Name: Primer ve Kültürlü Hücrelerden Sitoplazmik ve Nükleer Uzun RNAların Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Öğrenin, hücre biyolojisinde sitoplazmik ve nükleer RNA izolasyonunu qPCR ile doğrulanmış maliyet etkin bir yöntemle. Bu protokol, kanser gelişimi araştırmalarında intraselüler etkileşimleri anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Amerikan Hematoloji Derneği, Robert Wood Johnson Vakfı, Doris Duke Hayırsever Vakfı, Edward P. Evans Vakfı ve Ulusal Kanser Enstitüsü'nün (1K08CA230319) bağışlarıyla desteklenmektedir.

Bu çalışmada K562 hücreleri kullanılmıştır. Bu protokol 1 x 106-5 x 106 milyon hücre için çalışacak şekilde optimize edilmiştir. Bununla birlikte, prosedür, hacimleri uygun şekilde artırarak daha büyük hücre miktarları için ölçeklendirilebilir.
1. 0.25x lizis tamponunun hazırlanması
<ol><li>Tablo 1A'da verilen aşağıdaki bileşenleri karıştırarak 0,25x lizis tamponu hazırlayın. NOT: Numuneler yaklaşık 300 μL 0,25x lizis tamponu gerektirir. Önerilen hacim = numune sayısı x 300 μL.</li>
</ol>2. Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların ayrılması
<ol><li>1,5 mL tüpler kullanarak hücreleri 2000 x g'de (oda sıcaklığında) 5 dakika boyunca santrifüjleme yoluyla toplayın. Süpernatantı aspire edici bir pipet kullanarak atın. NOT: Bu protokol sırasında K562 hücreleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, protokol çeşitli hücre hatlarına uyarlanabilir.</li>
	<li>Peleti 300 μL buz gibi soğuk 0.25x lizis tamponunda yeniden askıya alın. NOT: 2 dakika boyunca buz üzerinde tutun ve hücrelerin uygun şekilde parçalanmasını sağlamak için tüpü her 45 saniyede bir döndürün.</li>
	<li>Tüpleri 2 dakika boyunca 4 °C'de en yüksek hızda (12.000 x g) döndürün.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve yeni bir 1,5 mL tüpe yerleştirin. Bu sitoplazmik fraksiyon olacaktır. Sitoplazmik fraksiyonun yaklaşık 300 μL'sine ulaşılacaktır.</li>
	<li>Kalan pelet nükleer fraksiyon olacaktır. Pelet üzerine 500 μL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj yapın. NOT: Bu adım sırasında, fazla DNA çıkarılır.</li>
</ol>3. Bir RNA saflaştırma kiti kullanarak RNA temizliği
NOT: Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
<ol><li>Sitoplazmik RNA örneklerini ve nükleer sitoplazmik örnekleri ayırın (fraksiyonasyon adımları aralarında değiştiğinden).<ol><li>Sitoplazmik fraksiyonu ayırmak için, 1.050 μL 3.5x RLT lizis tamponu ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve kısaca vorteks. Ardından, 750 μL% 90 etanol ekleyin ve RNA temizleme kitinden kolona yükleyin. NOT: Çözelti, kolona yüklenmeden önce iyice karıştırılmalıdır.</li>
		<li>Nükleer fraksiyonu ayırmak için, 600 μL 3.5x lizis tamponu ve vorteks ekleyin. Ardından, 600 μL% 70 etanol ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hem sitoplazmik hem de nükleer fraksiyonları RNA sütunlarına yükleyin (bakınız Malzeme Tablosu). NOT: Adım 3'ün geri kalanında, hem sitoplazmik hem de nükleer örnekler aynı prosedürü izler. Ancak, bu örneklerin birbirinden bağımsız kalmasını sağlayın.<ol><li>Hem sitoplazmik hem de nükleer fraksiyonları RNA kolonlarına yükleyin ve oda sıcaklığında 8.000 x g'de 30 s döndürün. Fazla akışı atın.</li>
		<li>Ticari olarak temin edilebilen bir arıtma kitinden 350 μL yıkama tamponu ekleyin (RW1 tamponu, Malzeme Tablosu'na bakın), tekrar döndürün ve akışı atın.</li>
		<li>DNAse çözeltisini (1U/uL) oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ekleyin. Ardından, 350 μL yıkama tamponu ekleyin, tekrar döndürün ve akışı atın.</li>
