Name: Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin, yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre yöntemiyle aynı hücrede birden fazla epigenetik işareti incelemeyi. Bu teknik, sınırlı hasta hücreleriyle epigenetik terapi tasarımına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. David Sanchez-Martin ve Christopher B. Buck'a projenin kavramsallaştırma aşamasındaki yorumları için teşekkür ederiz. Ayrıca, ön deneylerde yardım için Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institutes, National Institute of Health'e ve hesaplamalı analizde tavsiye için Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH'ye teşekkür ederiz. Yöntemde kullanılan DNA polimerazlarının optimizasyonuna yardımcı olduğu için Bayan Anna Word'e teşekkür ederiz. Bu çalışmada NIHHPC Biowulf kümesinin (http://hpc.nih.gov) hesaplama kaynakları kullanılmıştır. Bu proje, Kanser Araştırmaları Merkezi'nin Intramural Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, NCI Direktörünün İnovasyon Ödülü (#397172) ve Ulusal Kanser Enstitüsü'nden HHSN261200800001E Sözleşme No'lu Federal fonlar tarafından desteklenmektedir. Dr. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy ve Hücresel Onkoloji Laboratuvarı'nın tüm üyelerine verimli yorumları için teşekkür ederiz.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Ohnuki ve Tosato, "Yeniden kullanılabilir tek bir hücre hazırlama yöntemleri ve tek bir hücrenin epigenomunu, transkriptomunu ve genomunu analiz etme yöntemleri" (EP3619307 ve US20200102604) başlıklı bir patentin ortak mucitleridir. Patent başvurusu kısmen mevcut makalede açıklanan teknolojiyle ilgili ön sonuçlara dayanarak yapılmıştır. Bu patent başvurusunda açıklanan ve iddia edilen buluş veya icatlar, mucitler ABD Hükümeti'nin tam zamanlı çalışanlarıyken yapılmıştır. Bu nedenle, 45 Federal Düzenlemeler Yasası Bölüm 7 uyarınca, bu patent başvurusuna ilişkin tüm haklar, unvanlar ve menfaatler yasa gereği ABD Hükümetine devredilmiştir veya verilmelidir. ABD Hükümeti, aldığı telif haklarının bir kısmını 15 ABD Kodu § 3710c uyarınca çalışan mucitlerine aktarır.

Bu makalede, yeniden kullanılabilir tek hücreler7 kullanılarak yakın zamanda bildirilen tek hücreli multiepigenomik analiz için adım adım protokol açıklanmaktadır. Sonraki paragraflarda, protokoldeki potansiyel sınırlamaları vurgulayarak kritik noktaları tartışıyoruz. 
Protokol boyunca kritik noktalardan biri (7.2-13. adımlardan itibaren) DNaz kontaminasyonunu önlemektir. Tek bir hücre, genomik DNA'nın sadece iki kopyasına sahiptir. Bu nedenle, genomik DNA'ya zarar verm...

