Name: T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin, fare timositlerini izole edip retroviral transdüksiyon ve OP9-DL4 hücreleri üzerinde ko-kültürle T hücreli gelişimi ve kanser araştırmaları için genetik modifikasyon etkilerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü'nün intramural programı, ZIABC009287 projesi tarafından desteklenmiştir. OP9-DL4, Dr. Juan Carlos Zúñiga-Pflücker'den (Sunnybrook Sağlık Bilimleri Merkezi, Toronto, ON, Kanada) elde edildi. Yazarlar, NCI-Frederick Laboratuvar Hayvanları Bilimleri Programı'na sürekli teknik yardımları ve deneysel tavsiyeleri ve girdileri için ve ayrıca Jeff Carrel, Megan Karwan ve Kimberly Klarmann'a akış sitometri yardımı için teşekkür eder. Howard Young'a eleştirel tavsiyeleri ve katkıları için minnettarız.

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, NIH Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) ve Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler ve malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız. Retrovirüs üreticisi hücre kültürü ve bakım prosedürleri hakkında daha fazla ayrıntı için yayınlanmış kılavuz19'a bakın. Protokole genel bir bakış için Şekil 1'e bakın.
1. OP9-DL4 hücrelerinin kültürünün başlatılması (Gün 1)
<ol><li>OP9-DL4 hücrelerini şişeyi tutarak ve 37 ° C'de bir su banyosunda hafifçe sallayarak hızla çözün. Kriyoprotektan ajanları uzaklaştırmak için hücreleri derhal 5 mL OP9 ortamı (MEM-alfa ortamı,% 10 FBS, 50 U / mL penisilin / streptomisin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin) içeren bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj. Süpernatanı atın ve hücreleri 1 mL OP9 ortamında yeniden askıya alın.</li>
	<li>Bir T25 şişesine 5 mL OP9 ortamı yerleştirin ve yeniden askıya alınmış hücreleri bu şişeye ekleyin. 37 °C'de kültür ve% 5 CO2.</li>
	<li>2-3 gün sonra, 1: 3'lük bir bölünme kullanarak hücreleri alt kültüre alın (hücreleri her pazartesi, çarşamba ve cuma günleri geçirin). NOT: OP9-DL4 hücrelerini birleşime ulaşmadan önce bölün. OP9-DL4 şişesi, timositlerle birlikte kültür için 6-7. günlerde ve 8-9+ günlerde% 80-90 oranında birleşmelidir. Bu nedenle, OP9-DL4 hücrelerini bölerken o günlerde kaç tane OP9-DL4 hücresine ihtiyaç duyulacağını planlamak önemlidir.<ol><li>Ortamı şişeden atın ve tek katmanı 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi atın, 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 1-5 dakika veya hücreler şişeden çıkana kadar inkübe edin. Hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi yumruklayın. NOT: (İsteğe bağlı) Hücre ayrışmasının ilerlemesi mikroskopi ile kontrol edilebilir.</li>
		<li>Tripsini inaktive etmek için 5 mL OP9 ortamı ekleyin ve yeniden süspansiyon sırasında şişenin hücre kaplı yüzeyini durulayarak hücreleri yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin ve 3 mL OP9 ortamında (1:3 bölünme için) tekrar askıya alın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini, zaten 5 mL taze OP9 ortamı içeren bir T25 şişesine yerleştirin. Kalan hücreleri dondurun/atın.<ol><li>OP9-DL4 hücrelerini dondurmak için, hücreleri% 90 FBS /% 10 DMSO'da, 1 mL dondurma ortamı ile bir şişe hücre oranında yeniden askıya alın.</li>
			<li>Gelecekteki gereksinimlere bağlı olarak 1 mL kriyovyallerde −80 °C'de veya sıvı azotta dondurun. Uzun süreli depolama için sıvı azotta saklayın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Retrovirüs üreticisi hücre hattının kültürünün başlatılması (Gün 1)
<ol><li>Retrovirüs üreticisi hücre hattını, şişeyi tutarak ve 37 ° C'de bir su banyosunda hafifçe sallayarak hızla çözün. Kriyoprotektan ajanı çıkarmak için hücreleri derhal 5 mL retrovirüs üreticisi hücre ortamı (RPC: DMEM,% 10 FBS) içeren bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj. Süpernatanı atın ve hücreleri 1 mL RPC ortamında yeniden askıya alın.</li>
	<li>Bir T25 şişesine 5 mL RPC ortamı yerleştirin ve askıya alınmış hücreleri bu şişeye ekleyin. 37 °C'de kültür ve% 5 CO2.</li>
	<li>Hücreleri her 2-3 günde bir 1:5 ila 1:8 arasında bir bölünmeyle geçirin.<ol><li>Hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi yumruklayın ve agresif bir şekilde pipetleyerek hücreleri yeniden askıya alın. NOT: Bu hücreler, tripsin olmadan agresif pipetleme ile şişe yüzeyinden çıkarılabilir. Alternatif olarak, hücreler kolayca ayrılana ve tek hücreli bir süspansiyona kolayca pipetlenene kadar tripsin (% 0.05 tripsin / 0.53 mM EDTA) deneyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin ve 5 mL RPC ortamında (1:5 bölünme için) yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini, zaten 5 mL taze RPC ortamı içeren bir T25 şişesine yerleştirin. Kalan hücreleri dondurun/atın. Retrovirüs üreticisi hücreleri OP9-DL4 hücreleri için tarif edildiği şekilde dondurun (adım 1.4.4.1–1.4.4.2).</li>
</ol>3. Retrovirüs üreticisi hücrelerin kültürüne 6 kuyucuklu plakalarda başlanması (Gün 4-5)
<ol><li>Transfeksiyondan 18-24 saat önce retrovirüs üreticisi hücreleri, 2 mL RPC ortamında 6 kuyucuklu bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda% 70-90 akıcılıkta tohumlayın ve 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. NOT: Dönüştürülecek her 2-5 × 105 ila 1 × 106 timosit için retrovirüs üreticisi hücrelerin iki kuyucuğunu transfekte edin.</li>
</ol>4. İlgili genleri içeren retrovirüsü üretmek için retrovirüs üreten hücrelerin transfekte edilmesi (Gün 5-6)
<ol><li>Transfeksiyondan 1 saat önce ortamı taze RPC ortamı ile değiştirin.</li>
	<li>Dupopeksiyon karışımları hazırlayın (6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğu için - gerektiğinde ölçeklendirin): 4 μg DNA'yı (2 μg yardımcı plazmid (pCL-Eco) ve 2 μg transfer plazmidini (pMIG) 250 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Yavaşça karıştırın.</li>
	<li>10 μL transfeksiyon reaktifini, adım 4.2'den itibaren indirgenmiş serum ortamının 250 uL'si ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>5 dakikalık inkübasyondan sonra, seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirin (toplam hacim = 500 μL). Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 20-25 dakika inkübe edin.</li>
	<li>500 μL DNA/transfeksiyon reaktifi karışımlarını, retrovirüs üreticisi hücreleri içeren kuyucuğa, dairesel bir hareketle hücrelerin üzerine bırakarak yavaşça ekleyin. Plakayı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın ve plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde 16-24 saat boyunca inkübe edin. NOT: Subkonfluent hücreler (%80-%90) transfeksiyon için en uygun olanıdır ve potansiyel olarak en yüksek viral titreyi üretirler. Retrovirüs üreticisi hücreler şişeden çok kolay bir şekilde yerinden çıktığından, bu hücreleri tutarken ani hareketlerden kaçının.</li>
</ol>5. Retrovirüs üreticisi hücre ortamını değiştirme (Gün 6-7)
<ol><li>Transfeksiyondan yaklaşık 16 saat sonra eski ortamı 2 mL taze RPC ortamı ile değiştirin. Hücreleri 20-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe etmeye devam edin.</li>
	<li>Transfeksiyon verimliliğini floresan mikroskobu altında değerlendirin (isteğe bağlı). NOT: Bu protokolde, GFP-pozitif hücreler ilgilenilen hücrelerdir (bkz. Şekil 2). Bu adım, bu protokolde kullanılmak üzere seçilen retrovirüs vektörüne (omurgada bir muhabir geninin bulunup bulunmadığı) bağlıdır.</li>
</ol>6. CD4 + ve CD8 + hücrelerinin timosit hazırlanması ve tükenmesi (Gün 6-7)
<ol><li>Timüsü 4-6 haftalık bir C57BL/6 fareden toplayın. Timus hasadı hakkında daha fazla bilgi için, Xing ve Hogquist20'ye bakın. NOT: Fareler CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapıldı.</li>
	<li>Timüsü bir Petri kabında 5 mL PBS'ye yerleştirerek bir timosit tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Steril cam slaytlar kullanarak, timusu slaytların buzlu yüzeyleri arasına yerleştirin ve timusu iki slayt arasında yuvarlayarak slaytları hafifçe ovalayın. Hücreleri toplamak için cam slaytları durulayın ve kalan timik stromal dokuyu atın. NOT: Bir timustan elde edilen tahmini verim 90 × 10 6-100 × 106 hücredir ve CD4 ve CD8 tükenmesinden sonra hücrelerin yaklaşık% 1'i kalacaktır. Daha iyi bir hücre verimi için genç farelerden timus dokusu kullanın, çünkü doğumdan sonraki ilk haftalarda fare timusunun hücreselliği hızla artar, 4-6 haftalıkken bir platoya ulaşır ve daha sonra21'i aşamalı olarak içerir. Otomatik bir kan hücresi sayacı veya herhangi bir alternatif yöntem kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Timik süspansiyonun 5 mL'sini bir hücre süzgecinden pipetleyerek timik süspansiyonu 30 μm veya 40 μm'lik bir filtreden geçirin. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve kırmızı kan hücrelerini ACK lizis tamponu ile lize edin (numune boyutuna bağlı olarak) 1 dakika boyunca tüp başına 1 mL tampon ekleyin. ACK lizis tamponunu devre dışı bırakmak için 5 mL hücre tükenme tamponu (500 mL PBS [pH 7.2], %0.5 BSA, 2 mM 0.5M EDTA, pH 8.0) ekleyin, 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve sayım için 1-5 mL hücre tükenme tamponunda yeniden askıya alın. NOT: Tükenmeden önce buz üzerinde aşağıdakileri bir kenara koyun (tükenme öncesi): CD4 ve CD8 için boyama ve akış sitometrisi 22,23 ile analiz ederek tükenmenin verimliliğini belirlemek için saymak için 70 μL hücre süspansiyonu (seçilen sayma hücresi yöntemine bağlı olarak değişir) ve200 μL hücre süspansiyonu.</li>
	<li>Hücreleri sayın ve 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın. Hücreleri 1 × 107/80 μL hücre tükenme tamponunda yeniden askıya alın. 1 × 107 hücre başına CD4 ve CD8 mikroboncuklarının her birine 10 μL ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta buzdolabında (2-8 ° C) 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>2 mL tükenme tamponu ile durulayarak ve akışı atarak bir tükenme sütunu hazırlayın.</li>
	<li>1 ×10 7 hücre başına 1-2 mL tükenme tamponu ekleyerek hücreleri adım 6.6'dan yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın. Supernatan'ı çıkarın ve atın.</li>
	<li>500 μL tükenme tamponunda 1,25 ×10 8 hücreye kadar yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın ve akışı (etiketlenmemiş hücreler) toplayın. Kolonu 2x 1 mL tamponla yıkayın ve akışı toplayın. NOT: Yalnızca sütun rezervuarı boş olduğunda yeni arabellek ekleyin. Tükenmeden sonra buz üzerinde aşağıdakileri bir kenara koyun (tükenme sonrası kontrol): CD4 ve CD8 için boyayarak ve akış sitometrisi22,23 ile analiz ederek tükenmenin verimliliğini belirlemek için saymak için 70 μL hücre süspansiyonu (seçilen sayma hücresi yöntemine bağlı olarak değişir) ve 1.000 μL hücre süspansiyonu.</li>
	<li>Tükenmeden önce toplanan 200 μL hücreyi dört FACS tüpüne bölerek tükenme verimliliği kontrollerini lekeleyin: lekesiz, CD4 tek boyalı, CD8 tek boyalı ve CD4 / CD8 çift boyalı (akış sitometri parametrelerini ayarlamak için lekesiz ve tek boyalı numuneleri kullanın). CD4 ve CD8 için boyamak için tükenmeden sonra toplanan 1.000 μL hücreyi kullanın ve tükenmeden önce toplanan çift boyalı numune ile karşılaştırın ( Şekil 3'teki tipik tükenme sonuçlarına bakınız). NOT: Akış sitometri boyama hacimlerini antikor üreticisinin önerisine göre ayarlayın (örneğin, 50 μL tamponda 1 x 106 hücre başına 1 μL anti-CD4-FITC + 0,5 μL anti-CD8-PE).</li>
</ol>7. OP9-DL4 hücrelerinde timositlerin kültürlenmesi (Gün 6-7)
<ol><li>2-5 × 105 ila 1 × 106 tükenme sonrası timositleri, sitokinler içeren OP9 ortamında% 80-90 oranında birleşik OP9-DL4 hücrelerinden oluşan bir T25 şişesine yerleştirin (10 ng / mL rekombinant IL-7 ve rekombinant hFLT-3). 37 °C'de kültür ve% 5 CO2. OP9-DL4 hücrelerinde yaklaşık 24 saat büyür. NOT: Bu süre, T hücrelerini dönüştürülebilir hale getirmek için gereklidir ( Şekil 4'teki tipik sonuca bakın). Timositlerin ve OP9-DL4 hücrelerinin birlikte kültürlenmesinin bir T25 şişesini kontrol olarak kullanılmak üzere ayırın (dönüştürülmemiş). Transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için transdübe edilmemiş timositler (adım 9.1) negatif bir kontrol olarak transdübe edilmemiş timositlerle birlikte boyanacaktır. Transdüse edilmemiş timositler, transgen ekspresyonunun hücre farklılaşması üzerindeki etkisini ölçmek için de kullanılabilir. Sitokin içeren ortamı 1 ay sonra atın.</li>
</ol>8. Retrovirüsün süpernatanttan toplanması ve timositleri dönüştürmek için kullanılması (Gün 8-9)
<ol><li>6 delikli plakayı eğerek ve süpernatanı aspire etmek için pistonu çekerken plakanın altına 3-5 mL'lik bir şırınga yerleştirerek transfekte hücrelerden retrovirüsleri içeren süpernatantı toplayın. Ortamı 2 mL taze RPC ortamı ile değiştirin. Adım 8.9'daki ikinci transdüksiyon için hücreleri 20-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe etmeye devam edin.</li>
	<li>Retrovirüs süpernatantını 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden geçirin ve filtratı 50 mL'lik bir tüpte toplayın. NOT: Retroviral süpernatanı dondurmayın. Transdüksiyon için taze yapılmış bir virüs preparatı kullanın.</li>
	<li>Timositleri ve OP9-DL4 hücrelerini şişe yüzeyinden çıkarmak için agresif pipetleme ile OP9-DL4 kültüründen timositleri toplayın. OP9-DL4 hücrelerinin çoğunu çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve filtratı 50 mL'lik bir tüpte toplayın. NOT: OP9 hücreleri çok yapışkandır. Agresif pipetleme, OP9-DL4 hücrelerinin bir kısmını şişeden çıkarabilse de, bu işlem sırasında OP9-DL4 tek katmanının bozulması minimumdur ve OP9-DL4 hücreleri birincil timositlerden çok daha büyük olduğundan, çıkan OP9-DL4 hücreleri 40 μm hücre süzgeci ile filtrelenecektir. OP9-DL4 hücreleri hala% 80-90 oranında birleşikse, timositleri çıkarın ve aynı OP9-DL4 şişesinde yeniden plakalayın. Alternatif olarak, yeni bir OP9-DL4 şişesi hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Filtrattaki timositleri 8.3. adımdan itibaren 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin. Supernatan'ı atın.</li>
	<li>50 mL'lik tüpte, timositleri 0.5-1 mL OP9 ortamı + sitokinlerde yeniden askıya alın (bkz. adım 7.1). Virüsü içeren 1-2 mL RPC ortamı ekleyin (timosit ortamının iki katı kadar RPC ortamı). 8 μg heksametrin bromür / mL toplam hücre süspansiyonu elde etmek için heksametrin bromür (10 μg / μL stok konsantrasyonu) ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 850 × g'da santrifüj ederek spinülatın.</li>
	<li>Hücreleri şişe başına 6 mL OP9 ortamı + sitokinlerde yeniden askıya alın (bkz. adım 7.1) ve süspansiyonu OP9-DL4 hücre tek katmanına geri ekleyin. NOT: Alternatif olarak, dönüştürülmüş timositleri almaya hazır yeni OP9-DL4 şişeleri bulundurun. Timositler kullanılmış bir OP9-DL4 şişesine geri yerleştirilecekse, hücreleri sağlıklı tutmak ve% 80-90 akıcılık sağlamak için 1 saatlik timosit spinokülasyonu sırasında OP9-DL4 hücrelerine taze OP9 ortamı eklediğinizden emin olun.</li>
	<li>Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Retrovirüs içeren hücre süpernatanının yeni bir kuyusunu kullanarak 8.2-8.7 arasındaki adımları tekrarlayın.</li>
</ol>9. OP9-DL4 kültüründe transdüne timositlerin 2-5 gün boyunca muhafaza edilmesi veya gerektiğinde dondurulması (Gün 9+)
<ol><li>CD4, CD8, CD25 ve CD4423 gibi T hücre gelişim belirteçleri için timositleri boyayarak akış sitometrisi ile timosit farklılaşmasını değerlendirin. Tipik timosit farklılaşma sonuçlarına Şekil 5'te bakınız.</li>
</ol>