		<li>500 μL hafif yıkama tamponu ekleyin (RPE, Malzeme Tablosu'na bakın), tekrar döndürün ve akışı atın. 500 μL hafif yıkama tamponu ekleyin, tekrar döndürün, ancak sadece 2 dakika bekleyin.</li>
		<li>Kolonu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe taşıyın ve spin kolonuna 30 μL su ekleyin. Aşağı dönmeden önce sütunu 1 dakika bekletin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Nükleer-sitoplazmik ayrımın doğrulanması
<ol><li>cDNA sentezi gerçekleştirin<ol><li>RNA'nın hücre altı bölmeleri ekstrakte edildikten ve saflaştırıldıktan sonra, qPCR kullanarak bölmelerin ayrıldığını onaylayın. Bunu yapmak için, önce, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak RNA'yı cDNA'ya dönüştürün (bkz.</li>
		<li>Ters transkriptaz mastermix'ini hazırlayın. Şablon RNA ekleyin. Bir termosiklustaki reaksiyonları inkübe edin. NOT: Rastgele hexamers için, kullanılan bisiklet parametreleri Tablo 2A'da verilmiştir. Ters transkriptaz reaksiyonunu hemen kullanın veya -20 °C'de saklayın (Tablo 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunu (qPCR) ve analizini gerçekleştirin.<ol><li>cDNA sentezini DEPC suyuyla seyreltin (bakınız Malzeme Tablosu) 20 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona sahip olmak için.</li>
		<li>Bir PCR ana karışımı kullanarak, aşağıda listelenen manuel talimatları kullanarak her numune için reaksiyonu hazırlayın.</li>
		<li>Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonasyonu tespit etmek için gerekli ticari probları edinin. Nükleer belirteç olarak MALAT1 ve sitoplazmik belirteç olarak TUG1 kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). NOT: MALAT1 ve TUG1 dizileri Tablo 3'te verilmiştir.</li>
		<li>Her bir numune için teknik çoğaltmaların her biri için her bir bileşeni 3 ile çarparak her bileşenin hacmini hesaplayın.</li>
		<li>Her nükleer ve sitoplazmik numune için, her biri için aşağıdaki karışımları edinin: (a) MALAT1 ile nükleer fraksiyon, (b) MALAT1 ile Sitoplazmik fraksiyon, (c) TUG1 ile nükleer fraksiyon ve (d) TUG1 ile Sitoplazmik fraksiyon (Tablo 1C).</li>
		<li>Çözeltileri karıştırmak ve karışımın 20 μL'sini bir optik reaksiyon plakasının her bir kuyucuğuna aktarmak için kısaca vorteks yapın (bkz.</li>
		<li>Plakayı qPCR için kullanılan şeffaf bir yapışkan filmle örtün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hava kabarcıklarını gidermek için plakayı kısaca santrifüj edin ve ardından numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün.</li>
		<li>Tasarım ve analiz yazılımını kullanarak (bkz . Malzeme Tablosu), döngü parametreleri için standart eğriyi seçin (Tablo 2B).</li>
		<li>qPCR yazılımını kullanarak Çalıştırmayı ayarla'yı seçin (Ek Şekil 1).</li>
		<li>Veri Dosyası Özellikleri sayfasında, Tablo 2B'den Yöntem ve giriş döngüsü parametreleri'ni seçin (Ek Şekil 2).</li>
		<li>Döngü parametrelerini girdikten sonra, Plaka sekmesini seçin ve çalıştırılacak örnekleri girin (Ek Şekil 3). Çalıştırmayı Başlat'ı seçin. NOT: Açıklanan adımlar, ticari olarak temin edilebilen bir ana karışım kullanılarak bir qPCR makinesinde gerçekleştirilmiştir (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri analizi gerçekleştirme<ol><li>Çalıştırma tamamlandıktan sonra, örnek adı, hedef adı ve niceleme döngüsü (Cq) içeren bir veri elektronik tablosu oluşturun (Ek Tablo 1).</li>
		<li>Nükleer fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleri ile başlayın. MALAT1 sitoplazmik fraksiyonunu MALAT1 nükleer fraksiyonundan çıkarın (Tablo 4).</li>