Tek hücreli teknoloji, bireysel tek hücreli omik teknolojilerini entegre eden tek hücreli multiomik çağına giriyor1. Son zamanlarda, tek hücreli transkriptomikler, kromatin erişilebilirliğini (scNMT-seq2 ve SHARE-seq3) veya histon modifikasyonlarını (Paired-seq4 ve Paired-Tag5) tespit etmek için yöntemlerle birleştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, tek hücreli transkriptomik ve proteomik, kromatin erişilebilirliği ile entegre edilmiştir (DOGMA-seq6). Bu yöntemler, kromatin erişilebilirliğini veya histon modifikasyonlarını tespit etmek için transpozaz tabanlı etiketleme kullanır.
Transpozaz bazlı yaklaşımlar genomik DNA'yı parçalara ayırır ve genomik DNA fragmanının sonuna bir DNA barkodu ekler. Her parçalanmış genomik parça sadece iki DNA barkodunu (= bölünme bölgesi başına bir epigenetik işaret) kabul edebilir ve bölünme bölgesindeki genomik DNA kaybolur. Bu nedenle, bölünmeye dayalı yaklaşımlar, test edilen epigenetik işaretlerin sayısı ile sinyal yoğunluğu arasında bir dengeye sahiptir. Bu, aynı tek hücredeki çoklu epigenetik işaretlerin analizini engeller. Bu sorunun üstesinden gelmek için genomik DNA'yı parçalamayan tek hücreli bir epigenomik yöntem geliştirilmiştir 7,8.
Yukarıda bahsedilen bölünme kaynaklı soruna ek olarak, transpozaz tabanlı yaklaşımların başka sınırlamaları da vardır. Tek hücreli epigenom analizinde, histonların ve DNA ile ilişkili proteinlerin genom üzerindeki yerini bilmek çok önemlidir. Mevcut yaklaşımlarda bu, sabit olmayan tek hücreler kullanılarak ve protein-DNA ve protein-protein etkileşimlerinin tutulmasıyla gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu, histon modifikasyonlarının analizinde bile erişilebilir kromatin bölgelerine güçlü bir önyargı oluşturur 9. Histonların ve genomla ilişkili proteinlerin genom üzerindeki yeri, bir poliakrilamid iskelesi 7,8 kullanılarak protein-DNA ve protein-proteini çapraz bağlamadan korunabilir. Bu yaklaşım, protein-DNA ve protein-protein etkileşimlerine dayanan mevcut yaklaşımlarda gözlenen yapısal önyargıyı azaltır.
Transpozaz tabanlı yaklaşımlar, tek bir hücreden yalnızca bir kez sinyal alabilir. Bu nedenle, sinyallerin düşmesi nedeniyle tek bir hücrenin tam epigenomunu tanımlamak zordur. Yeniden kullanılabilir tek hücreler, aynı tek hücrede yinelemeli epigenomik analize izin vererek mevcut sınırlamaların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>10x CutSmart tamponu</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x Sindirim tamponu</td></tr><tr><td>200 geçirmez etanol</td><td>Warner-Graham Company</td><td>200 kanıt</td><td>Etanol</td></tr><tr><td>5-Hidroksimetilsitozin (5-hmC) Monoklonal Antikor [HMC/4D9]</td> <td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>Anti-5hmC</td></tr><tr><td>Akridin Portakal / Propidyum İyodür Leke</td><td>Logoları Biosystems</td><td>F23001</td><td>Hücre sayacı</td></tr><tr><td>Akrilamid çözeltisi, H2O içinde %40, moleküler biyoloji için</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>%40 akrilamid çözeltisi</td></tr><tr><td>Hepsi Bir Arada Floresan Mikroskobu BZ-X710</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Tarama mikroskobu</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Santrifüj Filtre Ünitesi</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024</td><td>Ultrafiltrasyon kaseti</td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji</td> <td>için amonyum persülfatMilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>Amonyum persülfat tozu</td></tr><tr><td>Susuz DMF</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>S-4001-005</td><td>Susuz N,N-dimetilformamid (DMF)</td></tr><tr><td>Anti-RNA polimeraz II CTD tekrarı YSPTSPS (fosfo S5) antikoru [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Anti-Pol II</td></tr><tr><td>Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457) antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI Sığır</td></tr><tr><td>Serum Albümin çözeltisi, H2O içinde 20 mg / mL, düşük biyolojik yük, proteaz içermeyen, moleküler biyoloji için</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>%20 BSA (Tablo 7)</td></tr><tr><td>Bst DNA Polimeraz, Büyük Parça</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst DNA polimeraz</td></tr><tr><td>BT10 Serisi 10 & mikro; l Bariyer Ucu</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 düşük tutma ucu</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>Otomatik Laboratuvar Çözümleri</td><td>Yok</td><td>Otomatik tek hücreli toplama robotu</td></tr><tr><td>CellCelector 4 nl tek hücre klonlama için nanokuyu plakaları, Plaka S200-100 100K, 24 kuyu, ULA</td><td>Otomatik Laboratuvar Çözümleri</td><td>CC0079</td><td>4 nL nanokuyu plakası</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>Kloroform</td></tr><tr><td>Corning Costar 96 Kuyulu, Hücre Kültürü ile Tedavi Edilmiş, Düz Tabanlı Mikroplaka</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Düz Tabanlı 96 Kuyulu Plakalar</td></tr><tr><td>Derin Havalandırma (ekzo-) DNA Polimeraz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- DNA polimeraz</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tüpleri, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0,5 mL DNA düşük bağlayıcı tüp</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 1. rastgele primer</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/ A, bakınız Tablo 3</td><td>1. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 01</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 02</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 03</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 04</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 05</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 06</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 07</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 08</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 09</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre # 10</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre#11</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. rastgele primer Hücre#12</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. rastgele primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. sentez primeri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>2. sentez primeri</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Ligasyon Adaptörü</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>Ligasyon Adaptörü</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Ters Transkripsiyon primeri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>Ters Transkripsiyon primeri</td></tr><tr><td>DNaz I (RNaz içermez)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNaz I (RNaz içermez, 4 U).