Eklem hastalıklarını modellemek ve ilaçları test etmek için çip üzerinde diz eklemi oluşturulması

İnsan diz eklemindeki kıkırdak, kemik, yağ yastığı ve sinovyumu özetlemek için kullanılan insan mezenkimal kök hücrelerinden dört tip doku üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu dört doku özelleştirilmiş bir biyoreaktöre entegre edilir ve mikroakışkanlar yoluyla bağlanır, böylece çip üzerinde bir diz eklemi oluşturur.

Klinik çalışmalar sırasında insanların ilaçlara nasıl tepki verdiğini doğru bir şekilde tahmin etme yeteneğimiz, fizyolojik olarak ilgili klinik öncesi modellerin eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Bu mikrofizyolojik sistem bu eşitsizliği ele alabilir. Bu insan hücresinden türetilmiş sistem, insan dizindeki osteoartritin tüm eklem hastalığı doğasını doğru bir şekilde taklit eder, bu da klinik çalışmalardan önce hastalık modifiye edici osteoartrit ilaçlarının test edilmesine izin verir ve potansiyel olarak milyonlarca dolar tasarruf sağlar.

500 mililitre damıtılmış suya 17 gram jelatin tip B ekleyerek metakrillenmiş jelatin veya GelMA hazırlamaya başlayın. 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda 30 dakika karıştırın ve bir çalkalayıcıda gece boyunca karıştırmadan önce 13 mililitre metakrilik anhidrit ekleyin. Ertesi gün, diyaliz torbalarına yaklaşık 60 mililitre GelMA alikotu hazırlayın.

Tüm diyaliz torbalarını yedi gün boyunca bir karıştırma çubuğu ile damıtılmış suya koyun. Suyu günde birkaç kez değiştirin ve torbaları gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Yedinci günde, GelMA'yı bir tabağa dökün ve liyofilizasyondan önce eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Daha sonra, GelMA'yı bir liyofilizatörün vakum odasına yerleştirerek liyofilize edin. Liyofilizatörden çıkarmadan önce tamamen kuruduğundan emin olun. Daha sonra, liyofilize GelMA'yı Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde% 15 konsantrasyonda çözün ve az miktarda sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.

Elde edilen hacme bağlı olarak, çözeltiyi antibiyotik antimikotik ve% 0.15 lityum fenil fosfinat veya LAP ile destekleyin. GelMA çözeltisini ışıktan koruyun ve sonraki kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Otoklav 3D baskılı çift akışlı biyoreaktör odaları, kapakları ve ekleri, buharla 20 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklav torbalarında.

Ve sonra, kuru ısı ile 20 dakika boyunca. Sterilizasyondan sonra, biyoreaktör odalarını, kapaklarını ve uçlarını biyogüvenlik kabininin içinde bir gecede 15 mililitre steril PBS'ye batırın ve ardından tamamen kurutun. 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak,% 15'lik bir GelMA çözeltisinde mililitre hücre başına altıncı insan kemik iliği türevi mezenkimal kök hücrelere veya MSC'lere 20 kez 10 kez yeniden askıya alın.

Ardından, steril eldivenler kullanarak steril, kuru bir silikon kalıbı bir Petri kabına bastırın. Silikon kalıbın her deliğine, kesici ucun delik tarafı aşağı bakacak şekilde forseps olacak şekilde bir uç yerleştirin. İşiniz bittiğinde, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak kesici uç başına yaklaşık 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Üst kısmı 1,5 dakika boyunca 395 nanometre dalga boyunda bir UV el fenerine maruz bırakarak kesici ucun içindeki jeli çapraz bağlayın, ardından diğer tarafı 30 saniye boyunca aydınlatın. Steril forsepslerle, ekleri derhal doku kültürü olmayan altı kuyucuklu bir plakada sekiz mililitre büyüme ortamına aktarın ve hücrelerin bir gecede iyileşmesine izin verin. Yağ dokusunun farklılaşmasını başlatmak için, ekleri sekiz mililitre adipojenik ortama aktarın ve günlük ortam değişimi ile 28 gün boyunca kültürleyin.

Osteokondral üniteleri tasarlamak için, ekleri çift akışlı biyoreaktör odalarına yerleştirin, kuyucukları kapatın ve iki akışı, 35 mililitre osteojenik ortam ve 35 mililitre kondrojenik ortam ile dakikada beş mikrolitrelik bir akış hızında ayrı ayrı demleyin. İlgili ortam tipleriyle iki haftada bir şırınga değişiklikleri yaparak hücreleri 28 gün boyunca farklılaşma için koruyun. Fibroblastları türetmek için, 21 gün boyunca 20 mililitre fibrojenik ortam içeren bir T 150 santimetrekarelik doku hücresi kültürü şişesinde 2D kültürdeki MSC'leri ayırt edin.

Ortamın haftalık değişimini koruyun. 21 gün sonra, hücreleri ayırmak için dört mililitre tripsin kullanın. 3D jelleri kesici uçların içinde kapsülleyin.

Sinovyal benzeri fibröz doku veya SFT elde etmek için benzer bir protokol izleyin. 0,062 inç iç çapa ve 0,125 inç dış çapa sahip silikon boruyu bir uçtaki minijoint biyoreaktör çubuğuna ve diğer uçtaki F 1/16th cazibe kilidi konektörlerine bağlayın. Ardından, 3D mini eklem biyoreaktörlerini silikon boru ve kapaklarla birlikte otoklavlayın.

