İmmünkompetan Farelerin Beyinde Non-invaziv Transnazal Yolla İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Mikroglia Transplantasyonu
31 Mayıs 2022
Burada sunulan protokol, immünkompetan farelerde transnazal bir yolla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikrogliasının (iPSMG) beyne transplantasyonuna izin verir. Hücrelerin hazırlanması ve transnazal transplantasyonu ve iPSMG'nin idamesi için sitokin karışımının uygulanması yöntemi gösterilmiştir.
Bu protokol, CSF1 reseptör antagonisti PLX5622'nin farmakolojik olarak açılıp kapatılması ile transnazal transplantasyonu birleştirerek iPSMG'nin immünkompetan fare beynine invaziv olmayan bir transplantasyonuna izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, iPSMG'nin immünokompetan farelerde bile beyin hasarına neden olmadan nakledilebilmesidir. Mikroglial transplantasyon, gelecekte çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda disfonksiyonel mikroglia ile fonksiyonel olanları değiştirmek için potansiyel bir tedavi olarak hizmet edebilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırmacı olan Bijay Parajuli olacak. Dondurulmuş indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikroglia hücrelerini 37 santigrat derecelik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözerek başlayın. Tüm görünür buzlar eriyene kadar örnekleri döndürün.
Çözülmüş iPSMG'yi kültür ortamına ekleyin, 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. 10 mililitre kültür ortamına bir mililitre hücre ekleyin. Bir hücre peleti elde etmek için hücreleri beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın.
Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Mikrolitre başına beşinci hücrelere 10 ila 10 hücre konsantrasyonu elde etmek için transplantasyon ortamını ekleyin. İPSMG'yi buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin.
Transnazal transplantasyona fareleri hazırlamak için, erkek fareleri yedi gün boyunca PLX içeren bir diyetle besleyin. Yedinci günün sonunda, PLX diyetini durdurun ve fareleri normal bir diyetle besleyin. iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan bir saat önce, burun mukozasına geçirgenliği arttırmak için 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak PBS'de 2.5 mikrolitre hyaluronidaz her burun deliğine iki kez uygulayın.
Hyaluronidaz uygulamasından sonra fareleri sırtüstü pozisyona getirin. iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan on dakika önce 2.5 mikrolitre hyaluronidaz uygulayın. 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2,5 mikrolitre hücre süspansiyonu uygulayın.
Hücre süspansiyonunun diğer burun deliğine uygulanmasından önce fareyi beş dakika boyunca sırtüstü pozisyonda tutun. Hücre süspansiyonunu dört kez uygulayın ve hayvan başına toplam 20 mikrolitre hacim uygulayın. PLX beslemesinin kesilmesinden 48 saat sonra, aynı farelerde hyaluronidaz ve hücre süspansiyonu uygulanmasını tekrarlayın.
Sitokinlerin uygulanması için, 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2.5 mikrolitre transplantasyon ortamı uygulayın. Transnazal transplantasyondan iki ay sonra, nakledilen hücrelerin sayısı, hem insana özgü hem de pan-mikroglial belirteçler için pozitif olan hücrelerin sayılmasıyla belirlenebilir. Endojen fare mikrogliası sadece pan-mikroglial belirteç için pozitiftir.
Kontrol farelerinde, hem kortekste hem de hipokampusta sadece fare mikrogliası tespit edildi. İPSMG nakledilen farelerin korteksinde sadece fare mikrogliası tespit edilirken, hipokampusta iPSMG tespit edildi. Bu protokolü denerken, sitokinlerin seyreltilmesini önlemek için süpernatantın tamamen çıkarılması esastır.
Nakledilen hücrelerin yaşayabilirliği için her 12 saatte bir sitokin uygulamak çok önemlidir. İPSMG'nin transplantasyonu için endojen fare mikrogliasının tükenmesi gereklidir. Bu prosedür, iPSMG'nin normal veya hastalıklı bir fare beynine nakledilmesine izin verir.
Böylece iPSMG'nin karakteristiği ve hastalığa yanıtı belirlenebilir. Bu teknik, fare beynindeki iPSMG'nin in vivo karakteristiğini belirlemek için uygundur. Bu nedenle, iPSMG'nin hastalık modeli farelere nakledilmesi, cevabı anlamamıza yardımcı olacak ve yeni bir terapötik hedefin yolunu açabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikrogliyaların (iPSMG), transnazal yol aracılığıyla immünokompetan farelerin beynine transplantasyonu için non-invaziv bir yöntem sunmaktadır. Protokol, iPSMG'lerin etkili entegrasyonunu sağlamak için sitokin uygulaması ve endojen mikrogliyaların delesyonundan yararlanarak, nörodejeneratif hastalıklar için terapötik yaklaşımların önünü açma potansiyeline sahiptir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kök Hücre Araştırmaları
- Mikroglial Biyoloji
Arka Plan
- İndüklenmiş pluripotent kök hücreler, fonksiyonel mikroglialara farklılaştırılabilir.
- Mikroglia disfonksiyonu, çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda yer almaktadır.
- Transnazal iletim, hücre transplantasyonu için yeni bir yaklaşım sunar.
- Sitozinlerin uygulanması, transplantasyon sonrası hücre canlılığı için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- İnvaziv olmayan mikroglial transplantasyon için bir yöntem geliştirmek.
