Name: Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Öğrenin, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskobisinde örnek sahne eğimi kullanarak veri toplama yöntemini. Bu teknik, parçacık yönelim dağılımını artırarak EM harita kalitesini ve yorumlanabilirliğini önemli ölçüde iyileştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bill Anderson, Charles Bowman ve Jean-Christophe Ducom'a (TSRI) mikroskopi, Leginon kurulumları ve veri aktarım altyapısı ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Gordon Louie (Salk Enstitüsü) ve Yong Zi Tan'a (Singapur Ulusal Üniversitesi) el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Chris Russo'ya (MRC Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, Cambridge) DPS'nin ekspresyonu için bize plazmid sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (U54AI150472, U54 AI170855 ve R01AI136680'den DL'ye), Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF MCB-2048095'ten DL'ye), Hearst Vakıfları'ndan (DL'ye) ve Arthur ve Julie Woodrow Kürsüsü'nden (J. P. N.'ye) gelen hibelerle desteklenmiştir.

1. Numune hazırlama
<ol><li>Altın folyo ve altın ızgara desteği16 içeren ızgaralar kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) çünkü eğimli veri toplama ışın kaynaklı hareketivurgulayabilir 17. NOT: Bu çalışma için, ızgaralar üzerindeki örnekler, nemlendirilmiş (% 80'den fazla) soğuk bir odada (~ 4 ° C) manuel daldırma ve lekeleme tekniği18 kullanılarak vitrifiye edilmiştir.</li>
	<li>Kesinlikle gerekli olmadıkça bakır destek ve karbon folyo içeren ızgaraları veya sürekli bir amorf karbon tabakası kullanmaktan kaçının, çünkü bu ızgaralar numune aşaması eğildiğinde daha büyük ışın kaynaklı harekete yol açabilir16 . NOT: Grafen/grafen oksit gibi alternatif destek katmanlarının, amorf karbon 19,20'ye kıyasla ışın kaynaklı hareketi azalttığı görülmektedir.</li>
	<li>Izgaraları önceden elin ve kabul edilebilir buz kalınlığı ve parçacık dağılımı ile karakterize edilen bölgeleri belirleyin. Çok sıkı paketlenmiş parçacıklar içeren ızgaralar, eğimli veri toplama sırasında parçacık çakışmasına neden olur ve bu da aşağı akış veri işleme adımlarını etkileyebilir. NOT: Bu adımlar özneldir, çünkü buzun iyi alanlarını tanımlamak, parçacık kontrastının net olduğu bölgeler için bulanıklaştırılmış görüntüleri görsel olarak inceleyerek gerçekleştirilir. Bu, tüm numuneler için uygun olmayabilir, çünkü bazı örnekler ince buzlu alanlarda verimli bir şekilde dağılmaz ve veri toplama sırasında zorluklara yol açar (Tartışma bölümünde açıklanmıştır).</li>
	<li>Protein numunenizi içeren ızgaraları vitrifiye edin. Burada, gösterim amacıyla, Açlık Sırasında DNA Koruma (DPS) proteinini (bakınız Malzeme Tablosu) altın folyo ve altın destek ızgaraları ile 0.1-0.5 mg / mL aralığında kullanıyoruz. NOT: Protein daha önce tarif edildiği gibi saflaştırıldı, ancak TEV proteaz bölünmesi yapılmadı21. İlgilenilen bir numune için protein konsantrasyon aralığının ayrı ayrı optimize edilmesi gerekecektir, çünkü evrensel olarak uygulanabilir ve neredeyse kesinlikle farklı numuneler arasında değişecek ideal bir aralığı ölçmek zordur.</li>
</ol>2. Eğimli veri toplamayı ayarlama
<ol><li>Numunenin paralel aydınlatılmasını sağlamak ve koma anormalliklerini en aza indirmek için mikroskobu hizalayın22. NOT: Mikroskop, sahne eğimi olmadan standart SPA veri toplama için iyi hizalanmalıdır. Eğimli veri toplama için özel bir hizalama gerekmez, ancak iyi bir hizalama, hedefleme ve görüntülemenin sorunsuz bir şekilde ilerlemesini sağlar. Eğik ve eğik olmayan veri toplamayı karşılaştıran genel bir şema Şekil 2'de verilmiştir.</li>