		<li>Ardından, ΔCq (2^(-value)) (Tablo 5) değerini hesaplayın.</li>
		<li>Sitoplazmik fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleriyle devam edin, MALAT1 nükleer fraksiyonunu MALAT1 sitoplazmik fraksiyonundan çıkarın ve ardından ΔCq'yu (2 ^ (-değer)) hesaplayın (Tablo 6). NOT: ΔCq'ya bakıldığında, nükleer MALAT1 fraksiyonunun (yeşil vurgu) sitoplazmadan (kırmızı vurgu) daha büyük bir MALAT1 belirtecine sahip olduğu gözlenmiştir, ancak şimdi sitoplazmik fraksiyonun ağırlıklı olarak sitoplazm olduğundan ve nükleer fraksiyonun sitoplazmik kontaminasyon içermediğinden emin olmak için doğrulama gereklidir.</li>
		<li>TUG1 numunelerinde, yukarıdakiyle aynı hesaplamayı yapın (adım 4.3.2-4.3.4) (Tablo 7). NOT: ΔCq'ya bakıldığında, sitoplazmik TUG1 fraksiyonunun (yeşil vurgu) nükleer fraksiyondan (kırmızı vurgu) daha büyük bir TUG1 belirtecine sahip olduğu, böylece sitoplazmik ve nükleer fraksiyonların iyi bir şekilde ayrıldığını doğruladığı gözlenmiştir (Tablo 8, Şekil 1).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li>
<li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+localization+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li>
<li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+separate+nuclear%2C+cytosolic%2C+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li>
<li>Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+localization%3A+message+on+the+move%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li>
<li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+positioning+system%3A+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li>
<li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((150+years+of+the+mass+action+law%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">150 years of the mass action law.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012(2015).</li>
<li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35(2016).</li>
<li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li>
<li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+yield+and+purity%3A+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li>
<li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+biogenesis%2C+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhuysen%2C+J-M+%22Bacterial+Cell+Wall%22">Bacterial Cell Wall</a>. , Elsevier. (1994).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Enzyme+Structure+and+Mechanism%22">Enzyme Structure and Mechanism</a>. , (1985).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22How+to+win+the+battle+with+RNase%22">How to win the battle with RNase</a>. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li>
<li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).</li>
<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selinexor%2C+a+first-in-class+XPO1+inhibitor%2C+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, Supplement 1 233(2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Protokol boyunca, ilgilenilen hücre hattı için en etkili olacak öğeleri optimize etmek için bazı adımlar atıldı. Protokol içindeki adımlar nispeten basit olsa da, protokolün kritik yönleri sırasında analiz ve küçük ayarlamalar gerekli olabilir. Protokoldeki en kritik adım, lizis tamponunun konsantrasyonunu, ilgilenilen hücre hattına ve hücresel hedefe bağlı olarak uygun bir konsantrasyona değiştirmektir. Lizis tamponunun kullanımı büyük ölçüde hücre zarlarının bozulmasına bağlı olduğundan, farklı hücre hatları arasında h...

