Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler

Bu protokol, araştırmacıların nitrik oksit metabolitlerinin ölçümü için sahada özel personel istihdam etme rehberliği veya masrafı olmadan bir kemilüminesans dedektörünü yetkin bir şekilde kullanmalarını sağlar. Kemilüminesans bazlı tahlil, herhangi bir biyolojik numunedeki nitrik oksit ve metabolitlerindeki minimum değişiklikleri tespit etmek için en hassas yöntemdir. Solunan nitrik oksit, çok çeşitli hastalıklar için kullanılan terapötik bir gazdır.

Hastalığın ilerlemesi ve iyileşmesinin nitrik oksit metabolit seviyeleri ile doğru bir şekilde ilişkili olması çok önemlidir. Bir antimikrobiyal olan inhale nitrik oksit, hava yolu bulaşıcı hastalıkları olan hastaların tedavisinde umut vaat etmektedir. Kemilüminesans yöntemi, nitrik oksit dozunun ve metabolitlerinin mikrobiyolojik ve patofizyolojik değişikliklerle ilişkilendirilmesi konusunda fikir vermektedir.

DETA-NONOate çözeltisini hazırlamak için, 100 milimolar DETA-NONOate üretmek ve buz üzerinde tutmak için pH 7.4 PBS'de 610 mikrolitre 10 milimolar sodyum hidroksite 10 miligram DETA-NONOat ekleyin. Devam etmek için, oksijen hattını kemilüminesans dedektörüne bağlayın ve oksijen tankını, metinde verilen üreticinin talimatına göre bir basınçta açın. Ardından, yoğun alan dielektrik filtre hattını kemilüminesans dedektörüne bağlayın.

Kemilüminesans dedektörü arayüzünde, sıvı faz analizleri için algılama programını çalıştırmaya başlayın, oksijen beslemesinin yeterli olduğundan ve dedektörün milivolt cinsinden sinyalle algılamayı gösteren örneklemeye başlayacağından emin olun, aksi takdirde negatif bir teşhis sinyali isteyin. Temizleme kabını hazırlamak için, iğne valfini sağa tamamen vidalayarak ve giriş ve çıkış durdurma musluklarını kapatarak üç bağlantı noktasındaki temizleme kabını kapatın. Kapağı temizleme kabından çıkarın.

Reaksiyon odasına planlanan tahlile özgü yeterli miktarda reaktif ekleyin, böylece numuneleri enjekte etmek için kullanılan şırınga iğnesi, kararlı, istenen bir taban çizgisinin varlığını doğrularken sıvı kolonuna ulaşabilir. Tahliye gazı akışını başlatmak için, inert gaz tankının iki aşamalı bir regülatör ile donatıldığından emin olun ve inert gaz tankını geminin gaz girişine bağlayın. Ardından, boşaltma kabının çıkışını açın ve gazı, inç kare başına bir ila beş poundluk regülatörde bir çıkış basıncı ile açın.

Ardından, boşaltma kabının girişini açın ve gaz girişine izin vermek ve boşaltma kabı içindeki köpürmeyi doğrulamak için boşaltma kabının iğne valfini yavaşça açın. Gaz akışını ayarlamak için, kemilüminesans dedektörü tarafından ölçülen hücre basıncını, ortam havasını örnekleyen yoğun alan dielektrik filtre hattı ile kaydedin. Kapağı boşaltma kabı üzerinde yeniden konumlandırın ve yoğun alan dielektrik filtre hattını boşaltma kabına bağlayın.

Ortam havasında kaydedilen kemilüminesans dedektörü seviyesinde aynı hücre basıncına ulaşmak için iğne valfini kullanın. Kemilüminesans sinyali alma programını başlatmak için, kemilüminesans dedektörünün seri portunu, alım programının yüklendiği bilgisayarın seri portuna bağlayın. Ardından, çözümleme programını çalıştırın.

Al'a tıklayın, ardından veri dosyasını kaydetmek için klasörü seçin, dosya adını yazın ve Kaydet'e tıklayın. Numune enjeksiyonuna hazırlanırken, minimum ve/veya maksimum düğmelerine tıklayarak ve ardından istenen değeri girerek ekrandaki voltaj ölçeğini hedeflenen taban çizgisi üzerinde kontrol sahibi olacak şekilde ayarlayın. Numune enjeksiyonunu gerçekleştirmek için, her numuneyi çekmeden önce şırıngayı en az iki kez veya daha fazla kez deiyonize ve damıtılmış suyla durulayın ve bir görev silme işleminde engelsiz bir su tahliyesi sağlayın.

Ardından, hem şırıngayı hem de tüpü yakın bir mesafede tutarken şırıngayı numune tüpüne yerleştirin ve hava kabarcığı veya homojenize edilmemiş katı parçaların sıkışmamasını sağlarken pistonu istenen hacme çekin. Şırınganın ucunu bir görev sileceği ile temizleyin ve şırıngayı enjeksiyon portundaki ayarlayıcı kapağına yerleştirin. Şırınganın ucunun sıvı fazda olduğunu doğruladıktan sonra, numuneyi reaksiyon odasına enjekte edin.

Yazılım programında enjeksiyonu işaretlemek için, Örnek Adları'nın altındaki gri kutuya tıklayarak numune adını yazın, ardından enjeksiyonun sinyalde yukarı doğru bir değişikliğe veya hücresiz hemoglobin testi ile nitrik oksit tüketiminde aşağı doğru bir değişikliğe neden olduğunu doğrularken Enjeksiyonu İşaretle'ye tıklayın. Hücresiz hemoglobin ve nitrik oksit tüketimi arasındaki doz yanıtı ilişkisi, kardiyopulmoner bypass sonrası kemilüminesans ile ölçüldü. Nitrik oksit temizleyen oksitlenmiş durumda yüksek konsantrasyonda heme grupları olduğu varsayılabilir.

Kardiyopulmoner bypass sırasında nitrik oksit alan hastalarda, bunun yerine, heme gruplarının çoğunluğu azalır ve nitrik oksit tüketmez. Hücresiz hemoglobin konsantrasyonunun ölçümleri, kardiyopulmoner bypasstan sonraki 12 saat içinde plazmadan yavaş bir eliminasyon olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, nitrik oksit tüketimi 15 dakikada zirveye ulaştı ve hücresiz hemoglobinin eliminasyonunu yansıtmadı.

Hücresiz hemoglobin tarafından nitrik oksit tüketiminin doğrusal regresyon eğrileri, kardiyopulmoner bypass sonrası 4 saat ve 12 saat sonra başlangıçta daha azalmış hemoglobinin aksine, 15 dakikada oksitlenmiş ve nitrik oksit tüketen hemoglobin prevalansı sergiledi. Nitrik oksit gazı uygulamasının nitrik oksit tüketimi üzerindeki etkileri izlendi. Hastalar ameliyat sırasında ve sonrasında nitrik oksit gazı ile tedavi edildiğinde, kardiyopulmoner bypass sonrası gözlenen serbest hemoglobin artışı, nitrik oksit tüketimindeki herhangi bir artışla birleştirilmemiştir.

Sonuçlar, eksojen olarak uygulanan nitrik oksidin serbest hemoglobinin çoğunu azalttığını ve nitrik oksit temizlemeyi önlediğini göstermiştir. Deneme, yalnızca tüm koşullar aynı kalırsa geçerlidir. Sıvı seviyesinin yüksekliği reaksiyon kolonunu aşarsa, durmalı ve yeni bir kalibrasyon yapmalıyız.