	<li>Veri toplamaya uygun kareleri tanımlamak için sahne alanı eğimi olmayan bir ızgara atlası kaydedin veya Kare Alma Düğümü'nde kullanılan büyütmede kareleri manuel olarak inceleyin. Folyo sağlam olduğu, susuz görünmediği ve ideal buz kalınlığına sahip olduğu kareleri arayın. NOT: Kare Edinme Düğümü , Leginon'da çok ölçekli görüntüleme için kullanılan düşük büyütmeli düğümdür.<ol><li>Tipik eğilmemiş otomatik veri toplama için, genel ızgara kalitesine genel bir bakış ve veri toplama için uygun alanların ilk göstergesini sağlayan bir ızgara atlası kaydedin.</li>
		<li>Daha sonra, atlas aracılığıyla uygun kareleri seçin ve bunları kuyruğa gönderin. Ardından, manuel delik seçimi veya otomatik EM delik bulucu aracılığıyla, delik hedeflerini sıraya koyun ve gönderin.</li>
		<li>Son olarak, yüksek büyütmeli pozlama hedefleri göndermek için otomatik EM delik bulucuyu kullanın. NOT: Eğimli veri toplama için, özellikle optimum eğim açısı önceden belirlenmemişse ve veri toplama sırasında ayarlanması muhtemelse, tutarlı sonuçlar için karelerin manuel olarak sıraya alınması gerekebilir. Izgara atlası, veri toplama için kullanılan eğim açısı daha önce belirlenmişse, önceden tanımlanmış bir sahne alanı eğimi kullanılarak da kaydedilebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Örnek aşamasını ilgi çekici bir kareye taşıyın.</li>
	<li>15° sahne eğim±inde α yalpalayıcı kullanarak sahne konumu için ösentrik yüksekliği belirleyin. Mikroskop için tuş takımı panelini kullanarak sahneyi ötesentrik yüksekliğe getirmek için Z yüksekliğini ayarlayın. α yalpalama rutini sırasında görüntü kaymasının minimum düzeyde olduğundan emin olun. NOT: Ösentrik yükseklik doğru bir şekilde tanımlanmamışsa, sahne alanı kare büyütmede eğildiğinde büyük bir görüntü kayması gözlenecektir. Bu, ızgarada yerel deformasyonlar varsa, örneğin ızgara kırılmışsa veya görüntülenen alanın yakınında ciddi şekilde bükülmüşse de olabilir. Veri toplama için bu tür bölgelerden kaçınmak en iyisi olsa da, bunlar veri toplama için umut verici birkaç bölgeden birini temsil ediyorsa, ösentrik yüksekliği doğru bir şekilde tahmin etmek zorunludur. Şekil 3'te , ösentrik yüksekliği doğru bir şekilde tanımlamadan hedeflemenin kare büyütmede büyük görüntü kaymalarına nasıl neden olabileceği gösterilmektedir.</li>
	<li>Daha doğru bir Z yüksekliği bulun, Odaklayıcı düğümünü kullanın ve Simüle Et'e basın.<ol><li>Tipik olarak, Odaklayıcı düğümündeki Z yüksekliğini Kare Alma Düğümü'nde kullanılan büyütmede tahmin edin. NOT: Focuser düğümü odak dizisi, veri toplama sırasında Delik Toplama düğümünde (Leginon yazılımında bir araç) büyütme işleminde ince bir Z odak tahmini de içerebilir.</li>
		<li>Focuser düğümünün ayarlarını yapın ve karelerin ilk sıraya alınması sırasında ince Z netleme seçeneğini etkinleştirin/devre dışı bırakın. NOT: Otomatik veri toplama başladığında ösentrik yüksekliğin doğru bir şekilde tanımlandığından emin olmak önemlidir, bu da ince Z odağının yeniden etkinleştirilmesini gerektirebilir (adım 2.10).</li>
	</ol></li>
	<li>Gerçek ötesentrik yükseklikte veri toplamak için numune aşamasını istenen eğim açısına eğin ve gerekirse sahneyi yeniden ortalayın. Bu çalışmada 0°, 30° ve 60° eğim açıları kullanılmıştır. Delik Alma düğümü pozlamaları için hedefleri sıraya almaya başlamak üzere Kare Alma düğümünde Simüle Et düğmesine basın. NOT: Adım 2.2.1'de belirtildiği gibi, ızgara atlası önceden tanımlanmış bir sahne alanı eğimi kullanılarak kaydedilebilir, bu da bu adımda sahne alanını tekrar eğme ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu iyi çalışır ve veri toplama için kullanılan eğim açısı önceden tanımlanmışsa süreci hızlandırır. Mevcut protokol, kullanıcının veri toplama için farklı eğim açılarını test etmek isteyebileceği yeni örnekler göz önünde bulundurularak yazılmıştır.</li>
	<li>Bir Z odak hedefi ve yüksek büyütme oranına uygun deliklere sahip bölgeler seçin.</li>
	<li>Hedefleri görüntüleme kuyruğuna gönder'e basın. Tüm kareleri sıraya almayı bitirene kadar Sıraya Alınmış Hedefleri Gönder'e basmayın.</li>
	<li>Numune aşamasını eğilmemiş durumuna geri getirin. Bir sonraki kareye geçin ve yeterli sayıda delik pozlaması sıraya alınana kadar 2.3-2.8 arasındaki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Delik Hedefleme Düğümü'ne gidin ve tüm kareler sıraya alındıktan sonra Sıraya Alınmış Hedefleri Gönder'e basın. NOT: İnce Z odağı zaman kazanmak için daha önce devre dışı bırakıldıysa (adım 2.5), kuyruğu göndermeden önce yeniden etkinleştirilmesi gerekir.</li>
	<li>Otomatik EM delik bulucunun, numune aşaması eğildiğinde görüntü yakalama için uygun bölgeleri doğru bir şekilde tanımlayıp tanımlayamadığını test etmek için yüksek büyütmeli Pozlama Toplama düğümü tarafından seçilen hedefleri manuel olarak inceleyin.<ol><li>Bu prosedür sırasında, Maruz Kalma Alma düğümü ayarlarında 'Seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver' seçeneğini belirleyin. Kullanıcı hedefleme doğruluğundan memnun kaldığında, otomatik veri toplama için bu seçeneğin işaretini kaldırın. NOT: Yüksek büyütmeli Pozlama Toplama düğümündeki hedefler tipik olarak, hem eğimli hem de eğik olmayan veri toplama 23,24,25,26 için eşit derecede iyi çalışan bir ışın-eğme görüntü kaydırma stratejisi kullanılarak görüntülenir. Aşağı akış veri işleme adımlarında doğru CTF tahmini için, ışın eğimli görüntü kaydırma veri toplama stratejisi için lens-koma sapması kalibrasyonu gerçekleştirilmelidir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Veri İşleme
<ol><li>Kaydedilen filmlerin hareket düzeltmesi, CTF tahmini, parçacık seçimi ve veri toplama sırasında ilk rekonstrüksiyonların oluşturulması ile anında veri işlemeyi başlatın10,27,28,29. NOT: Bu çalışmada, ön işleme için cryoSPARC Live10 (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. Anında veri işleme, ilk kriyo-EM rekonstrüksiyonu ve açısal dağılım için bir yaklaşım sağlar, bu da kullanıcıyı çözünürlük anizotropisinin kapsamı hakkında bilgilendirebilir. Bunlar da, veri toplama için kullanılan eğim açısının yeterince yüksek olup olmadığı konusunda kullanıcıyı yönlendirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Yeniden yapılandırılmış haritayı görselleştirin ve tercih edilen parçacık oryantasyonlarının kapsamını ölçmek için Euler açı dağılımını çizin. NOT: Euler açı dağılımları, çözünürlük anizotropisinin potansiyel derecesini belirlemek için doğrudan Fourier uzay örnekleme dağılımlarına dönüştürülebilir. Euler açısı dağılımının kalitesini değerlendirmede ve optimum eğim açısı30,31'i belirlemede kullanıcıya yardımcı olmak için bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) geliştirilmiştir. Araç, Github deposundan https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui edinilebilir.</li>