<ol><li>Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+development+made+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell development made simple.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (1), 67(2004).</li>
<li>Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+c-kit+receptor+in+the+adhesion+of+hematopoietic+stem+cells+to+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells.</a> Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).</li>
<li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).</li>
<li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+primitive+and+definitive+erythrocytes+from+different+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors.</a> Science. 272 (5262), 722-724 (1996).</li>
<li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell-derived+membrane+protein+that+supports+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells.</a> Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).</li>
<li>Jaleco, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+Notch+ligands+Delta-1+and+Jagged-1+in+human+lymphoid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).</li>
<li>Mohtashami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+Dll1-+and+Dll4-mediated+Notch+activation+levels+shows+differential+lymphomyeloid+lineage+commitment+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes.</a> Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).</li>
<li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).</li>
<li>Mazzucchelli, R., Durum, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-7+receptor+expression%3A+Intelligent+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).</li>
<li>Robey, E. A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+lymphocyte+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in lymphocyte development and function.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).</li>
<li>Lavaert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+scRNA-Seq+identifies+human+postnatal+thymus+seeding+progenitors+and+regulatory+dynamics+of+differentiating+immature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes.</a> Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).</li>
<li>Roh, K. H., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+approaches+for+regeneration+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Research%22%5BJournal%5D)">Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis.</a> Biomaterials Research. 20 (20), (2016).</li>
<li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li>
<li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+Generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).</li>
<li>Cramer, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+IL-7Ralpha+and+mutant+NRas+are+sufficient+to+induce+murine+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).</li>
<li>Treanor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-7+receptor+mutants+initiate+early+T+cell+precursor+leukemia+in+murine+thymocyte+progenitors+with+multipotent+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).</li>
<li>Yokoyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+leukemogenic+potential+of+an+interleukin+7+receptor+alpha+chain+mutant+in+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).</li>
<li>Simmons, A., Alberola-Ila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T+cells+and+T+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T cells and T cell precursors.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).</li>
<li>Retroviral systems. , Nolan Lab. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html">https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html</a> (2022).</li>
<li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+identification%2C+and+purification+of+murine+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51780(2014).</li>
<li>Gray, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+kinetics%2C+turnover%2C+and+stimulatory+capacity+of+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells.</a> Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).</li>
<li>Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+pathway+involving+four+phenotypically+and+functionally+distinct+subsets+of+CD3-CD4-CD8-+triple-negative+adult+mouse+thymocytes+defined+by+CD44+and+CD25+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression.</a> Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).</li>
<li>Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+mouse+thymocyte+development+using+multiparametric+flow+cytometry%3A+An+efficient+method+to+improve+an+8-color+panel+on+the+BD+FACSVerse%E2%84%A2+system%5BTitle%5D)+AND+%22BD+Biosciences%E2%80%93Application+Note%22%5BJournal%5D)">Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse™ system.</a> BD Biosciences–Application Note. , (2012).</li>
<li>Sakaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+thymic+T-cell+selection+due+to+a+mutation+of+the+ZAP-70+gene+causes+autoimmune+arthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice.</a> Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).</li>
<li>He, X., Park, K., Kappes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ThPOK+in+control+of+CD4%2FCD8+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment.</a> Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+CXXC+motif+in+CD3epsilon+is+critical+for+T+cell+development+and+TCR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling.</a> PLoS Biology. 7 (12), e1000253(2009).</li>
<li>Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOX+is+required+for+development+of+the+CD4+T+cell+lineage+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program.</a> Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı herhangi bir çıkar çatışması yoktur