Hücre altı bileşenlere hücresel fraksiyonasyon, tanımlanmış biyokimyasal alanların izolasyonuna ve incelenmesine izin verir ve spesifik hücresel süreçlerin lokalizasyonunu ve bunun işlevlerini nasıl etkileyebileceğini belirlemeye yardımcı olur1. RNA'nın farklı hücre içi konumlardan izole edilmesi, transkripsiyon seviyesi olaylarının ve çekirdek ile sitoplazma arasındaki diğer etkileşimlerin genetik ve biyokimyasal analizinin doğruluğunun iyileştirilmesine izin verebilir ve bu da mevcut protokolün birincil amacı olarak hizmet eder2. Bu protokol, nükleer ihracattaki rollerini belirlemek ve nükleus ve sitoplazmadaki RNA'ların hücre altı lokalizasyonunun hücresel süreçlerdeki işlevlerini nasıl etkileyebileceğini anlamak için sitoplazmik ve nükleer RNA'ların izolasyonunu sağlamak için geliştirilmiştir. Tipik bir laboratuvar ortamındaki materyalleri kullanarak, sonuçların kalitesini tehlikeye atmadan nükleer ve sitoplazmik fraksiyonasyonu daha önce belirlenmiş protokollerden daha etkili ve daha ucuz bir şekilde elde etmek mümkün olmuştur3.
Ek olarak, sitoplazma ve çekirdek arasındaki moleküllerin değişimi, bu bölgeleri ayırarak doğrudan incelenebilir. Daha spesifik olarak, transkriptomu anlamak, gelişimi ve hastalığı anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, RNA'lar herhangi bir zamanda farklı olgunlaşma seviyelerinde olabilir ve aşağı akış analizini zorlaştırabilir. Bu protokol, RNA'yı nükleer ve sitoplazmik hücre altı fraksiyonlardan izole etme yeteneğine izin verir, bu da RNA çalışmalarına yardımcı olabilir ve kodlamayan RNA'ların lokalizasyonu veya çekirdek içindeki ekleme kavşaklarının analizi gibi belirli bir RNA'nın daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Bu protokol, kullanılan RNA saflaştırma kolonunun boyut seçiciliği nedeniyle, mRNA'lar, rRNA'lar ve uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar) dahil olmak üzere sitoplazmik ve nükleer uzun RNA'ları izole etmek için optimize edilmiştir. Önceden, mRNA'lar ve lncRNA'lar gibi uzun RNA'ların işlevi, 4,5 hücresi içindeki ilgili lokalizasyonlarına büyük ölçüde bağlıydı. Bu nedenle, çekirdekten hücre altı alanlara yapılan ihracatın incelenmesi, RNA'nın veya diğer hücresel bileşenlerin ihraç edilmesinin hücre üzerindeki rolünü anlamaya yönelik daha hedefli hale gelmiştir. lncRNA'lar bunun en iyi örneği olarak hizmet eder, çünkü çevirileri ve sonraki etkileri büyük ölçüde RNA6'nın diğer formlarıyla yakınlık ve etkileşimlere dayanır. Ayrıca, nükleer ve sitoplazmik bölgeler arasındaki hücresel elementlerin değişimi, çeşitli kanser tedavilerine direnç mekanizmalarına bağlıdır7. Hücre içi bölmelerin izolasyonu, direnç mekanizmalarının farklı tedavilere etkilerini azaltan nükleer ihracat inhibitörlerinin geliştirilmesine izin vermiştir8.
Nükleer ve sitoplazmik RNA'yı ayırdıktan sonra, ilgilenilen RNA'yı saflaştırmak için adımlar atılır. RNA saflaştırma kitleri laboratuvarlarda yaygın olarak bulunduğundan ve uzun RNA'ları saflaştırmak ve izole etmek için işlev gördüğünden, bu protokolün amacına iyi hizmet ederler. RNA saflaştırması için, 1.8'den büyük 260:280 oranlarının üretilmesi, RNA dizilimi veya yüksek saflık ve izolasyon gerektiren diğer benzer prosedürler için numunelerin kalitesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Düzensiz 260:280 değerleri fenol kontaminasyonunu gösterir, zayıf izolasyon gösterir ve yanlış sonuçlar verir9.
RNA saflaştırması tamamlandıktan ve 260:280 değerlerinin kabul edilebilir bir aralığın üzerinde olduğu doğrulandıktan sonra, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların izolasyon sonuçlarını doğrulamak için qPCR kullanıldı. Bunu yaparken, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerini göstermek için ilgili bölgeye özgü primerler kullanılmıştır. Bu protokolde MALAT1 ve TUG1 nükleer ve sitoplazmik belirteçler olarak sırasıyla10 kullanıldı. Birlikte, MALAT1 ile yüksek düzeyde nükleer fraksiyonasyonun gösterilmesine izin verirken, sitoplazmik fraksiyonasyonun düşük olması beklenir. Tersine, TUG1 kullanıldığında, sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerinin nükleer fraksiyonasyon seviyelerinden daha yüksek olması beklenir.