	<li>Gerekirse, tercihli yönlendirmenin etkilerinin üstesinden gelmek için verilerin toplandığı sahne alanı eğim açısını ayarlayın. Harita ve 3.2'deki Euler dağılımı ile kanıtlandığı gibi, tercihli yönelim bir sorun olmaya devam ederse açı artırılabilir. Alternatif olarak, kullanıcı veri toplamayı gruplara ayırmak ve 20°, 30° ve 40° gibi birkaç farklı eğim açısı kullanarak kayıt yapmak isteyebilir. NOT: Çoğu TEM'in sahneyi 70°'ye eğme yeteneğine sahip olması gerekse de, yaygın örnek sahne eğimleri (kullandığımız) 20°-40° arasında değişmektedir.</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461(2013).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cheaper%3A+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li>
<li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li>
<li>Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+emerging+methodologies+in+Cryo-EM+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis.</a> Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+limitations+of+neutrons%2C+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257(2018).</li>
<li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li>
<li>NYSBC.org Homepage. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage">https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage</a> (2022).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%3A+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346, 1377-1380 (2014).</li>
<li>Russo, C. J., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+accumulation+in+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Charge accumulation in electron cryomicroscopy.</a> Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62765(2022).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoEM+at+100+keV%3A+a+demonstration+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li>
<li>Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerzik%2C+MA+%22cryoEM%3A+Methods+and+Protocols%22">cryoEM: Methods and Protocols</a>. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).</li>
<li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li>
<li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li>
<li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957(1957).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Structura Biotechnology Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022).</li>
<li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+processing+workflow+with+cryoSPARC%2C+RELION%2C+and+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).</li>
<li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li>
<li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li>
<li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAiyer%2C+S+%22cryoEM%3A+Methods+and+Protocols%22">cryoEM: Methods and Protocols</a>. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).</li>
<li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocus-dependent+Thon-ring+fading%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213(2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Numunenin hava-su arayüzüne yapışmasından kaynaklanan tercih edilen parçacık oryantasyonu, cryo-EM SPA 4,5,6 kullanılarak rutin yüksek çözünürlüklü yapı belirleme işleminin son büyük darboğazlarından biridir. Burada sunulan veri toplama şeması, bir veri kümesi içindeki parçacıkların oryantasyon dağılımını iyileştirmek için uygulanması kolay bir strateji sağlar. Protokolün ek ekipman veya yazılım gerektirmediğini ve veri toplama ...

