaydedilen bir nd2 görüntü dosyasındaki NHF-ATP, TMR yüksek moleküler ağırlık floresan dektran ve TMR düşük moleküler ağırlık floresan dektran pozitif hücrelerinin sayısını saymak ve verileri analiz programı aracılığıyla bir elektronik tabloya dışa aktarmak için ek açıklamalar ve ölçümler araç çubuğundaki nesne sayısı özelliğini kullanın.

Bu protokol, sulandırılabilir olmayan ATP'nin hücresel içselleştirilmesinin mekansal, zamansal ve nicel analizi için geliştirilmiştir. Nonhidrolize edilebilir floresan ATP'nin hücre içi içselleştirilmesi, yüksek veya düşük moleküler ağırlıklı floresan dektran in vitro, ex vivo ve in vivo ile nonhidrolize floresan ATP'nin kolokalizasyonu ile gösterilmiştir. Tümör hücrelerinin içselleştirilmiş ATP'yi koruduğuna emin olmak için, tüm intratümoral enjeksiyon için kriyo-gömme için sınırlı deneysel süre.

Ayrıca tümör boyunca doku görüntüleme ile intratümoral varyasyonu hesaba kat. Yöntemimizin gelecekteki yinelemeleri, E-ATP içselleştirme sürecinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini, makropynosostotik kinetik ve belirli dokulardaki kaçakçılık hakkında bilgi ortaya çıkarmasını içerebilir.