Burada tarif edilen protokol, retroviral transfeksiyon ve ardından OP9-DL4 farklılaşma modeli ile timus kaynaklı DN (CD4-/CD8−) T hücre çalışmaları için özel olarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, hücre farklılaşmasının ardından bu transdüksiyon protokolüne tabi tutulacak hedef hücrelerin daha geniş bir disiplinlerarası faydaya sahip olması muhtemeldir. Bu nedenle, olgunlaşmamış timositlere ek olarak, fetal karaciğer veya kemik iliğinden türetilen hücreler gibi hematopoetik kök hücreler bu protokolde potansiyel olarak kullanılabilir.
OP9-DL4 sisteminin, hücre farklılaşması17 ve onkogenez15 dahil olmak üzere çeşitli yönlerden gen fonksiyonunu incelemek için etkili bir model olduğu kanıtlanmıştır. Hematopoetik progenitörlerin retroviral modifikasyonu, stabil genetik modifikasyonu mümkün kılan köklü bir teknik olsa da, OP9-DL4 sisteminde hücre farklılaşmasının indüksiyonu ile retroviral transdüksiyonun birleştirilmesi özen ve beceri gerektirir. Bu protokolle başarıya ulaşmanın kritik yönü, tüm adımların iyi koordine edilmesini sağlamaktır, çünkü protokol, sağlıklı tutulması gereken ve her bir spesifik aşama için gereken ideal birleşimde üç farklı hücre tipinin kullanılmasını içerir. Bunu akılda tutarak, bir sonraki adıma geçmeden önce her adımın uygulanmasından sonra tüm kalite kontrol kontrol noktası analizlerinin yapılması önemlidir. Bu, tüm adımların çalışmasını sağlayacaktır. Bu nedenle, tükenme, transfeksiyon ve transdüksiyon verimliliklerinin kontrol edilmesi, bu protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesi için önemlidir ( Şekil 4'teki transdüksiyon verimliliği için tipik bir sonuca bakınız). İyi primer hücre transdüksiyon verimliliği, yüksek viral titre ile bağlantılıdır. Genellikle, daha büyük kesici uçlar daha düşük virüs titrelerine nedenolur 18. Eğitim amacıyla, bu protokolle elde edilebilecek sonuçları temsil etmek için boş bir vektör kullanıyoruz. Deneyimlerimize göre, transdüksiyon ve transfeksiyon verimlilikleri, özellikle GFP gibi viral omurga eksprese eden muhabir genleri göz önüne alındığında, kesici uç boyutuna göre değişir. Birden fazla genin etkileşimini incelerken kullanılabilecek bir strateji, her geni farklı bir transfer vektörüne klonlamak, ardından bireysel virüs üretimi ve son olarak hedef hücrenin birlikte transdüksiyonudur. Bu durumda, tek başına dönüştürülen hücreleri ortadan kaldırmak ve yalnızca birlikte dönüştürülen hücreleri korumak için bir seçim adımı uygulanabilir.
OP9-DL1 / DL4 stromal besleyici katman hücre hatlarının çoğunun, DL1 veya DL4 yapıları7'nin bir parçası olarak GFP'yi ifade etmek için genetik olarak tasarlandığını belirtmek gerekir. Bu protokolde, GFP'yi de ifade eden retroviral bir vektör kullandık; Bununla birlikte, OP9-DL4 hücreleri tarafından eksprese edilen GFP proteininden daha parlaktır ve floresan mikroskobu altında ko-kültürü görselleştirirken transdüksiyon muayenesine müdahale etmez.
OP9 hücreleri, birçok pasajdan sonra, kültürde uzun süreler veya aşırı akıcılık koşulları altında adipositlere farklılaşır19. Bu, büyük vakuollerin gelişimi ile kanıtlanmıştır. Bu nedenle, bu özellikleri sunan OP9 hücreleri bu protokolde kullanılmamalıdır. Aşırı derecede birleşen retrovirüs üreticisi hücrelerin transfekte edilmesi, düşük bir virüs titresine neden olacaktır. Aslında, subconfluent aşama, hücrelerin en transfektabl olduğu zamandır. Ayrıca, düşük birleşimli retrovirüs üreticisi hücrelerin transfekte edilmesi, transfeksiyon sürecindeki hücre stresini azaltacak ve en yüksek virüs titresini verecektir.
Bu protokolde, virüs süpernatanını titre etmemekle birlikte, viral üretimin dolaylı olarak belirlenmesini önleyecek retroviral vektörde bir muhabir genin bulunmaması gibi bazı durumlarda veya deneysel tasarımın hedef hücre genomuna entegre edilmesi için daha doğru sayıda transgen kopyası gerektirdiği durumlarda virüs süpernatant titrasyonu düşünülmelidir. Bununla birlikte, retroviral vektör süpernatant titresinin, titrasyon sonuçları elde edilene kadar -80 °C veya 4 °C'de depolandığında önemli ölçüde azaldığını belirtmek önemlidir. Bu nedenle, transdüksiyon için taze hazırlanmış virüs süpernatantının kullanılması daha iyi transdüksiyon verimliliği sağlayacaktır.
Timus, DN sonrası evre timositleri olan çok sayıda çift pozitif (DP) timosit (% 85'ten fazla) ve yaklaşık% 10 tek pozitif15 hücre (CD4 veya CD8) içerir. DP hücreleri retroviral manipülasyon için in vitro olarak hayatta kalamazken, SP hücreleri dönüştürülemez. Bu nedenle, bu protokol retroviral vektör transdübl DN timositleri üretmek için uygulanabilir.