Son on yılda doğrudan elektron dedektörlerinin ortaya çıkışı 1,2,3, tek parçacıklı kriyo-EM 4,5,6 kullanılarak çözülen makromoleküllerin ve makromoleküler montajların yüksek çözünürlüklü yapılarının sayısında üstel bir artışa neden olmuştur. Hemen hemen tüm saflaştırılmış makromoleküler türlerin, ~ 10 kDa boyutunda veya7'nin altındaki en küçük proteinler hariç, kriyo-EM kullanılarak yapı tayinine uygun olması beklenir. Izgara hazırlama ve yapı belirleme için gereken başlangıç malzemesi miktarı, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve X-ışını kristalografisi 4,5,6 gibi diğer yapı belirleme tekniklerinden en az bir büyüklük sırası daha azdır.
Bununla birlikte, kriyo-EM ile yapı tayini için temel bir zorluk, görüntüleme için uygun ızgara hazırlığını içerir. Farklı vitrifikasyon stratejileri ve ızgaraları kullanarak çeşitli numuneleri değerlendiren kapsamlı bir çalışma, kriyo-EM ızgaralarındaki numuneleri vitrifiye etmek için çoğu yaklaşımın, makromoleküllerin hava-su arayüzüne tercihli olarak yapışmasına yol açtığını göstermiştir8. Bu tür bir bağlılık potansiyel olarak dört optimal olmayan sonuca neden olabilir: (1) makromoleküler numune tamamen denatüre olur, bu durumda başarılı bir veri toplama ve işleme mümkün değildir; (2) numune kısmen denatüre olur, bu durumda makromolekülün zarar görmemiş bölgelerinden yapısal bilgiler elde etmek mümkün olabilir; (3) numune doğal yapıyı korur, ancak görüntülerde elektron ışınının yönüne göre sadece bir parçacık oryantasyonu seti temsil edilir; (4) numune doğal yapısını korur ve elektron ışınının yönüne göre olası parçacık oryantasyonlarının bazıları ancak hepsi değil, bazıları görüntülerde temsil edilir. (3) ve (4) numaralı durumlar için, eğik veri toplama, yeniden yapılandırılmış kriyo-EM haritasını etkileyen yönlü çözünürlüklü anizotropinin en aza indirilmesine yardımcı olacak ve çok çeşitli örnekler için genelleştirilebilir bir çözüm sağlayacaktır9. Teknik olarak, eğme aynı zamanda duruma da fayda sağlayabilir (2), çünkü denatürasyon muhtemelen hava-su arayüzünde meydana gelir ve benzer şekilde verilerde temsil edilen farklı yönelimlerin sayısını sınırlar. Veri kümesindeki oryantasyon yanlılığının kapsamı, çözüm katkı maddeleri ile deneyler yapılarak potansiyel olarak değiştirilebilir, ancak geniş uygulanabilirlik eksikliği bu deneme yanılma yaklaşımlarını engellemektedir. Numune aşamasının optimize edilmiş tek bir eğme açısında eğilmesi, görüntüleme deneyi9'un geometrisini değiştirerek oryantasyonların dağılımını iyileştirmek için yeterlidir (Şekil 1). Tercihli yönelimli numunenin elektron ışınına göre geometrik konfigürasyonu nedeniyle, tercihli yönelimlerin her kümesi için, ızgaranın eğilmesi, küme sentroidine göre bir aydınlatma açıları konisi oluşturur. Bu nedenle, bu görüşleri yayar ve sonuç olarak Fourier uzay örneklemesini ve yönlü çözünürlüğün izotropisini geliştirir.
Pratikte, sahneyi eğmenin bazı zararları vardır. Numune aşamasının eğilmesi, görüş alanı boyunca kontrast aktarım işlevi (CTF) tahminlerinin doğruluğunu etkileyebilecek bir odak gradyanı oluşturur. Eğik veri toplama, eğik örnekleri görüntülerken artan şarj efektlerinin neden olduğu ışın kaynaklı parçacık hareketinin artmasına da neden olabilir. Izgara eğimi ayrıca görünür buz kalınlığında bir artışa yol açar, bu da daha gürültülü mikrograflara yol açar ve sonuçta rekonstrüksiyonların çözünürlüğünü etkileyebilir 5,9,10. Protokol ve tartışma bölümlerinde kısaca açıklanan gelişmiş hesaplamalı veri işleme şemalarını uygulayarak bu sorunların üstesinden gelmek mümkün olabilir. Son olarak, eğme, parçacık üst üste binmesinin artmasına neden olabilir ve sonraki görüntü işleme boru hattını engelleyebilir. Bu, şebeke üzerindeki parçacık konsantrasyonunu optimize ederek bir dereceye kadar azaltılabilse de, yine de önemli bir husustur. Burada, Leginon yazılım paketi (otomatik bir görüntü alma yazılımı), mevcut açık erişim ve çok çeşitli mikroskoplarla uyumlu11,12,13,14 kullanılarak eğimli veri toplama için uygulanması kolay bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, en az sürüm 3.0 veya üstünü gerektirir ve 3.3'ten sonraki sürümler, eğimli veri toplamayı etkinleştirmek için özel iyileştirmeler içerir. Bu protokol için ek bir yazılım veya ekipman gerekmez. Hesaplama altyapısı ve kurulum kılavuzları hakkında kapsamlı talimatlar başka bir yerde verilmiştir15.