Bu protokolü kullanarak, RNA'ları hücre içindeki etki konumlarına göre izole etmek mümkündü. Bu deney sırasında birçok malzemeye yaygın erişim ve sadece lizis tamponu ve yoğunluğa dayalı santrifüj tekniklerinin kullanılması nedeniyle, diğer RNA tiplerine ve diğer hücresel bileşenlere uygulanabilirlik yaygındır. Bu, aksi takdirde ayrılmadan ayırt edilemeyecek konuma özgü ifade olaylarına ışık tutarak önemli bilgiler sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>Agilent Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td>Agilent TapeStation sistemi, DNA ve RNA numunelerinin numune kalite kontrolü için otomatik bir elektroforez çözümüdür.</td></tr><tr><td>% 0.5 Nonidet P-40</td><td>Thermo-Fischer</td><td>28324</td><td>Lizis tamponu yapımında kullanılır</td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 8.0</td><td>Thermo-Fischer</td><td>15568025</td><td>Lizis tamponu yapımında kullanılır</td></tr><tr><td>MALAT1 GE Testi</td><td>Thermo-Fischer</td><td>Hs00273907_s1</td><td>Nükleer fraksiyonun doğrulanması için kullanılır.</td></tr><tr><td>MicroAmp Barkodlu Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4326659</td><td>Uygulamalı Biyosistemler MicroAmp Optik 96 Kuyulu Barkodlu Reaksiyon Plakası, hızlı, verimli PCR amplifikasyonu için benzersiz sıcaklık doğruluğu ve homojenliği sağlamak üzere optimize edilmiştir. 96 oyuklu formatta tek bir sert polipropilen parçasından yapılan bu plaka, Applied Biosystems 96 Kuyulu Gerçek Zamanlı PCR sistemleri ve termal döngüleyicilerle uyumludur.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optik Yapışkan Film</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4311971</td><td>Uygulanan Biyosistemler MicroAmp Optik Yapışkan Film, qPCR sırasında bir mikroplakaya uygulandığında kuyudan kuyuya kontaminasyon ve numune buharlaşması olasılığını azaltır</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-023</td><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), ayrışmadan önce hücrelerin yıkanması gibi çeşitli hücre kültürü uygulamaları için kullanılan dengeli bir tuz çözeltisidir. hücrelerin veya doku örneklerinin taşınması, sayım için hücrelerin seyreltilmesi ve reaktiflerin hazırlanması.</td></tr><tr><td>Qiagen RNA Temizleme Kiti-Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNA temizleme kitleri, enzimatik reaksiyonların verimli bir şekilde RNA temizliğini ve farklı yöntemlerle saflaştırılmış RNA'nın temizlenmesini sağlar. Protokol boyunca bahsedilen RW1, RLT, RW1 arabelleklerini içerir.</td></tr><tr>Protokol sırasında kullanılan <td>QuantStudio 6</td><td>Thermo-Fischer</td><td>A43180</td><td>qPCR yazılımı. Fraksiyonasyon örneklerini analiz etmek için Tasarım ve Analiz Yazılımı içerir</td></tr><tr><td>RLT Tamponu</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>RNA temizleme kitinden Lizis</td></tr><tr><td>Tamponu RPE Tamponu</td><td>Qiagen</td><td>1018013</td><td>RNA temizleme kitinden Yıkama Tamponu</td></tr><tr><td>RW1 Tamponu</td><td>Qiagen</td><td>1053394</td><td>RNA temizleme kitinden Yıkama Tamponu</td></tr><tr><td>Taqman Gen Ekspresyon Testleri</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4331182</td><td>Applied Biosystems TaqMan Gen Ekspresyon Testleri, 32 ökaryotik tür ve çok sayıda mikropta 2,8 milyondan fazla test ile sektördeki en büyük önceden tasarlanmış tahlil koleksiyonunu temsil eder. TaqMan Gen Ekspresyon testleri, SYBR Green primerlerini optimize etmek için zaman kaybetmeden ve eriyik eğrilerini çalıştırmak ve analiz etmek için fazladan zaman harcamadan hızlı bir şekilde sonuç almanızı sağlar.</td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4305719</td><td>TaqMan Universal PCR Master Mix, birden fazla 5' nükleaz DNA uygulaması için bir ana karışıma ihtiyaç duyduğunuzda ideal reaktif çözümüdür. Applied Biosystems reaktifleri, her seferinde hassas, doğru ve güvenilir performans sağlamak için TaqMan tahlilleri ve Applied Biosystems gerçek zamanlı sistemleri ile doğrulanmıştır.</td></tr><tr><td>TUG1 GE Testi</td><td>Termo-Fischer</td><td>Hs00215501_m1</td><td>Sitoplazmik fraksiyonun doğrulanması için kullanılır.</td></tr><tr><td>UltraPure DEPC ile Arıtılmış Su</td><td>Thermo-Fischer</td><td>750024</td><td>UltraPure DEPC ile arıtılmış Su, RNA ile kullanım için uygundur. % 0.1 dietilpirokarbonat (DEPC) ile inkübe edilerek hazırlanır ve daha sonra DEPC'yi çıkarmak için otoklavlanır. Steril filtreli.</td></tr></tbody></table>

