Arginin Metilomunun Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Araştırılması

Bu protokol, arginin metilasyonunun seviyelerini ve dinamiklerini ölçmeyi mümkün kılar. Bu modifikasyon önemli düzenleyici roller oynar ve hastalık için bir biyobelirteç olarak hizmet edebilir. Bu yöntemin avantajı, hücrelerden, ortamlardan dokulara ve biyosıvılara kadar neredeyse sınırsız sayıda matris için basit bir iş akışı sağlamasıdır.

Arginin metilasyonu birçok insan kanserinde yükselir ve arginin yöntemi transferazlarının ilk inhibitörleri klinik çalışmalarda test edilir. Bu yöntem, hastaların tabakalaşmasına ve risk değerlendirmesine yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma teknisyeni olan Hansjorg Habisch olacak.

Sıvı numuneler için, numunenin 200 mikrolitresine 400 mikrolitre buz gibi soğuk metanol ekleyin ve ardından eksi 20 santigrat derecede 30 dakika inkübasyon yapın. Bu numuneyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı hareket ettirin ve peleti 1,5 mililitrelik tüplerde toplayın.

Katı malzemeler için, 30 ila 60 miligram doku veya hücre peleti içeren hamur tüplerine 600 mikrolitre% 66 metanol su ekleyin. Yumuşak dokuyu 20 saniye boyunca bir kez ve sert dokuyu 20 saniye boyunca iki kez aralarında beş dakikalık aralıklarla homojenize edin. Numuneyi hemen buzun üzerine yerleştirin ve tüm lizatı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın, ardından inkübasyon.

Ardından, numuneyi 30 dakika boyunca 10.000 G'de santrifüj edin. Dört santigrat derecede, 1.5 mililitrelik tüplerde süpernatantı seçin ve bu süpernatanı kullanarak protein hidrolizine devam edin. Her tüpün kapaklarını kesin.

Daha sonra her numuneye 500 mikrolitre dokuz molar hidroklorik asit ekleyin. Son olarak, tüpleri cam tüplere koyun. Kapaklarla sıkıca kapatın, uygun sızdırmazlığı sağlayın ve bu tüpleri kısmen kumla dolu bir cam beherin içine yerleştirin.

Numuneleri bir kurutma odasında 110 santigrat derecede 16 saat boyunca hidrolize edin. Numuneleri soğutun ve yüksek vakumlu bir santrifüj kullanarak gece boyunca liyofilize edin. Ertesi gün, tamamen kurutulmuş peletleri bir mililitre 0.1 molar hidroklorik asit içinde çözün.

Her tüpe 50 mikrolitre kloroform ekleyin ve 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak peleti iyice çözün. Tüm hacmi yeni bir tüpe aktarın ve numuneleri 10 dakika boyunca santrifüj edin. Bifazik sıvının üst fazını yeni bir tüpte dikkatlice toplayın.

Manuel için plastik tüpler veya robotik katı faz ekstraksiyonu için cam tüpler kullanın. Manuel katı faz ekstraksiyonu için, kartuşları her çalıştırmada ön koşullandırın ve ardından bir dakikalık santrifüjleme yapın. Bundan sonra, numuneyi SPE kartuşlarına yükleyin ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 600 G'de santrifüj yapın.

Kartuşları üç kez bir mililitre suyla yıkayın, her yıkamayı bir dakika boyunca santrifüjleme takip edin. Daha sonra bir mililitre 0.1 molar hidroklorik asit ile beş kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında 800 G'de bir dakika santrifüjleme yapın. Kartuşları bir mililitre metanol ile iki kez yıkayın ve ardından bir dakika boyunca santrifüjleme yapın.

Arjinin ve türevlerini, bir mililitre üç X yedek çözeltisi ekleyerek ve bir dakika boyunca iki kez santrifüj yaparak 15 mililitrelik tek bir tüpe salın. Robotik katı faz ekstraksiyonu için, elüatların toplanması için tüpler ve bifazik sıvının üst fazını içeren cam tüpleri robotun ilgili konumuna yerleştirin. Manuel SPE için açıklanan adımlara dayalı olarak yazılımda bir uygulama veya yöntem kullanın.

Amonyak ve sudan kurtulmak için numuneleri gece boyunca tamamen kuruması için liyofilize edin. Her numuneyi homojen hale gelene kadar 500 mikrolitre NMR tamponunda çözün. Daha sonra her NMR tüpüne eşit miktarda homojen numune aktarın.

SPE protokolü kullanılarak saflaştırılan maya proteini hidrolizatlarının J-RES spektrumları burada gösterilmiştir. Farklı karakteristik kimyasal kaymalar, L-arginin ve ADMA'yı milyonda 3.25 ve 3.02 parçada ayırt edebilir. Her iki madde de hücresel bir matriste ayrılabilir ve ölçülebilir.

İlgili kimyasal kaymadaki spesifik metil veya metilen grubunun proton sayısına dayanarak, bir H nükleer manyetik rezonans spektroskopisi hassas nicelemeye izin verir. Bu yaklaşımı kullanarak, SDMA ve MMA'nın bir H nükleer manyetik rezonans kimyasal kaymaları, milyon SDMA başına 2.76 parça ve milyon MMA başına 2.74 parçada karakteristik kimyasal kaymalarla ayrılabilir ve ölçülebilir. Bu protokolü uygularken, suda çözünür fraksiyonu içeren bifazik sıvının üst fazını bir pipetle dikkatlice toplayın ve yeni tüplere aktarın.

Manuel SPE için 1,5 mililitrelik tüpler veya robotik SPE için sınıf camı kullanın. Kloroform ve içeriğinin üzerine dökülmekten kaçının. Arjinin içeren elüatlar ve metillenmiş arginin türleri NMR spektroskopisi kullanılarak analiz edilir.

Bu, bu türlerin mutlak miktarlarını verir. Teknolojimiz şu anda arginin metilasyonunun patofizyolojik rolünü incelemeyi amaçlayan çok sayıda temel araştırma projesinde kullanılmaktadır. Ayrıca, protein arginin metilasyonunu çeşitli insan hastalıklarında biyobelirteç adayı olarak değerlendiriyoruz.