OP9 kemik iliği stromal hücre hattı, çeşitli progenitör kaynaklarından lenfopoez indüksiyonu için yararlı bir in vitro sistem sağlar1. OP9 hücrelerini kullanan ilk çalışmalar, makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) ekspresyonunun eksikliğinin, OP9 hücre hattının, daha sonra embriyonik kök hücreler (ESC'ler) için de gösterildiği gibi, kemik iliği kaynaklı hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) hematopoez ve B hücresi farklılaşmasını destekleme yeteneğine katkıda bulunduğunu göstermiştir2,3,4,5 . Önceki çalışmalarda, delta benzeri 1/4 eksprese eden OP9 hücrelerinin (OP9-DL1 / OP9-DL4) üretilmesi, T hücre soy bağlılığı6'nın indüksiyonunu sağladı ve timik olgunlaşma 7,8'i başarılı bir şekilde özetleme yeteneğini gösterdi. Kısaca, T hücre gelişimi, CD4 ve CD8 moleküllerinin sıralı ekspresyonu ile tanımlanmıştır. Olgunlaşmamış timositler "çift negatif" tir (DN, CD4-CD8-) ve CD44 ve CD25'in yüzey ekspresyonuna göre daha da alt bölümlere ayrılabilir. DN timositleri, farelerde CD8 ekspresyonu ve insanlarda CD4 ekspresyonu ile karakterize edilen olgunlaşmamış tek pozitif (ISP) aşama ile farklılaşır, bunu CD4 ve CD8'in birlikte ekspresyonu ile karakterize edilen çift pozitif (DP) aşama ve son olarak, CD4 veya CD89'un ekspresyonu ile karakterize edilen olgun tek pozitif aşama izler. HSC'ler, normalde T soyu farklılaşmasını indüklemek için timik epitel hücrelerinde eksprese edilen delta benzeri 4 (DL4) ile etkileşime giren Notch1 reseptörünü eksprese eder10. Bu nedenle, OP9-DL1/4 modeline olan ilgi giderek artmış ve bu yaklaşımın son yirmi yılda çok çeşitli uygulamalarda yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır 8,11,12,13. DL1 ve DL4'ün her ikisi de in vitro T hücre farklılaşmasını destekleyebilse de, in vivo olarak diferansiyel gereksinimler gösterirler ve birkaç çalışma, fare timik ortamının özetlenmesinde OP9_DL4 OP9_DL1'den daha verimli olduğunu göstermiştir 7,14.
OP9-DL1/4 sisteminin potansiyel uygulamaları arasında, bu sistemin DN hücrelerinin veya HSC'lerin retroviral vektörlerle transdüksiyonu ile kombinasyonuna özellikle ilgi vardır. Bu kombinasyon, normal T hücresi gelişimi ve lösemiogenez sırasında gen ekspresyonunu manipüle etmenin etkili bir yoludur ve ilgilenilen bir genin işlevini indüklemek veya inhibe etmek için etkili bir yöntem olduğu gösterilmiştir15,16,17. Bu model, lösemi15'i yönlendiren onkogenler arasındaki işbirliğini incelemek için özellikle başarılı bir şekilde kullanılmıştır, çünkü esnektir ve transgenik farelerin üretilmesinin aksine, çoklu gen kombinasyonlarının etkilerinin makul bir sürede incelenmesini sağlar. Dahası, onkogenlerin normal hücrelere sokulmasının etkilerini değerlendirmek için daha önce benzer modeller kullanılmıştır15,16,17. Ek olarak, retroviral transdüksiyon, transgen entegrasyonu için hücrelerin bölünmesini gerektirir18 ve lentiviral transdüksiyon, transgen entegrasyonu için hücrelerin bölünmesi ihtiyacını ortadan kaldırarak bu sınırlamanın üstesinden gelirken, lentiviral vektörleri kullanarak DN timositlerinin başarılı bir şekilde transdüksiyonunu başaramadık. Bu nedenle, OP9-DL1 / DL4, hematopoetik progenitör hücrelerin büyümesi için uygun bir araçtır.
OP9-DL4 üzerindeki transdüse timositlerin lenfopoezi için standart protokol, başarılı bir sonuç elde etmek için dikkatlice gerçekleştirilmesi gereken bir dizi koordineli adımı içerir. Bunlar uzun yıllardır topluma iyi hizmet eden teknikler olmasına rağmen, literatürde mevcut olan protokoller genellikle parçalanmıştır. Sonuç olarak, her laboratuvar prosedürün farklı aşamalarını uyarlamak ve optimize etmek zorunda kalır ve bu da zaman alıcı olabilir. Burada, bu protokol DN timositlerinin fare timumundan izolasyonunu, ardından daha fazla fonksiyonel analiz için OP9-DL4 stromal hücrelerinde retroviral transdüksiyon ve ko-kültürü tanımlamaktadır. Bu yerleşik protokolün primer timositlerin transdüksiyonunda etkili ve tekrarlanabilir olduğu, ardından OP9-DL4 hücrelerinde farklılaşma veya T hücreli akut lenfoblastik lösemiindüksiyonu 15 olduğu gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lizis tamponu</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Mikro boncuklar</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8 Mikro boncuklar</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-401</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5910R</td><td>eppendorf</td><td>5942IP802353</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu HyClone FBS</td><td>ThermoScientific</td><td>&nbsp; SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>LD sütunları</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Glutamini alikotlarda dondurun ve taze çözülmüş glutamin</td></tr><tr><td>kullanın Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>P / N 52887</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alfa Orta</td><td>Gibco</td><td>12561-072</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM I İndirgeyici Serum Ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.2</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>pcL-Eco Plazmid Addgene</td><td></td><td>12371</td><td></td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pMIG Plazmid</td><td>Addgene</td><td>6492</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Ön Ayırma Filtreleri</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant hFLT-3L</td><td>PeproTech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Retrovial paketleme hücre hattı Phoenix-Eco</td><td>Orbigen</td><td>RVC-10002</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi (0.45 & mikro; m)</td> <td>Kırlangıç</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