primer ve kültürlü hücrelerden sitoplazmik ve nükleer uzun rna'ların hazırlanması

Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

Hücre içi bileşenlerin ayrılması, uzun yıllardır hücresel biyolojide önemli bir araç olmuştur ve konumlarının işlevlerini nasıl etkileyebileceğine dair yararlı bilgiler sağlayabilmiştir. Özellikle, nükleer ve sitoplazmik RNA'nın ayrılması, kanser hücreleri ve ilaçlar için yeni hedefler bulma arayışı bağlamında önemli hale gelmiştir. Nükleer-sitoplazmik RNA ekstraksiyonu için kitlerin satın alınması, gerekli malzemelerin çoğu tipik bir laboratuvar ortamında bulunabildiğinde maliyetli olabilir. Daha pahalı kitlerin veya diğer zaman alıcı işlemlerin yerini alabilen mevcut yöntemi kullanarak, nükleer ve sitoplazmik RNA'yı izole etmek için sadece ev yapımı bir lizis tamponu, bir tezgah üstü santrifüj ve RNA izolasyon saflaştırma sütunlarına ihtiyaç vardır. Lizis tamponu, nükleer zarfın bütünlüğünü etkilemeden hücrenin dış zarını nazikçe lize etmek için kullanılır ve hücre içi bileşenlerinin serbest bırakılmasına izin verir. Daha sonra, çekirdekler basit bir santrifüjleme adımıyla izole edilebilir, çünkü lizis çözeltisinden daha yüksek bir yoğunluğa sahiptirler. Santrifüjleme, çekirdekteki hücre altı elementleri sitoplazmadakilerden izole etmek için bu alanları yoğunluk farklılıklarına göre ayırmak için kullanılır. Santrifüjleme farklı bileşenleri izole ettikten sonra, RNA içeriğini saflaştırmak için bir RNA temizleme kiti kullanılır ve farklı fraksiyonlardaki nükleer ve sitoplazmik RNA miktarı ile ölçülen ayırma kalitesini doğrulamak için qPCR gerçekleştirilir. Protokolün etkinliğini gösteren istatistiksel olarak anlamlı ayrılma seviyelerine ulaşıldı. Ek olarak, bu sistem, sitoplazma-çekirdek etkileşimlerinin hedefli olarak incelenmesine izin veren ve çekirdek ve sitoplazmada bulunan RNA'nın işlevindeki farklılıkların anlaşılmasına yardımcı olan farklı RNA türlerinin (toplam, küçük RNA, vb.) İzolasyonu için uyarlanabilir.

Nükleer ve sitoplazmik izolasyonun sağlandığından emin olmak için, sonuçları doğrulamak için bir qPCR yapıldı. Bunu yaparken, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerini göstermek için ilgilenilen bölgeye özgü primerler kullanılmıştır. Bu çalışmada MALAT1 ve TUG1 sırasıyla nükleer ve sitoplazmik primer olarak kullanılmıştır. Birlikte, nükleer elementler için pozitif bir kontrol olarak MALAT1 ile yüksek seviyelerde nükleer fraksiyonasyonun gösterilmesine izin verirken, sitoplazmik fraksiyonasyonun düşük olması bekl...

Mevcut protokol, RNA'yı kültürlenmiş hücreler kullanarak nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlardan izole etmek ve daha sonra qPCR kullanarak doğrulamak için etkili ve esnek bir yöntem sunmaktadır. Bu, etkili bir şekilde diğer RNA hazırlama kitlerinin yerine geçer.