</td></tr><tr><td>DNase I Reaksiyon Tamponu</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x DNase I tamponu (NEB)</td></tr> <tr><td>dNTP Karışımı (her biri 10 mM)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTP'ler</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, ABD menşeli, Isı ile inaktive edilmiş</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Fetal sığır serumu</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti</td><td>New England BioLabs</td><td>E2040S</td><td>In-vitro-transkripsiyon ana karışımı</td></tr><tr><td>Histon H3K27ac antikoru</td><td>Aktif motif</td><td>39133</td><td>Anti-H3K27ac</td></tr><tr><td>Histon H3K27me3 antikoru</td><td>Aktif motif</td><td>39155</td><td>Anti-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG tavşan serumundan</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>Kontrol IgG</td></tr><tr><td>Demir oksit (II, III) manyetik nanotoz, 30 nm ort. parça boyutu (TEM), NHS ester işlevselleştirilmiş</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>NHS ester işlevselleştirilmiş 30 nm demir oksit tozu</td></tr><tr><td>K-562</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)</td> <td>CCL-243</td><td>hücreleri</td></tr><tr><td>Lineer Akrilamid (5 mg / mL)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>AM9520</td><td>Lineer Akrilamid</td></tr><tr><td>LUNA-FL Çift Floresan Hücre Sayacı</td><td>Logoları Biosystems</td><td>L20001</td><td>Hücre sayacı</td></tr><tr><td>LUNA Hücre Sayma Slaytları, 50 Slayt</td><td>Logolar Biyosistemler</td><td>L12001</td><td>Hücre sayacı</td></tr><tr><td>Mineral yağ, BioReagent, moleküler biyoloji için, hafif yağ</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>Mineral yağ</td></tr><tr><td>N, N, N & prime;, N & prime; -Moleküler biyoloji için tetrametiletilendiamin</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N, N, N & prime;, N & prime;-Tetrametiletilendiamin</td></tr><tr><td>NaCl (5 M), RNaz içermeyen</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Termo Balıkçı</td><td>2516</td><td>&nbsp; Mikrohacim spektrofotometresi</td></tr><tr><td>NEST 2 mL 96 Kuyulu Derin Kuyu Plakası, V Alt</td><td>Açtronlar</td><td>N/A</td><td>2 mL derin kuyu 96 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>Eteksiz 96 oyuklu PCR plakası</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-405</td><td>96 oyuklu PCR plakası</td></tr><tr><td>NuSive GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>Agaroz</td></tr><tr><td>OmniPur Akrilamid: Bis-akrilamid 19:1, %40 Çözelti</td><td>MilliporeSigma</td><td>1300-500ML</td><td>%40 Akrilamid/Bis-akrilamid</td></tr><tr><td>OT-2 laboratuvar robotu</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>Otomatik sıvı taşıma robotu</td></tr><tr><td>Paraformaldehit, EM Sınıfı, Saflaştırılmış, %20 Sulu Çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15713</td><td>%20 Pararmaldehyde</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>A P1000 pipet</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tüpleri, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1,5 mL Protein düşük bağlayıcı tüp</td></tr><tr><td>QIAgen Jel Ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>A P1000 pipet</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Testi</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp; dsDNA'ya özgü interkalatör boyası</td></tr><tr><td>Hızlı Ligasyon kiti</td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 DNA ligaz (NEB)</td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörü</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>RNAse inhibitörü</td></tr><tr><td>S-4FB Çapraz bağlayıcı (DMF-çözünür)</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>S-1004-105</td><td>Süksinimidil 4-formilbenzoat (S-4FB)</td></tr><tr><td>S-HyNic</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>S-1002-105</td><td>Süksinimidil 6-hidrazinikotinat aseton hidrazon (S-HyNic)</td></tr> <tr><td>Sodyum Asetat, 3 M, pH 5.2, Moleküler Biyoloji Sınıfı</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M Sodyum asetat (pH 5.2)</td></tr> <tr><td>Sodyum bikarbonat, 1M tampon soln., pH 8.5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>1M sodyum bikarbonat tamponu, pH 8.5</td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji için sodyum fosfat dibazik</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Moleküler biyoloji için Na2HPO4</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV ters transkriptaz</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090050</td><td>Ters transkriptaz</td></tr><tr><td>SYBR Altın Nükleik Asit Jel Lekesi (DMSO'da 10.000x Konsantre)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11494</td> DNA T4 <td>için bir interkalatör boyası</td></tr><tr><td> DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu</td></tr><tr><td>ThermoPol Reaksiyon Tampon Paketi</td><td>New England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x TPM-T tamponu (Tris-HCl/Pottasium klorür/Magnezyum sülfat/Triton X-100)</td></tr><tr><td>TRIzol LS reaktifi</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td>Guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>TruSeq Nano DNA kütüphanesi hazırlık kiti</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>Bir DNA kütüphanesi hazırlama kiti (ayrıca üreticinin talimatına bakınız)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>Antikor için amin modifiyeli bir DNA probu</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>Antikor</td></tr> <tr><td>için amin modifiyeli bir DNA probuUltramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>Antikor Ultramer DNA Oligo için amin ile modifiye edilmiş bir DNA probu</td></tr><tr><td>, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>Antikor Ultramer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>Antikor için amin modifiyeli bir DNA probu</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Kontrol IgG_Ab#001</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A, bakınız Tablo 3</td><td>Kontrol için amin modifiyeli bir DNA probu</td></tr><tr><td>IgG UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNaz İçermeyen Damıtılmış Su</td><td>Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>Ultra saf su</td></tr><tr><td>Zeba Splin Tuz Giderme Kolonları, 7K MWCO, 0.5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>89882</td><td>Tuzdan arındırma sütunu</td></tr></tbody></table>

yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Mevcut tek hücreli epigenom analizleri tek kullanım için tasarlanmıştır. Hücre tek bir kullanımdan sonra atılır, tek bir hücrede çoklu epigenetik işaretlerin analizini önler ve sinyali tek bir hücredeki deneysel arka plan gürültüsünden ayırt etmek için diğer hücrelerden veri gerektirir. Bu makalede, yinelemeli epigenomik analizler için aynı tek hücreyi yeniden kullanma yöntemi açıklanmaktadır. 
Bu deneysel yöntemde, hücresel proteinler ilk önce protein ve DNA'ya çapraz bağlamak yerine bir poliakrilamid polimere bağlanır ve yapısal önyargıyı hafifletir. Bu kritik adım, aynı tek hücreyle tekrarlanan deneylere izin verir. Daha sonra, yakınlık ligasyonu için bir iskele dizisine sahip rastgele bir astar, genomik DNA'ya tavlanır ve genomik dizi, bir DNA polimeraz kullanılarak genişletilerek primer'e eklenir. Daha sonra, her biri farklı DNA probları ile etiketlenmiş bir epigenetik belirteç ve kontrol IgG'ye karşı bir antikor, aynı tek hücredeki ilgili hedeflere bağlanır. 
Rastgele primer ve antikor arasında, rastgele primer ve antikor-DNA probunun iskele dizisine tamamlayıcı dizilere sahip bir bağlayıcı DNA eklenerek yakınlık ligasyonu indüklenir. Bu yaklaşım, antikor bilgisini ve yakındaki genom dizilerini, yakınlık ligasyonunun tek bir DNA ürününde bütünleştirir. Aynı tek hücreyle tekrarlanan deneylere olanak tanıyarak, bu yöntem nadir bir hücreden veri yoğunluğunda bir artışa ve aynı hücreden sadece IgG ve antikor verilerini kullanarak istatistiksel analize izin verir. Bu yöntemle hazırlanan yeniden kullanılabilir tek hücreler en az birkaç ay saklanabilir ve daha sonra epigenetik karakterizasyonu genişletmek ve veri yoğunluğunu artırmak için tekrar kullanılabilir. Bu yöntem araştırmacılara ve projelerine esneklik sağlar.