<table><tbody><tr><td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td><td>Structura Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPS protein</td><td></td><td></td><td>Saflaştırması, K.Naydenova ve ark. IUCrJ'de açıklanan protokolden uyarlanmıştır. 2019 Kasım 1; 6(Pt 6): 1086&ndash;1098.</td></tr><tr><td>K2 Zirvesi Doğrudan Elektron Dedektörü</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leginon yazılım paketi</td><td></td><td></td><td>C Suloway ve diğerleri Yapısal Biyoloji Dergisi 151 (1): s. 41-60.</td></tr><tr><td>Manuel dalma cihazı</td><td></td><td></td><td>EM ızgaralarının vitrifikasyonu için ev yapımı giyotin benzeri cihaz</td></tr><tr><td>Talos Arctica</td><td>FEI/Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 gözenekli ızgaralar</td><td>Quantifoil</td><td>N1-A14nAu30-01</td><td></td></tr></tbody></table>

leginon kullanarak stage tilt ile tek parçacıklı cryo-em veri toplama

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Kriyo-elektron mikroskobu (cryo-EM) ile tek parçacık analizi (SPA) artık yüksek çözünürlüklü yapısal biyoloji için ana akım bir tekniktir. SPA ile yapı belirleme, ince bir buz tabakası içinde vitrifiye edilmiş bir makromoleküler nesnenin birden fazla farklı görünümünü elde etmeye dayanır. İdeal olarak, eşit olarak dağılmış rastgele projeksiyon yönelimlerinin bir koleksiyonu, nesnenin tüm olası görünümlerine karşılık gelir ve izotropik yönlü çözünürlük ile karakterize edilen rekonstrüksiyonlara yol açar. Bununla birlikte, gerçekte, birçok örnek, hava-su arayüzüne yapışan tercihli olarak yönlendirilmiş parçacıklardan muzdariptir. Bu, veri kümesinde düzgün olmayan açısal yönelim dağılımlarına ve rekonstrüksiyonda homojen olmayan Fourier uzayı örneklemesine yol açarak, anizotropik çözünürlük ile karakterize edilen haritalara çevrilir. Numune aşamasının eğilmesi, oryantasyon dağılımlarının homojenliğini ve dolayısıyla Fourier uzay örneklemesinin izotropisini geliştirerek çözünürlük anizotropisinin üstesinden gelmek için genelleştirilebilir bir çözüm sağlar. Mevcut protokol, otomatik görüntü toplama için bir yazılım olan Leginon'u kullanarak eğimli aşamalı bir otomatik veri toplama stratejisini açıklamaktadır. Prosedürün uygulanması basittir, herhangi bir ek ekipman veya yazılım gerektirmez ve biyolojik makromolekülleri görüntülemek için kullanılan çoğu standart iletim elektron mikroskobu (TEM) ile uyumludur.

0.3 mg/mL'de DPS, 0°, 30° ve 60° eğimlerde görüntülemeyi göstermek için kullanıldı. Farklı eğim açılarından elde edilen veriler, farklı ızgara bölgelerinde aynı ızgarada toplanmıştır. CTF çözünürlüğü, bu çalışmada üç veri kümesini karşılaştırırken olduğu gibi, daha yüksek açılı eğimlere uyar ve daha zayıf olma eğilimindedir. Şekil 4 , karşılaştırmalı temsili görüntüleri ve 2B sınıflandırma ortalamalarını göstermektedir. Protein konsantrasyonu farklı eğim açıları boyunca değişmemiş olsa da, d...

Mevcut protokol, kriyo-EM deneylerinde eğimli tek parçacıklı veri toplama için genelleştirilmiş ve uygulanması kolay bir şemayı açıklamaktadır. Böyle bir prosedür, hava-su arayüzüne bağlılık nedeniyle tercihli oryantasyon yanlılığından muzdarip numuneler için yüksek kaliteli bir EM haritası elde etmek için özellikle yararlıdır.

