Kanser Epigenetiği Araştırmaları için ATAC-Seq Optimizasyonu

ATAC-seq, genomdaki açık kromatin bölgelerinin durumunu tanımlamamıza izin verir, bu da normal duruma kıyasla hastalık durumlarında sıklıkla değişir. Daha az hücre girişi, basitleştirilmiş bir Tn5 sindirim protokolü, ardından parçalanmış DNA'nın izolasyonu ve PCR amplifikasyonu ile kütüphane hazırlığı ve daha kısa deney süresi onu daha avantajlı bir teknik haline getirmektedir. ATAC-seq tarafından normal ve hastalık koşulları arasında değişen epigenetik manzaranın karşılaştırılması, hastalıkla ilişkili kromatin düzenleyici elementlere ışık tutabilir ve yeni terapötik stratejilerin tasarlanmasında yararlı olabilir.

Bu tekniğin uygulanması kolaydır, çünkü herhangi bir kritik deneysel adım içermez. Başarılı ATAC-seq sonuçları elde etmek için, sadece birkaç standardizasyon adımı gerekir. Başlamak için, PBS'de mililitre başına bir milyon hücre içeren bir hücre süspansiyonundan 25 mikrolitreyi 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de santrifüj yapın.

Süper natantı dikkatlice atın ve 25 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Hücreleri hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek tekrar askıya alın ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı dikkatlice atın.

Peleti derhal 25 mikrolitre Tn5 reaksiyon karışımında tekrar askıya alın ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi her 10 dakikada bir karıştırın. Tn5 etiketli DNA çözeltisine beş mikrolitre 3 molar sodyum asetat ve 125 mikrolitre tampon PB ekleyin.

İyice karıştırın. Ardından, döndürme sütununu 2 mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirin ve numuneyi döndürme sütununa uygulayın. Oda sıcaklığında bir dakika boyunca 17.900 G'de santrifüj yapın ve akışı atın.

Sütuna PE arabelleği ekleyin ve sütunu döndürün. Spin kolonunu tekrar aynı toplama tüpüne yerleştirin ve membranı tamamen kurutmak için beş dakika boyunca santrifüj yapın. Akış akışını atın ve sıkma kolonunu yeni bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.

DNA parçalarını 10 mikrolitre tampon EB ile süzün ve sütunun oda sıcaklığında bir dakika bekletilmesine izin verin. Daha sonra DNA'yı sulandırmak için oda sıcaklığında bir dakika boyunca 17.900 G'de santrifüj yapın. PCR reaksiyonunu 200 mikrolitrelik PCR tüplerinde ayarlayın ve PCR Amplifikasyon Programı Birinci Bölüm'ü gerçekleştirin.

Gerçek zamanlı QPCR için, beş mikrolitre PCR ürünü, 0.75 mikrolitre 1.000 kez seyreltilmiş SYBR Gold, beş mikrolitre 2X PCR Master Mix ve 3.75 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyerek PCR reaksiyon karışımını hazırlayın. Çalıştırma parametrelerini kullanarak gerekli ek PCR döngüsü sayısını belirleyin. Döngü numarası belirlendikten sonra, PCR'leri daha önce hesaplanan ek döngülerle ayarlayın.

Güçlendirilmiş PCR ürünlerine 150 mikrolitre boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri beş dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Boncukları 200 mikrolitre% 80 etanol ile yıkayın ve süpernatanı çıkarın.

Etanolün tamamen çıkarılmasını sağlayın ve numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurulayın. Son olarak, 50 mikrolitre elüsyon tamponu ile yeniden askıya alın. Tüpü manyetik bir standa yerleştirin, ardından elüatı taze bir 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın.

Burada tripan mavisi kullanılarak hücre lizis verimliliğinin karşılaştırılması gösterilmiştir. NMuMG hücreleri hipotonik tampon ve CSK tamponu ile tedavi edildi ve tripan mavisi ile boyandı. CSK ile tedavi edilen hücrelerde daha yüksek hücre lizis etkinliği gözlenmiştir.

ATAC-seq kütüphaneleri MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinden hazırlandı. PCR amplifikasyonundan sonra, PCR ürünleri boncuk saflaştırmadan önce ve sonra 0.5X TBE,% 1.5 agaroz jeli üzerinde analiz edildi. Astarlar çoğunlukla ilk boncuk saflaştırma ile uzaklaştırılır.

1X TAE% 1 agaroz jel elektroforezinden DNA bant paternleri ve otomatik bir elektroforez de belirtilmiştir. SYBR Gold, burada gösterilen DNA parçalarını görselleştirmek için kullanıldı. ERS1 lokusunu gösteren bir genom tarayıcı izi burada sunulmuştur.

T47D hücrelerindeki ATAC-seq verilerinin genom kapsamı bu resimde gösterilmiştir. Önceki bir yayından astarlar kullanılmış ve hedef bölgeleri sarı renkle vurgulanmıştır. ATAC-seq kütüphanelerinde primer amplikon zenginleştirmesini gösteren bir çubuk grafik burada gösterilmiştir.

ATAC-seq kütüphaneleri hipotonik tampon veya CSK tamponu ile hazırlandı. Temsili görüntü, ATAC-seq optimizasyonu için genom tarayıcı görselleştirmesini göstermektedir. 25.000 hücreli giriş koşulundan elde edilen ATAC-seq verileri, nükleozomsuz fragmanların en yüksek zenginleşmesini gösterirken, 100.000 hücreli giriş koşulu en yüksek mononükleomal DNA'ları sundu.

Farklı hücre numaralarından ATAC-seq verilerini gösteren genom tarayıcı izleri burada sunulmaktadır. HOMER tepe ek açıklama analizi bu temsili resimde gösterilmiştir. HOMER her bir zirveyi promotör proksimal veya distal pik olarak sınıflandırdı.

Hücre lizis tamponunun hücre giriş seçimi sayısı ve hücre tipine bağlı Tn5 enziminin konsantrasyonu, standartlaştırılması gereken en kritik parametredir. Kes ve yapış tekniğinde A proteini ile kaynaşmış Tn5, ilgilenilen proteine özgü antikorları kullanarak ilgilenilen bir protein için DNA bağlanma bölgesini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır.