Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Capture Hi-C, ilgilenilen megabaz boyutundaki genomik bölgenin 3D kromatin organizasyonunun yüksek çözünürlükte deşifre edilmesini sağlar. Capture Hi-C ile daha yüksek çözünürlük ve alel özgüllüğü elde edilirken, tekniğin zaman etkinliği ve satın alınabilirliği artırılır. Capture IC'nin sağlık ve patolojik koşullarda farklı model sistemine, hücre tiplerine ve gelişimsel olarak düzenlenmiş kromatin manzaralarına uygulanmasının, genom topolojisi ile gen düzenlemesi arasındaki etkileşimi anlamamızı kolaylaştırması muhtemeldir.

Başlamak için, otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayımı için özel olarak hazırlanan kontrol plakasından hücreleri triptonize edin ve sayın. Canlı hücrelerin yüzdesini belirlemek için canlılık boyamayı dahil edin. Bu hücre sayısından, çapraz bağlama için hazırlanan plakadaki toplam hücre sayısını tahmin edin.

Kültür ortamını çapraz bağlama için hazırlanan plakalardan çıkarın ve sabitleme çözeltisi ile değiştirin. Bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe karıştırarak oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. 0.125 azı dişinin nihai konsantrasyonuna 2.5 molar glisin PBS ekleyerek sabit reaksiyonu söndürün.

10 santimetrelik bir plakada 10 mililitreye 530 mikrolitre 2.5 molar glisin PBS ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin, bir çalkalayıcıda yavaşça karıştırın. Plakaları buza aktarın ve bir çalkalayıcıda hafifçe karıştırırken buz üzerinde 15 dakika daha inkübe edin.

Hızlı kullanım sağlamak için fiksasyon çözeltisini bir beher içine dökerek hücrelerden çıkarın. Kalıntıları ve ölü hücreleri temizlemek için 10 santimetrelik plakayı beş mililitre soğuk 0.125 molar glisin PBS ile iki kez hızlı bir şekilde durulayın. Hızlı kullanım sağlamak için sıvıyı bir beher içine dökerek plakadan çıkarın.

10 santimetrelik plakaya beş mililitre soğuk 0.125 molar glisin PBS ekleyin. Ve plastik bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri plakadan hızla kazıyın. Hücre süspansiyonunu, serolojik bir pipet kullanarak önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın.

Plakayı beş mililitre soğuk 0.125 molar glisin PBS ile iki kez durulayın ve hücre süspansiyonunu konik santrifüj tüpüne ekleyin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 480 G'de aşağı doğru döndürün. Bir tezgah üstü aspirasyon sistemi ile aspire ederek süpernatantı çıkarın.

Hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini hesaplanan 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpüne alın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 480 kez G'de döndürün ve kuru hücre peletlerini 80 santigrat derecede saklayın. Hücre lizisi için, donmuş topakları buz üzerinde çözün.

Suda 1.5 mililitre lizis tamponu hazırlayın. Soğuk lizis tamponundan 600 mikrolitre ekleyin ve buz üzerinde iyice askıya alın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2.655 G'de aşağı doğru döndürün ve bir tezgah üstü aspirasyon sistemi kullanarak süpernatantı çıkarın.

% 0.5 SDS'lik 100 mikrolitrede yeniden askıya alın. 10 dakika boyunca 1400 RPM'de dönen 62 santigrat derecede inkübasyondan sonra, 290 mikrolitre su artı% 10 Triton X 100'den 50 mikrolitre ekleyin ve hava kabarcıklarından kaçınarak iyice karıştırın. 50 mikrolitre 10 X DPN tüp tamponu eklemeden önce 10 dakika boyunca 1400 RPM'de dönerek 37 santigrat derecede inkübe edin ve tüpü karıştırmak için ters çevirin.

Kalite kontrol için 50 mikrolitre sindirilmemiş DNA'yı ayrı bir tüpe alın. Sindirilmemiş kontrol örneğini almayı unutmayın. DPN2 sindirimi için, 10 mikrolitre DPN2 yüksek konsantrasyon ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.

Numuneleri ve sindirilmemiş kontrolü 37 santigrat derecede bir termal karıştırıcıda inkübe edin, dört saatten fazla bir süre boyunca dakikada 1400 dönüşte döner. Çapraz bağlamanın bağlanması ve tersine çevrilmesi için, ayrı bir tüpte kalite kontrolü için bağlanmış sindirilmiş DNA'nın 50 mikrolitresini alın. Sindirilmemiş ve bağlanmamış kontrolleri 20 santigrat derecede saklayın.

800 mikrolitre ligasyon kokteyli ekleyin. 16 santigrat derecede inkübe edin, gece boyunca dakikada 1000 dönüşte dönün. DNA saflaştırması için, numuneleri buz üzerinde önceden soğutulmuş 15 mililitre konik santrifüj tüplerine aktarın ve iki mililitre su, 10.5 mililitre buz gibi etanol ve 583 mikrolitre üç molar sodyum asetat ekleyin.

Sindirilmemiş ve bağlanmış kalite kontrollerine 200 mikrolitre buz gibi etanol, 10.8 mikrolitre sodyum asetat ve bir mikrolitre kopresipitant ekleyin. Eksi 80 santigrat derecede, gece boyunca en az dört saat boyunca inkübe edin. 15 mililitrelik tüpleri 45 dakika boyunca dört santigrat derecede 2200 G'de döndürün.

Etanol ve havayı dikkatlice çıkarın, numuneleri ve kontrolleri oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kurutun. Aşırı kurutmayın. Numuneleri ve kontrolleri sırasıyla 100 mikrolitre ve 20 mikrolitre suda tekrar askıya alın.

3C şablon hazırlamanın kalite kontrolü için, her numunenin 100 ila 200 nanogramını ve her kontrolü% 1'lik bir agros 1XTBE jel üzerine yükleyin. Daha sonra, ayrıştırılmış uç multipleks dizilimi için hedef zenginleştirme gerçekleştirmek için, dört mikrogram 3C şablonu alın, her yakalama reaksiyonu için 130 mikrolitre suda yeniden askıya alın. Numuneyi sonikleştirin ve kesilen DNA'nın üç mikrogramı ile hazırlığa devam edin.

Hazırlanan DNA örneklerini hedefe özgü RNA problarına hibritleştirmek için, 3.4 mikrolitrelik son hacimde 750 nanogram DNA örneği kullanın, bu da mikrolitre başına 221 nanogramlık bir başlangıç konsantrasyonu ile sonuçlanır. 3.4 mikrolitrelik nihai hacme ulaşmak için gerekirse hızlı vakum konsantrasyonu kullanın. 10 mikrolitrede askıya alınan numuneler için 15 ila 20 dakikalık konsantrasyon yeterlidir.

Hibridizasyon karışımını, üreticinin talimatlarına göre, 105 santigrat derecede ısıtılmış bir kapakla 65 santigrat derecede 16 ila 18 saat boyunca inkübe edin. Hedeflenen ligasyon parçalarını yakalamak için, prob hibridize numunesine bağlı boncuklar halinde streptivid ekleyin. Son olarak, örnekleri multipleks dizileme için hazırlamak için, eşleştirilmiş ve çoklanmış dizileme için bu çalışmada kullanılan hedef zenginleştirme sistemine göre protokolü devam ettirin.

Capture Hi-C etkileşim haritasının çözünürlüğü, Tsix lokusunun destekleyicisini içeren Tsix-bit'te iki küçük etki alanının tanımlanmasına olanak tanır. Bu daha önce 5C ile elde edilemedi. Dahası, temas döngüleri gibi diğer alt-bit yapıları, daha önce Capture C ile tanımlanan Xist ve FTX arasındaki döngü ve yakın zamanda Capture Hi-C için benzer bir protokol kullanılarak tanımlanan Xist ve Xert arasındaki döngü gibi Capture Hi-C verilerinden açıkça görülebilir.

Linx, Chic1 ve Xite lokusları arasındaki Tsix-bit içindeki bilinen temas noktalarını oluşturanlar gibi Capture Hi-C profillerinin artan çözünürlüğü nedeniyle diğer kontaklar da daha hassas bir şekilde eşlenebilir. Gösterilen Hi-C verileriyle karşılaştırıldığında, Capture Hi-C çözünürlükte dört kat artışa izin verdi, ancak sıralama derinliğinin yalnızca dörtte birini gerektiriyordu. 3C şablon hazırlığı için kalite kontrol olarak 50 mikrolitre sindirilmemiş ve bağlanmamış DNA örneği almayı unutmamak çok önemlidir.