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Numune aşamasının eğilmesi, tek parçacıklı kriyo-EM veri toplama sırasında parçacıkların oryantasyon dağılımını arttırmanın basit ve genelleştirilebilir bir yolunu sağlar. Numune aşamasının eğilmesi nedeniyle elde edilen parçacıkların eşit dağılımı, genel harita kalitesinin ve yorumlanabilirliğinin iyileştirilmesini sağlar. Numunenin paralel aydınlatılmasını sağlamak ve koma anormalliklerini en aza indirmek için mikroskobu hizalayarak başlayın.Veri toplamaya uygun kareleri belirlemek için, genel ızgara kalitesine genel bir bakış ve veri toplama için uygun alanların ilk göstergesini sağlayan sahne alanı eğimi olmadan veya sahne alanı eğimi ile bir ızgara atlası kaydedin. Kare toplama düğümünde kullanılan büyütmede kareleri manuel olarak inceleyin. Folyo bozulmamış, susuz görünmediği ve ideal buz kalınlığına sahip olduğu kareleri arayın ve numune aşamasını ilgi çekici bir kareye taşıyın.Yaklaşık 15 derecelik sahne eğiminde bir alfa yalpalayıcı kullanarak sahne konumu için ösentrik yüksekliği belirleyin ve mikroskop için tuş takımı panelini kullanarak sahneyi ösentrik yüksekliğe getirmek için Z yüksekliğini ayarlayın. Alfa yalpalama rutini sırasında görüntü kaymasının minimum düzeyde olduğundan emin olun. Daha doğru bir Z yüksekliği bulmak için, kare toplama düğümünde kullanılan büyütmedeki odak düğümünde tahmin edin.Netleme düğümü için ayarları yapın ve karelerin ilk sıraya alınması sırasında ince Z netleme seçeneğini etkinleştirin veya devre dışı bırakın. Ardından Simüle Et'e basın. Gerçek ösentrik yükseklikte veri toplamak için numune aşamasını istenen eğim açısına eğin ve gerekirse sahneyi yeniden ortalayın.Tüm edinme düğümü pozlamaları için hedefleri sıraya almaya başlamak üzere kare alma düğümünde simüle et düğmesine basın. Ardından, bir Z odak hedefi ve yüksek büyütme pozlamaları için uygun deliklere sahip bölgeler seçin ve hedefleri görüntüleme için kuyruğa gönderin. Örnek aşamasını eğilmemiş durumuna geri getirin ve ardından bir sonraki kareye geçin.Yeterli sayıda tam pozlama sıraya alınana kadar bu adımları tekrarlayın. Tüm kareler sıraya alındıktan sonra, tüm hedefleme düğümüne gidin ve Sıraya Alınmış Hedefleri Gönder'e basın. Düğüm ayarlarında seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver'i seçin ve otomatik EM delik bulucunun numune aşaması eğildiğinde görüntü alımı için uygun bölgeleri doğru bir şekilde tanımlayıp tanımlayamadığını test etmek için yüksek büyütmeli pozlama toplama düğümü tarafından seçilen hedefleri manuel olarak inceleyin.Kullanıcı hedefleme doğruluğundan memnun kaldıktan sonra, otomatik veri toplama için Seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver seçeneğinin işaretini kaldırın. Izgaranın ösentrik Z yüksekliğine yakın ve uzak toplanan farklı eğim açılarına sahip kare büyütmedeki temsili görüntüleri burada gösterilmektedir. Kirişin merkezi, kırmızı eşmerkezli halkaların merkezi ile gösterilir ve yeşil ok, ilgilenilen kareyi gösterir.Referans için ilgi karesine bitişik kırık bir ızgara özelliği vardır. Burada, 0 derece, 30 derece ve 60 derece eğim açılarında toplanan temsili delik pozlamaları ve 2B sınıf ortalamaları gösterilmektedir. Protein konsantrasyonu farklı eğim açıları boyunca değişmemiş olsa da, daha yüksek bir eğim açısı, görüntülenen alanın parçacık konsantrasyonu açısından daha kalabalık görünmesini sağlar.Aşırı kalabalıktan etkilenen 2B sınıf ortalamaları bu kırmızı kutuda gösterilir. Protokolün basitliği, mikroskobun herhangi bir standart kullanıcısının eğimli bir veri toplama stratejisini kolayca uyarlamasını sağlar.