t hücreli lösemide onkogenleri İncelemek için delta benzeri 4 eksprese eden stromal hücreler Üzerinde murin timositlerinin ko-kültürü ve transdüksiyonu

Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia

Transdüe fare olgunlaşmamış timositleri, delta benzeri 4 eksprese eden kemik iliği stromal hücre hattı ko-kültür sistemi (OP9-DL4) kullanılarak in vitro olarak T hücrelerine ayrılabilir. Retroviral transdüksiyon, transgen entegrasyonu için hücrelerin bölünmesini gerektirdiğinden, OP9-DL4, hematopoetik progenitör hücrelerin yetiştirilmesi için uygun bir in vitro ortam sağlar. Bu, normal T hücresi gelişimi ve lösemiogenez sırasında belirli bir genin ekspresyonunun etkilerini incelerken özellikle avantajlıdır, çünkü araştırmacıların transgenik fareler üretmenin zaman alıcı sürecini atlatmalarına izin verir. Başarılı sonuçlar elde etmek için, farklı hücre tiplerinin eşzamanlı manipülasyonunu içeren bir dizi koordineli adım dikkatlice gerçekleştirilmelidir. Bunlar çok iyi kurulmuş prosedürler olmasına rağmen, literatürde ortak bir kaynağın bulunmaması genellikle zaman alıcı olabilecek bir dizi optimizasyonun gerekli olduğu anlamına gelir. Bu protokolün primer timositlerin transdüksiyonunda etkili olduğu ve ardından OP9-DL4 hücrelerinde farklılaşmada etkili olduğu gösterilmiştir. Burada ayrıntılı olarak, OP9-DL4 stromal hücreleri üzerinde retroviral olarak dönüştürülmüş timositlerin ko-kültürü için hızlı ve optimize edilmiş bir rehber olarak hizmet edebilecek bir protokol bulunmaktadır.

Tükenme verimliliği, immünomanyetik hücre ayrımından (MACS) sonra CD4 ve CD8 için manyetik olarak etiketlenmemiş hücre fraksiyonunu etiketleyerek ve bunu iki boyutlu iki değişkenli bir nokta grafiği üzerinde analiz ederek akış sitometrik olarak değerlendirilebilir (Şekil 3). Çift negatif (CD4-, CD8-) hücrelerin iyi bir verimi, Şekil 3'te gösterildiği gibi% 95 veya üstüdür. Düşük verimin en yaygın nedenlerinden ikisi, hücre sayısına ve kolon kapasitesini aşan etiketli hücrelerin sayısına bağlı olarak mikroboncukların yanlış hesaplanmasıdır. Etiketli hücre sayısına göre doğru sayıda MACS sütununun seçilmesi önerilir. Timositlerle çalışırken, etiketli hücrelerin sayısı (DP ve SP hücreleri) neredeyse toplam hücre sayısına eşittir (% 96'dan fazla). Hücre sayımı otomatik bir hücre sayacında, bir Neubauer odasında veya herhangi bir alternatif yöntemle yapılabilir. Sonuç olarak, hücre sayımı için ayrılan hacimlerin, belirli makineye ve seçilen sayım yöntemine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
Tükenmeden önce ve sonra mevcut olan hücrelerin sayısını belirlemek önemlidir. Bu hücre sayımları, gerekli LD tükenme kolonlarının sayısını hesaplamak ve DN timositlerini uygun sayıda OP9-DL4 şişesine eşit olarak dağıtmak için gereklidir. Akış sitometrisi kontrolleri (etiketlenmemiş hücreler, CD4 için etiketlenmiş hücreler ve CD8 için etiketlenmiş hücreler), daha fazla hücre içerdiğinden, ayrılmış tükenme öncesi numune ile gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, hücrelerin çoğunun sütun içinde tutulması beklendiğinden, etiketlenecek tükenme sonrası örnek daha yüksek bir hacim gerektirecektir. Sonuç olarak, seçilen etiketleme protokolüne göre ayarlamalar yapılması gerekebilir.
Bir floresan geni gibi taranabilir belirteçleri ifade eden vektörler kullanıldığında, transfeksiyon ve transdüksiyon floresan mikroskobu ile kabaca ve ampirik olarak değerlendirilebilir (Şekil 2<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig05large.jpg" target="_blank"></a>

Bu protokol, çift negatif timositlerin fare timumundan izolasyonunu, ardından daha fazla fonksiyonel analiz için delta benzeri 4 eksprese eden kemik iliği stromal hücre hattı ko-kültür sisteminde (OP9-DL4) retroviral transdüksiyon ve ko-kültürü tanımlar.