- Normal beyin fonksiyonlarının sürdürülmesinde transnazal iletimin fizibilitesini değerlendirmek.
- Disfonksiyonel mikrogliaların yerini doldurmada iPSMG'nin potansiyelini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Birincil platform, immünokompetan farelerde iPSMG'nin transnazal transplantasyonunu içermektedir.
- Erkek farelere, nazal geçirgenliği artırmak için CSF1 reseptör antagonisti PLX5622 ve bir hiyalüronidaz solüsyonu ile ön işlem uygulanmıştır.
- Uygun entegrasyonu sağlamak amacıyla hücre süspansiyonları, belirlenen zaman çizelgeleri boyunca çoklu dozlarda uygulanmıştır.
- Transplantasyon sonrası izleme, nakledilen hücrelerin varlığının ve canlılığının değerlendirilmesini kapsamıştır.
Ana Sonuçlar
- Nakledilen iPSMG'ler, endojen mikroglialara zarar vermeden fare hipokampusuna başarıyla entegre edilmiştir.
- Sitokin uygulaması, nakil sonrası hücre canlılığının korunması için her 12 saatte bir kritik öneme sahipti.
- Bu yöntem, iPSMG yanıtlarının hem normal hem de hastalık modellerinde incelenmesine olanak tanır.
Sonuçlar
- Bu protokol, nörodejeneratif hastalıklar için gelecekteki gen tedavilerine ışık tutabilecek olan iPSMG'lerin in vivo çalışılmasını kolaylaştırmaktadır.
- Nakledilen mikrogliaların davranışının anlaşılması, beyin sağlığındaki rollerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.
- Bu yaklaşım, mikroglia ile ilişkili patolojilerin tedavisinde yeni terapötik hedefler için yollar açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
İnsan iPSC türevli mikrogliaların immünokompetan fare beyinlerine non-invaziv transplantasyonu, insan mikroglial fonksiyonlarının ve hastalık yanıtının doğrudan in vivo olarak incelenmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, kemirgen ve insan mikrogliaları arasındaki translasyonel boşlukları gidererek nörodejeneratif hastalık araştırmaları için daha öngörülebilir preklinik modelleri desteklemektedir. Protokol, erken keşif ve preklinik kırılma noktalarında hedef doğrulamasını ve mekanistik risk azaltmayı geliştirmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Memeli beyin ortamında insan mikroglial biyolojisinin in vivo sorgulanmasına olanak tanır.
- İnsan spesifik mikroglial yanıtları fare modellerinden ayırarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Nöroenflamasyon ve nörodejenerasyon yolları için fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- İnsan mikroglia entegrasyonu ve canlılığını in vivo değerlendirmek için valide edilmiş bir sistem sağlar.
- Spesifik belirteçler kullanarak transplant edilen mikrogliaların endojen mikroglialara karşı tekrarlanabilir şekilde kantifikasyonuna olanak tanır.
- Fizyolojik bir bağlamda insan mikroglia fonksiyonlarını hedefleyen bileşiklerin downstream taramasını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- İnsan mikrogliyasını fare beyinlerine dahil ederek preklinik modelleri insan hastalıklarının uygunluğu ile uyumlu hale getirir.
- Hem normal hem de hastalık model farelerde insan mikrogliya yanıtının değerlendirilmesine olanak tanır.
- Translasyonel biyobelirteç keşfi ve terapötik hipotez testleri için öngörü güvenilirliğini artırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu protokol, insan mikroglialarının in vivo fonksiyonel çalışmalarını mümkün kılarak erken keşif aşaması ile preklinik araştırmalar arasında bir köprü kurmakta, böylece aday belirleme sürecini ve translasyonel sürekliliği desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Beyin fizyolojisi ve patolojisindeki insan mikroglial rollerine ilişkin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Transplantasyon sonrası hücre entegrasyonu ve canlılığına dair kantitatif veriler sağlar.
- Analizler: Güçlü veri analizi için insan ve fare mikrogliaları arasında marker tabanlı ayrım yapılmasını sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık model farelerine iPSMG transplantasyonu yaparak hastalıkla ilgili modellemeleri kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hastalık bağlamında insan mikroglial fonksiyonlarını değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöroinflamasyon araştırmalarında öngörücü güveni artırır ve türe özgü belirsizlikleri azaltır.
- Operasyonel Değer: Çalışmalar arası tekrarlanabilirlik için non-invaziv hücre iletimi ve kantifikasyon iş akışlarını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: İnsanla ilgili veriler sağlayarak mikroglia hedefli terapötikler için daha iyi karar verme süreçlerini mümkün kılar.
- Portföy Etkisi: Model sadakatini artırarak nörodejeneratif hastalık programlarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- iPSC kültürü, mikroglial farklılaşma ve in vivo transplantasyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Endojen mikroglia tüketimi ve sitokin desteği için farmakolojik ajanlara erişim gereklidir.
- Hücre hazırlama, transplantasyon ve transplantasyon sonrası analizler için standartlaştırılmış protokoller gereklidir.
- Diğer model sistemlere adaptasyon, iletim ve tüketim parametrelerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Protokolde desteklendiği üzere, transplant edilen hücrelerin canlılığı için sürekli sitokin uygulaması kritiktir.
