İmmünkompetan Farelerin Beyinde Non-invaziv Transnazal Yolla İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Mikroglia Transplantasyonu

Burada sunulan protokol, immünkompetan farelerde transnazal bir yolla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikrogliasının (iPSMG) beyne transplantasyonuna izin verir. Hücrelerin hazırlanması ve transnazal transplantasyonu ve iPSMG'nin idamesi için sitokin karışımının uygulanması yöntemi gösterilmiştir.

Bu protokol, CSF1 reseptör antagonisti PLX5622'nin farmakolojik olarak açılıp kapatılması ile transnazal transplantasyonu birleştirerek iPSMG'nin immünkompetan fare beynine invaziv olmayan bir transplantasyonuna izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, iPSMG'nin immünokompetan farelerde bile beyin hasarına neden olmadan nakledilebilmesidir. Mikroglial transplantasyon, gelecekte çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda disfonksiyonel mikroglia ile fonksiyonel olanları değiştirmek için potansiyel bir tedavi olarak hizmet edebilir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırmacı olan Bijay Parajuli olacak. Dondurulmuş indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikroglia hücrelerini 37 santigrat derecelik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözerek başlayın. Tüm görünür buzlar eriyene kadar örnekleri döndürün.

Çözülmüş iPSMG'yi kültür ortamına ekleyin, 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. 10 mililitre kültür ortamına bir mililitre hücre ekleyin. Bir hücre peleti elde etmek için hücreleri beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın.

Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Mikrolitre başına beşinci hücrelere 10 ila 10 hücre konsantrasyonu elde etmek için transplantasyon ortamını ekleyin. İPSMG'yi buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin.

Transnazal transplantasyona fareleri hazırlamak için, erkek fareleri yedi gün boyunca PLX içeren bir diyetle besleyin. Yedinci günün sonunda, PLX diyetini durdurun ve fareleri normal bir diyetle besleyin. iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan bir saat önce, burun mukozasına geçirgenliği arttırmak için 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak PBS'de 2.5 mikrolitre hyaluronidaz her burun deliğine iki kez uygulayın.

Hyaluronidaz uygulamasından sonra fareleri sırtüstü pozisyona getirin. iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan on dakika önce 2.5 mikrolitre hyaluronidaz uygulayın. 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2,5 mikrolitre hücre süspansiyonu uygulayın.

Hücre süspansiyonunun diğer burun deliğine uygulanmasından önce fareyi beş dakika boyunca sırtüstü pozisyonda tutun. Hücre süspansiyonunu dört kez uygulayın ve hayvan başına toplam 20 mikrolitre hacim uygulayın. PLX beslemesinin kesilmesinden 48 saat sonra, aynı farelerde hyaluronidaz ve hücre süspansiyonu uygulanmasını tekrarlayın.

Sitokinlerin uygulanması için, 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2.5 mikrolitre transplantasyon ortamı uygulayın. Transnazal transplantasyondan iki ay sonra, nakledilen hücrelerin sayısı, hem insana özgü hem de pan-mikroglial belirteçler için pozitif olan hücrelerin sayılmasıyla belirlenebilir. Endojen fare mikrogliası sadece pan-mikroglial belirteç için pozitiftir.

Kontrol farelerinde, hem kortekste hem de hipokampusta sadece fare mikrogliası tespit edildi. İPSMG nakledilen farelerin korteksinde sadece fare mikrogliası tespit edilirken, hipokampusta iPSMG tespit edildi. Bu protokolü denerken, sitokinlerin seyreltilmesini önlemek için süpernatantın tamamen çıkarılması esastır.

Nakledilen hücrelerin yaşayabilirliği için her 12 saatte bir sitokin uygulamak çok önemlidir. İPSMG'nin transplantasyonu için endojen fare mikrogliasının tükenmesi gereklidir. Bu prosedür, iPSMG'nin normal veya hastalıklı bir fare beynine nakledilmesine izin verir.

Böylece iPSMG'nin karakteristiği ve hastalığa yanıtı belirlenebilir. Bu teknik, fare beynindeki iPSMG'nin in vivo karakteristiğini belirlemek için uygundur. Bu nedenle, iPSMG'nin hastalık modeli farelere nakledilmesi, cevabı anlamamıza yardımcı olacak ve yeni bir terapötik hedefin yolunu açabilir.