single-particle-cryo-em-data-collection-with-stage-tilt-using-leginon

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yerli yakın eyalette bakteri hücrelerinin ultrastrüktür çalışma elektron cryotomography (EKT) nasıl kullanılacağı "makromoleküler" (~ 4 nm) çözünürlük, burada göstermektedir.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Burada sunulan protokol, sıvı kriyojende vitrifikasyondan önce en az 90 ms karıştırılan kendi kendine fitillenen nanotel ızgaraya iki ilgi örneği sunmak için yeni bir robotik sistem olan Spotiton'un kullanımını açıklamaktadır.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

Bu protokol, kriyo yapısına sahip aydınlatma mikroskopisi kullanılarak biyolojik kriyo ile korunmuş örneklerin nasıl görüntülenerek görüntülenlerin ortaya koyduğunu göstermektedir. U2OS hücrelerinin sitoskeletonlarını görüntüleyerek metodolojiyi gösteriyoruz.

Kriyojenik Olarak Korunmuş Hücrelerden Kriyo-Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobik Veri Toplama

Kriyojenik elektron tomografisinde büyük ölçekli veri toplama için artan talep, yüksek verimli görüntü alma rutinleri gerektirir. Burada açıklanan, tomografik veri toplamanın zaman verimliliğini ve verimini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan gelişmiş satın alma stratejilerinin son gelişmelerini uygulayan bir protokoldür.

Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi ve kullanıcı dostu bir işlem hattı gerektirir. Burada, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküllerin veri toplanması için tam otomatik görüntü alma yazılım paketi, Latitude-S ve pratik bir boru hattı uygulamasını sunuyoruz.

Tek parçacıklı Cryo-elektron Mikroskopisi için Kullanıcı Dostu, Yüksek Verimli ve Tam Otomatik Veri Toplama Yazılımı

Makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM haritaları da 200 kV TEM mikroskopları kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, 200 kV TEM kullanarak yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin başarılı bir şekilde toplanması için gerekli olan doğru optik hizalamaları, veri toplama şemalarını ve görüntüleme alanlarının seçimini ayarlamak için en iyi uygulamaları gösterir.

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Kriyo-elektron mikroskobu (cryoEM) çoklu ızgara taraması genellikle saatlerce dikkat gerektiren sıkıcı bir süreçtir. Bu protokol, bu işlemi otomatikleştirmek için standart bir Leginon koleksiyonunun ve Smart Leginon Autoscreen'in nasıl kurulacağını gösterir. Bu protokol, cryoEM delikli folyo ızgaralarının çoğuna uygulanabilir.

Smart Leginon Kullanarak Birden Fazla Şebekede Kriyo-Elektron Mikroskobu Tarama Otomasyonu

Bu protokol, kalın dokular için kriyo-elektron tomografisini (kriyo-ET) standartlaştırır; yüksek basınçlı dondurma (HPF) ile waffle yöntemi, kriyojenik odaklı ion ışını (kriyo-FIB) kaldırma ve doz-simetrik, paralel alım ile entegre edilir; böylece fare hipokampusunda tekrarlanabilir in situ analizi için uniform ince lameller ve vitrifikasyon örnekler elde edilir.

Fare Hipokampusunda Kalın Dokular İçin Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışı Gösterildi

Öğrenin, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskobisinde örnek sahne eğimi kullanarak veri toplama yöntemini. Bu teknik, parçacık yönelim dağılımını artırarak EM harita kalitesini ve yorumlanabilirliğini önemli ölçüde iyileştirir.

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Daha fazla video keşfet