T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line ...

Olgunlaşmamış timositlerin retroviral vektörlerle transdüksiyonu ve bu hücrelerin OP9 DL4 stromal hücreler üzerinde kültürlenmesi zorlu bir tekniktir. Bu ayrıntılı protokol, bu sistemleri optimize ederken araştırmacılara zaman ve emek kazandıracaktır. Bu teknik, genetik modifikasyonların olgunlaşmamış T hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için esnek bir in vitro sistem sağlar ve T hücresi gelişimi ve kanseri incelemek için yararlı olabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Gisele Rodrigues olacak. Başlamak için, retrovirüs üretici hücrelerini, transfeksiyondan 18 ila 24 saat önce, iki mililitre retrovirüs üretici hücresi veya RPC ortamı içeren altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda% 70 ila% 90 oranında akıcılıkta tohumlayın. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.Hücreleri transfekte etmek için, ortamı transfeksiyondan bir saat önce taze RPC ortamı ile değiştirin. İki mikrogram yardımcı plazmid pCL-Eco ve iki mikrogram transfer plazmidi pMIG içeren dört mikrogram DNA'yı 250 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyrelterek dudak emaneti karışımları hazırlayın ve yavaşça karıştırın. Daha sonra, 10 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ve 250 mikrolitre azaltılmış serum ortamını karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Beş dakikalık inkübasyondan sonra, seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 20 ila 25 dakika inkübe edin. DNA ve transfeksiyon reaktif karışımının 500 mikrolitresini retrovirüs üretici hücrelerini içeren kuyucuğa dairesel bir hareketle hücrelerin üzerine bırakarak nazikçe ekleyin.Plakayı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın ve ardından plakayı 16 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Transfeksiyondan yaklaşık 16 saat sonra, eski ortamı iki mililitre taze RPC ortamı ile değiştirin ve hücreleri 20 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin. Timosit tek hücreli süspansiyonunu hazırlamak için, ötenazi farelerden hasat edilmiş bir timüsü bir Petri kabında beş mililitre PBS'ye yerleştirin.Steril cam slaytlar kullanarak, timusu slaytların buzlu yüzeyleri arasına yerleştirin ve timusu iki slayt arasında yuvarlayarak slaytları hafifçe ovalayın. Hücreleri toplamak ve kalan timik stromal dokuyu atmak için cam slaytları durulayın. Timik süspansiyonun beş mililitresini 30 veya 40 mikrometrelik bir hücre süzgeç filtresinden geçirin ve hücreleri 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin.Süpernatanı çıkardıktan sonra, bir dakika boyunca tüp başına bir mililitre ACK lizis tamponu ekleyerek kırmızı kan hücrelerini lize edin. ACK lizis tamponunu devre dışı bırakmak için beş mililitre hücre tükenme tamponu ekleyin, süspansiyonu 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin ve sayım için bir ila beş mililitre hücre tükenme tamponunda yeniden askıya alın. Hücreleri saydıktan ve 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj yaptıktan sonra, hücreleri 80 mikrolitre hücre tükenme tamponunda bir kez 10 ila yedinci kez yeniden askıya alın.Yedinci hücrelere CD4 ve CD8 mikroboncuklarının her birine 10 kez 10 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve buzdolabında karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Ardından, iki mililitre tükenme tamponu ile durulayarak ve akışı atarak bir tükenme sütunu hazırlayın.İnkübe edilmiş hücreleri, yedi hücrenin 10 katı başına bir ila iki mililitre tükenme tamponu ekleyerek yıkayın. 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Ardından, yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın ve etiketlenmemiş hücrelerin akışını toplayın.Kolonu bir mililitre tamponla iki kez yıkayın ve akışı toplayın. Tükenmeden önce toplanan 200 mikrolitre hücreyi, lekesiz, CD4 tek boyalı, CD8 tek boyalı ve CD4 ve CD8 çift boyalı dört FACS tüpüne bölerek tükenme verimliliği kontrollerini lekeleyin. Akış sitometri parametrelerini ayarlamak için lekesiz ve tek boyalı numuneleri kullanın.CD4 ve CD8 için boyamak için tükenmeden sonra toplanan 1.000 mikrolitre hücreyi kullanın ve tükenmeden önce toplanan çift boyalı numune ile karşılaştırın. Timositleri kültüre almak için, iki ila beş kez 10 ila beşinci ila bir kez 10 ila altıncı tükenme sonrası timositleri, sitokinler içeren OP9 ortamında% 80 ila% 90 oranında birleşen OP9 DL4 hücrelerinden oluşan bir T25 şişesine yerleştirin. Kültürü OP9 DL4 hücrelerinde 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.Retrovirüsü hasat etmek için, retrovirüsleri içeren süpernatantı transekte edilmiş hücrelerden toplayın, altı kuyucuklu plakayı eğerek ve daha sonra süpernatanı aspire etmek için pistonu çekerken plakanın altına üç ila beş mililitrelik bir şırınga yerleştirin. Retrovirüs süpernatantını 0,45 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin ve filtratı 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Ortamı iki mililitre taze RPC ortamı ile değiştirin ve ikinci iletim için hücreleri 20 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin.Timositleri ve OP9 DL4 hücrelerini şişe yüzeyinden çıkarmak için agresif pipetleme ile OP9 DL4 kültüründen timositleri toplayın. Çoğu OP9 DL4 hücresini çıkarmak ve filtratı 50 mililitrelik bir tüpte toplamak için hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Timositleri ve filtratı beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.Timositleri 0.5 ila bir mililitre OP9 ortamında sitokinlerle yeniden askıya alın. Virüsü içeren bir ila iki mililitre RPC ortamı ekleyin. Daha sonra, toplam hücre süspansiyonunun mililitresi başına sekiz mikrogramda heksametrin bromür ekleyin.Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca 850 G'de santrifüj ederek içeriği spinuküle edin. Hücreleri altı mililitre OP9 ortamında, şişe başına sitokinlerle yeniden askıya alın ve süspansiyonu OP9 DL4 hücre tek katmanına geri ekleyin. Gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Retrovirüs içeren hücre süpernatanının yeni bir kuyusunu kullanarak retrovirüs hasat adımlarını tekrarlayın. Dönüştürülen timositleri OP9 DL4 kültüründe iki ila beş gün bekletin veya gerektiğinde dondurun. Tükenme verimliliği, immünomanyetik hücre ayrımından sonra CD4 ve CD8 için manyetik olarak etiketlenmemiş hücre fraksiyonunu etiketleyerek ve bunu iki boyutlu iki değişkenli bir nokta grafiği üzerinde analiz ederek akış sitometrik olarak değerlendirildi.CD4 ve CD8 için iyi bir çift negatif hücre verimi, burada gösterildiği gibi% 95 veya üstüdür. Bir floresan geni gibi taranabilir belirteçleri ifade eden vektörler kullanıldığında, transeksiyon ve transdüksiyon floresan mikroskobu ile kabaca ve ampirik olarak değerlendirilebilir. Transdüksiyon verimliliği, etimositlerin OP9 DL4 monolayer'dan toplanmasıyla analiz edildi.ve akış sitometrisi ile bir floresan geninin ekspresyonuna bakmak. Muhabir gen olarak GFP ile boş bir retroviral vektör kullanılarak transdüksiyonun etkinliği, transdüksiyondan dört gün sonra OP9 DL4 hücrelerinde %84.2 T-hücre farklılaşması olarak gözlendi. OP9 DL4 hücreleri üzerindeki ko-kültür ve hücrelerin CD4, CD8, CD44 ve CD 25 için etiketlendiği transgen ekspresyonu tarafından indüklenen hücre farklılaşmasının akış sitometri analizi.Çift negatif timositlerin boş retroviral vektör pMIG ile transdüksiyonu, T hücresi gelişiminin transdüksiyon sürecinden etkilenmediğini gösteren, transdübe edilmemiş timositlerle yaklaşık olarak aynı oranlarda tek pozitif, çift pozitif, çift negatif ve alt aşamalarının çift negatif bir ila dört oranlarını sundu. Bu protokolü çoğaltmaya çalışırken en zor görev, farklı hücre türlerinin aynı anda koordineli bir şekilde yönetildiğinden emin olmaktır. Olgunlaşmamış timositlerde onkogenlerin aşırı eksprese edilmesi bazen normal T hücresi gelişimini etkileyebilir, bu nedenle akış sitometrisi ile mümünofenotipleme, hangi yöne gidileceğini öğrenmenin yararlı bir yoludur.Fetal tabaka hücrelerinde farklılaşan transdüe T hücrelerinin onkojenik potansiyeli, bağışıklık sistemi baskılanmış farelere enjeksiyonla daha fazla araştırılabilir.