Mini eklem kültürü için kullanılmak üzere 35 mililitre ortamı hazırlayın ve orta rezervuarlara yükleyin. Osteokondral üniteleri çift akışlı biyoreaktörden mini eklem biyoreaktörünün sağ kuyusuna aktarmak için düz forseps kullanın. Tüm kuyucukları sterilize edilmiş kapaklarla kaplamadan önce yağ dokusu ekini ve fibröz doku ekini sırasıyla sol ve orta kuyucuklara aktarın.

Mini eklem klipsi girişlerini orta haznelere ve çıkışları şırıngalara bağlayın. Ardından, şırıngaları bir şırınga pompasına monte edin. Pompayı ve talaşları bir inkübatöre aktarın.

Orta rezervuarları inkübatörün dışındaki buza yerleştirin. Pompayı geri çekme modunda çalıştırın ve ortamı orta hazneden mini eklem biyoreaktör odasına çekin. Bu mini eklem kültürü sürecine 28 gün boyunca devam edin.

Eklem iltihabını ve kıkırdak dejenerasyonunu modellemek için, yedi gün boyunca mililitre başına 10 nanogramda fibrojenik ortam suşuna interlökin bir beta ekleyin. Fibrojenik ortama taze interlökin bir beta sağlamadan önce şırıngayı üçüncü günde değiştirdiğinizden emin olun. İlaç testi için, üç günlük interlökin bir beta tedavisinden sonra, ilacı ya paylaşılan ortamda, eklem içi bir uygulamayı simüle ederek ya da sistemik bir uygulamayı simüle ederek tüm orta tiplerde uygulayın.

Yedi günlük interlökin bir beta tedavisinden sonra, analiz için bireysel dokuları toplayın. Steril forseps kullanarak uçları çıkardıktan sonra, jeli çıkarmak ve jeli PBS'ye yerleştirmek için kesici ucun ortasından bir biyopsi zımbasını itin. Daha sonra, gen ekspresyonunu değerlendirirken osteokondral jelleri ikiye bölün.

Her bir ortam kaynağından yaklaşık 1,5 mililitre ortamı 14.000 G'de 10 dakika boyunca toplayın ve santrifüj edin. Tortuyu attıktan sonra, şartlandırılmış ortamı sıvı azot içinde dondurun. Histolojik boyama ve immün boyama için, ilk olarak, osteokondral ve sinovyal benzeri fibröz dokuyu veya SFT numunelerini% 10 tamponlu formaline sabitleyin ve bunları artan konsantrasyonlardaki etanolde dehidrate edin.

Numuneyi ksilen içinde temizleyin, parafine gömün ve son olarak numuneleri altı mikrometre kalınlığa bölün. Yağ dokusu durumunda,% 10 tamponlanmış resmi ve sabit numuneleri doğrudan, yağ kırmızısı O çözeltisi veya BODIPY ile boyayın. Dokuya özgü fenotipler, bireysel mikro dokular için iyi korunmuştur.

Mini eklemin tüm dokuları, 28 günlük kültürü takiben fenotiplerini analiz etmek için toplandı. Osteokondral ünitelerin mikro dokularının kemikli bileşeni yüksek düzeyde osteokalsin eksprese etti. Osteokondralın kıkırdak kısmında, dokular önemli ölçüde yüksek seviyelerde kollajen tip iki ve agrekan eksprese etti.

Temsili adipojenik genlerin, adiponektin ve leptinin ekspresyon seviyeleri yağ dokusunda daha yüksekti. Kalsiyum mineralleri, alkalen fosfataz ve osteokalsin proteininin birikimi öncelikle osteokondral mikro dokuların kemik boyutunda görülmüştür. Osteokondral dokuların kıkırdak tarafında iyi korunmuş glikozaminoglikan ve kollajen tip iki görüldü.

Kondrosit hipertrofisi ile ilişkili belirteçlerin, kollajen tip 10 ve Hint kirpi ekspresyonu, 28 günlük kültürden sonra önemli ölçüde düşük regüle edildi. Yağ dokusunda bol miktarda lipid damlacığı birikimi bulundu. İmmünofloresan boyama, dört haftalık kültürden sonra SFT tarafından sağlam yağlayıcı ve kadherin 11 ekspresyonu gösterdi.

Bir hastalık modelinde, IL bir beta tedavisi, SFT'de hücre apoptozu ve yüksek MMP-13 seviyeleri ile sonuçlandı. Kıkırdak yıkımı IL bir beta ile tedavi edildi, bu da osteokondral dokular ve SFT arasında çapraz konuşma olduğunu düşündürdü. Naproksenin sistemik uygulama yoluyla terapötik etkinliği, IL bir beta minijoint'te kıkırdak degradasyonunun azaldığını göstermiştir.

Gerçek zamanlı PCR, osteoartrit ilaçlarını modifiye eden dört potansiyel hastalığın kıkırdak kaybını kısmen tersine çevirdiğini göstermiştir. Bu prosedürün en önemli adımları, kesici uçlardaki jellerin çapraz bağlanmasını ve biyoreaktöre kesici uç yerleştirilmesini içerir. Çip, obezite ve mekanik yaralanma gibi osteoartritte sunulan diğer risk faktörlerinin katkısının araştırılmasına izin verir.

Diğer eklem hastalıklarını incelemek için de kullanılabilir.