Primer ve Kültürlü Hücrelerden Sitoplazmik ve Nükleer Uzun RNA'ların Hazırlanması

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Bu protokol, tanımlanmış biyokimyasal elementlerin çekirdek ve sitoplazmadaki farklı rollerini değerlendirmek ve bu alanlar arasındaki hücre içi etkileşimleri çeşitli hücre hatları içinde analiz etmek için gereklidir. Bu teknik, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonları daha verimli bir şekilde ayırmak için yaygın laboratuvar ekipmanlarını ve reaktifleri kullanır. Bu protokol bunu diğer protokollerden daha ucuz ve daha hızlı yapabilir.Sitoplazmik ve nükleer etkileşimler üzerine yapılan çalışmalar yaygınlaştıkça, lokalizasyonun hücre içi olaylar üzerindeki etkisi daha iyi anlaşılabilir. Sitoplazma ve çekirdek arasındaki değişim, nükleer proteinler üzerine yapılan çalışmaların gösterdiği gibi, bu değişimler sırasında belirli moleküllerin kanser gelişimine yol açıp açamayacağını gösteren analiz edilebilir. Protokoldeki en kritik adım, lizis tamponunun konsantrasyonunu uygun bir konsantrasyona değiştirmektir.Lizis tamponunun kullanımı büyük ölçüde hücre zarlarının bozulmasına bağlı olduğundan ve lizis tamponunun farklı hücre hatları üzerindeki etkinliğinde doğal varyantlar vardır. Başlamak için, 2000 G.'de beş dakika boyunca santrifüjleme yoluyla 1.5 mililitrelik tüpler kullanarak hücreleri pelet edin G.Emper aspire edici bir pipet kullanarak süpernatantı atın. Peleti 300 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden askıya alın.Ardından, tüpleri iki dakika boyunca dört santigrat derecede yaklaşık 12.000 G hızında döndürün. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin. Kalan pelet nükleer fraksiyon olacaktır.Daha sonra, pelete 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2000 G'de santrifüj yapın. qPCR kullanarak bölmelerin ayrılmasını doğrulamak için, önce RNA'yı ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak tamamlayıcı DNA'ya dönüştürün. Ters transkriptaz ana karışımını hazırlayın.Şablon RNA ekleyin. Bir termosiklustaki reaksiyonları inkübe edin. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ve analizi yapmak için devam edin.Mililitre başına 20 nanogramlık bir nihai konsantrasyona sahip olmak için cDNA sentezini DEPC suyuyla seyreltmekle başlayın. Bir PCR ana karışımı kullanarak, manuel talimatları kullanarak her numune için reaksiyonu hazırlayın. Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonasyonu tespit etmek için gerekli ticari probları edinin.Nükleer belirteç olarak MALAT1 ve sitoplazmik belirteç olarak TUG1 kullanın. Her bir numune için teknik çoğaltmaların her biri için her bir bileşeni üçle çarparak her bileşenin hacmini hesaplayın. Her nükleer ve sitoplazmik numune için, MALAT1 ile nükleer fraksiyon, MALAT1 ile sitoplazmik fraksiyon, TUG1 ile nükleer fraksiyon ve TUG1 ile sitoplazmik fraksiyon karışımlarını elde edin.Çözeltileri karıştırmak ve karışımın 20 mikrolitresini optik reaksiyon plakasının her bir kuyucuğuna aktarmak için kısaca vorteks. Plakayı qPCR için kullanılan şeffaf bir yapışkan filmle örtün ve hava kabarcıklarını gidermek için plakayı kısa bir süre santrifüj edin ve ardından numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez G'de döndürün. Tasarım ve analiz yazılımını kullanarak, döngü parametreleri için standart eğriyi seçin.qPCR yazılımını kullanarak kurulum çalıştır'ı seçin. Veri dosyası özellikleri sayfasında, yöntem ve giriş döngüsü parametrelerini seçin. Döngü parametrelerini girdikten sonra, plaka sekmesini seçin ve çalıştırılacak örnekleri girin.Çalıştırmayı başlat'ı seçin. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, örnek adı, hedef adı ve niceleme döngüsünü içeren bir veri elektronik tablosu oluşturun. Nükleer fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleri ile başlayın.MALAT1 sitoplazmik fraksiyonunu MALAT1 nükleer fraksiyonundan çıkarın. Sitoplazmik fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleriyle devam edin. MALAT1 nükleer fraksiyonunu MALAT1 sitoplazmik fraksiyonundan çıkarın ve ardından negatif delta CQ'ya yükseltilmiş ikisini hesaplayın. TUG1 numuneleri ile hesaplamaları gerçekleştirin.TUG1, sitoplazmik elementler için pozitif bir kontrol olarak mevcut olduğunda, sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerinin nükleer fraksiyonasyon seviyelerinden daha yüksek olması beklenir. MALAT1'li numunede sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerinin gözlendiği negatif bir sonuç. Bu, nükleer fraksiyondan izole edilen RNA'nın, potansiyel olarak çok düşük veya çok yüksek olan lizis konsantrasyonları nedeniyle kontaminasyonunu gösterir.MALAT1 ve TUG1, örneklerin saflığını ve kalitesini doğrulayan bir Batı lekesi ve RNA elektroforezi ile doğrulandığı gibi nükleer ve sitoplazmik ayırma ile en yüksek korelasyonu sergiledi. Ek olarak, nükleer ve sitoplazmik ekstraktların saflığı, nükleer fraksiyon için bir belirteç olarak lamin ve sitoplazmik fraksiyon için pozitif bir belirteç olarak alfa-tübülin kullanan bir Batı lekesi ile gösterilebilir. Sitoplazmik RNA elektroforezinde pik gözlenmedi, bu da sitoplazmik RNA örneğinde yüksek kalite ve çok az veya hiç kontaminasyon göstermedi.Lizis tamponunun kullanımı, uygun fraksiyonasyon için kritik öneme sahiptir ve lizis tamponu konsantrasyonunun, ilgilenilen istenen hücre hattına optimize edilmesi esastır. Bu teknik, çeşitli araştırma konularına yaygın olarak uygulanan nükleer ve sitoplazmik etkileşimin hedeflenen çalışmasına izin verir ve belirli biyolojik elementlerin lokalizasyonunun işlevleriyle nasıl ilişkili olabileceğinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