co-culture-transduction-murine-thymocytes-on-delta-like-4-expressing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, CD40 aktivasyonu ve dokunulmazlık indüksiyonu eğitim için bir model antijen sunan hücre (APC) olarak da kullanılabilir C57BL / 6 farelerin dalak, fare B hücreleri genişleme prosedürü göstermektedir.

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da...

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Bir hücre sedimantasyon manifoldu/slayt aparatı kullanarak yapışık olmayan bağışıklık hücrelerinin radyal hareketliliğini in vitro olarak izlemek için bir protokol açıklıyoruz. Hücre göçü, tümör hücrelerinin tek katmanlarında veya hücre dışı matriks proteinlerinde izlenir. Işık ve floresan mikroskobu ile inceleme, hücre hareketliliğinin ve sitotoksik işlevselliğin gözlemlenmesine izin verir.

Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

Medüller timik epitel hücrelerinin in vitro olarak incelenmesi, mevcut 2D kültür sistemleri in vivo senaryoyu taklit etmediği için büyük ölçüde başarısız olmuştur. Burada tarif edilen 3D kültür sistemi - modifiye edilmiş bir cilt organotipik kültür modeli - mTEC proliferasyonunu, farklılaşmasını ve rastgele gen ekspresyonunun sürdürülmesini özetlemede üstün olduğu kanıtlanmıştır.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Tek bir T hücre reseptörü (TCR) retroviral tabanlı in vivo ekspresyon sistemi için hızlı ve esnek bir protokol sunuyoruz.  Retroviral vektörler, TCR transgenik farelere alternatif olarak in vivo olarak tek bir TCR'nin T hücresi gelişimini ve işlevini incelemek için kemik iliği progenitör hücrelerini dönüştürmek için kullanılır.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

Bu el yazması, transdüksiyon-transplantasyon fare modelleri oluşturmak için kullanılan metodolojinin bir tanımını sağlar. Kemik iliği nakli yapılırken kaçınılması gereken teknik hataların ayrıntılı bir açıklaması yapılır. Yüksek viral titre, transfeksiyon / transdüksiyon ve ışınlamanın önemi hakkında net bir anlayış kazanılmalıdır.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Burada, sitokin ile transdüksiyona sokulmuş bir stromal hücre hattının haftalık intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla, hastadan türetilen ksenograft (PDX) farelerde eksojen sitokinin üretilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, PDX'in kullanımını genişletir ve bir çok PDX modelinde geçici veya sürekli dış kaynaklı sitokin verme seçeneği sunar.

Hastadan türeyen Xenograftlarda Exogenous Cytokine&#39;in Sitokinle Transmurgated Stromal Hücre Hattı İle Enjeksiyon Vasıtasıyla İfade Edilmesi

Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Mevcut protokol, önceden tedavi edilmiş tümör hücreleri ile allojenik bir ko-kültür sisteminde insan T hücresi stimülasyonunun ex vivo analizine izin veren deneysel bir iş akışını açıklamaktadır.

Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi

Öğrenin, fare timositlerini izole edip retroviral transdüksiyon ve OP9-DL4 hücreleri üzerinde ko-kültürle T hücreli gelişimi ve kanser araştırmaları için genetik modifikasyon etkilerini inceleyin.

T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu (Video) | JoVE Journal

T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu

Daha fazla video keşfet