K562 tek hücreleri, adım 8'de açıklanan protokol kullanılarak oluşturulmuştur (bkz. Şekil 5). Tek hücreler poliakrilamid boncuğun dış tabakasına gömüldü. Hücre DNA'sı, DNA boyaması için bir interkalatör boya kullanılarak boyandı ve görselleştirildi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> Şekil 5: Oluşturulan yeniden kullanılabilir tek hücreler.</str...

Mevcut protokol, yeniden kullanılabilir tek bir hücre kullanarak yinelemeli epigenomik analizler için tek hücreli bir yöntemi açıklamaktadır. Yeniden kullanılabilir tek hücre, aynı tek hücrede birden fazla epigenetik işaretin analizine ve sonuçların istatistiksel olarak doğrulanmasına izin verir.

Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Bu deneysel yöntem, epigenomik test için yeniden kullanılabilir tek hücrelerin uzun süreli depolanmasına izin verir. Aynı zamanda aynı tek hücrede birçok epigenetik işaretin ve transkripsiyon faktörünün analizine izin verir. Tek hücreli epigenom analizi için mevcut yöntemlerde, aynı tek hücreler yeniden analiz edilemez.Bununla birlikte, yeniden kullanılabilir tek hücrelerle, aynı tek hücreler birçok kez yeniden analiz edilebilir. Bu teknik, özellikle hasta hücrelerinin sınırlı olduğu durumlarda, epigenetik tedavinin teşhisi ve tasarımı için yararlıdır. Bu yöntem, epigenetik işaretler için spesifik antikorlar mevcut olduğu sürece epigenomun incelenmesi, gen ekspresyonunun düzenlenmesi ve diğer sistemler için en uygun yöntemdir.Bu tekniği ilk denediğinizde, çok değerli olmayan örnekler üzerinde pratik yapmanızı ve MiSeq veya iSeq 100 gibi sığ sıralama kullanarak deneyi doğrulamanızı öneririz. Başlamak için, temiz bir laminer akış başlığında, bir mililitre hücre süspansiyonunu ve DNA için bir interkalatör boya içeren 199 mililitre bir milimolar EDTA PBS'yi karıştırın. Karıştırdıktan sonra, hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini düz tabanlı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna akta

reusable-single-cell-for-iterative-epigenomic-analyses

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Tek hücreli sıralama genotypic heterojenlik biyolojik sistemlerde ortaya çıkarır, ama daha fazla işlem hacmi derin topluluk kompozisyon ve işlev profil oluşturma için gerekli güncel teknolojileri eksikliği. Burada, biz bir mikrosıvısal iş akışı sıralama için tarif &gt; 50.000 tek hücreli genleri farklı popülasyonlar hücre.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Bu iletişim kuralı genel işlemlerini açıklar ve kalite kontrol sağlıklı yetişkin memeli tek hücreleri damlacık-esaslı, yüksek üretilen iş tek hücre RNA-Seq hazırlıkları hazırlanması için gerekli denetler. Sıralama parametreleri, okuma hizalama ve aşağı akım tek hücreli bioinformatic analiz da sağlanır.

Damlacık tek hücre barkodlama tabanlı Transcriptomics yetişkin memeli dokuların

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

CUT&amp;RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&amp;RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

Bu protokolde, çevirici ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yöntemi ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, bir Cyp17a1-Cre fare hattına geçilen NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomunun ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için optimize edilmiştir.

Fare yumurtalık epigenomu ve transkriptomunun hücreye özgü eşleştirilmiş sorgulaması

Protokol, daha önce keşfedilmemiş bağırsak biyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlamak için insan bağırsak organoid teknolojisini tek hücreli transkriptomik analizle birleştirir.

Tek Hücreli Transkripsiyonel Seviyede İnce Bağırsak Epitelini Anlamak için İnsan Bağırsak Organoidlerini Kullanma

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Öğrenin, yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre yöntemiyle aynı hücrede birden fazla epigenetik işareti incelemeyi. Bu teknik, sınırlı hasta hücreleriyle epigenetik terapi tasarımına olanak tanır.

Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre

Daha fazla video keşfet