preparation-cytoplasmic-nuclear-long-rnas-from-primary-cultured

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Sağlam, küçük ölçekli HeLa çekirdek ekstreler hazırlanması için bir protokol tarif edilmektedir. Bu protokol, örneğin ilaçların veya RNAi ile muamele hücreleri gibi hücrelerin küçük popülasyonları, kullanımını gerektiren deneyleri için önemlidir. Metodu gen ifadesi deneyleri ve hasta hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, geniş bir yelpazede uygulanabilir olması gerekir.

Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

RNA polimeraz II olgun mRNA'nın 3 'ucunun ötesine uzanan bir ön-madde RNA sentezler. Olgun RNA uç yarılma kompleksinin endonükleaz etkinliği ile, RNA dizileri tarafından dikte bir bölgede, cotranscriptionally oluşturulur. Burada, detay in vitro bölünme reaksiyonları çalışma yöntemi biz.

Pre-mRNA Substratlarm 3 &#39;End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi<em&gt; In vitro</em

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Bu el yazması, ökaryotik hücrelerde oluşan seçilmiş akraba RNP'leri spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla izole etmek için bir yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini, DHX9/RNA helikaz A'dan oluşan retroviral 5' çevrilmemiş bölgeye bağlı bir akraba RNP'yi izole ederek gösteriyoruz.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Bu RNA açılan yöntem uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA hedeflerini belirleme sağlar. Ev yapımı, tasarlanmış Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları bu lncRNA uygun bir şekilde sabit doku veya hücre için belirli hibridizasyon dayanarak, verimli bir şekilde lncRNA ait tüm RNA hedefleri yakalama sağlar.

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Burada, hızlı bir şekilde yüksek kaliteli çekirdekleri aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için taze veya dondurulmuş dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İkisi de çekirdek yalıtımı için kullanılan deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik doku bozulma ve hücre lizis seçenekleri, içerir.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Burada, hat-1 ifadesini Locus özel seviyesinde belirlemek için Biyoinformatik bir yaklaşım ve analizler sunuyoruz.

RNA yeni nesil sıralamayı ve Biyoinformatik boru hattını Locus 'a özgü düzeyde Ifade eden SATıRı-1s tanımlamak için

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Öğrenin, hücre biyolojisinde sitoplazmik ve nükleer RNA izolasyonunu qPCR ile doğrulanmış maliyet etkin bir yöntemle. Bu protokol, kanser gelişimi araştırmalarında intraselüler etkileşimleri anlamak için değerlidir.

Primer ve Kültürlü Hücrelerden Sitoplazmik ve Nükleer Uzun RNA'ların Hazırlanması

Daha fazla video keşfet