Name: Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Öğrenin, luciferaz dönüştürülmüş insan T hücreleriyle bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığını izlemeyi. Bu yöntem, tümör ortamında T hücre davranışlarını anlamak için tekrarlanabilir canlı görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu makalenin temsili sonuçlar bölümünde açıklanan deneylerde kullanılan lusiferaz yapılarını paylaştığı için Dr. Vladimir Ponomarev'e teşekkür eder.

Aşağıdaki prosedürler Memorial Sloan Kettering'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından değerlendirilmiş ve onaylanmıştır.
1. 293T hücrelerinin lusiferaz ile transfeksiyonu ve viral süpernatan hasadı
<ol><li>293T hücrelerin kültürü<ol><li>Her biri bir litre DMEM'e aşağıdakileri ekleyerek ortam hazırlayın: 110 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 11 mL penisilin-streptomisin.</li>
		<li>5 x 106 293T hücrelerini çözün ve yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan ortamla bir T175 şişesine aktarın.</li>
		<li>293T hücrelerini 6 gün boyunca her 3 günde bir 1:10 bölün. Hücrelerin% 90'dan fazla birleşmesine izin vermeyin.</li>
	</ol></li>
	<li>293T hücrelerinin transfeksiyonu NOT: Aşağıdaki reaktif miktarları, 293T hücrelerin bir T175 şişesinin transfekte edilmesi için hesaplanmıştır. Daha fazla şişe dönüştürülecekse buna göre ayarlayın.<ol><li>Bir pipet kullanarak iki 50 mL tüpün her birine 1,5 mL ortam aktarın. Bir tüpe 10 μg VSV-G plazmid, 20 μg Gag / pol ve 20 μg tıklama böceği kırmızı TD domates (CBR-TDR) lusiferaz plazmidi ekleyin ve karıştırın. Diğer tüpe 100 μL DNA in vitro transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırın. Her iki tüpü de oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Bu makalede açıklanan tüm plazmidler Dr. Vladimir Ponomarev tarafından sağlanmıştır.</li>
		<li>DNA in vitro transfeksiyon reaktifini içeren ortamı, DNA plazmidlerini içeren tüpe damla damla aktarın (yaklaşık 30 saniyenin üzerinde) ve bir pipetle hafifçe karıştırın. RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Bu 20 dakikalık inkübasyon sırasında, 5-10 mL% 0.05 tripsin ekleyerek 293T hücrelerini ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mL ortam ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj yapın. Hücreleri 1.5 mL ortamdaki yeniden askıya alın.</li>
		<li>DNA in vitro transfeksiyon reaktifini ve DNA plazmidlerini içeren ortamı 293T hücrelerine ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Bir T175 şişesine aktarın ve 18 mL ortam ekleyin. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Ertesi gün, hücreleri ayırmadan ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin. 18 mL taze ortam ile değiştirin. Bir inkübatörde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Viral süpernatan hasadı<ol><li>Viral süpernatantı buza konmuş bir pipet kullanarak çıkarın. Hücreleri ve kalıntıları pelet etmek için 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin. NOT: Hücre peleti büyükse, süpernatant çıkarıldığında hücreler muhtemelen şişeden bozulmuştur. Bu hücreler taze ortam ile yeni bir şişede tekrar kaplanabilir.</li>
		<li>Viral süpernatantı 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin.</li>
		<li>Viral süpernatantı hemen kullanın. Buz üzerinde veya 24 saate kadar 4 ° C'de saklayın veya uzun süreli depolama için -80 ° C'de dondurun.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lusiferaz ile aktive edilmiş insan T hücrelerinin genişlemesi ve transdüksiyonu
<ol><li>İnsan T hücrelerinin in vitro aktivasyonu
	<ol><li>Steril 15 mL'lik bir tüpe %0,1 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek, boncuklar ekleyerek (iki T hücresi başına bir boncuk), 2 dakika boyunca bir mıknatıs rafına yerleştirerek ve PBS'yi emerek boncukları yıkayın.</li>
		<li>Ortamı adım 1.1.1'de açıklandığı gibi hazırlayın, ardından IL-2'yi 30 IU / mL'lik son konsantrasyona ekleyin ve yıkanmış boncukları ekleyin. Aktive edilecek her iki milyon T hücresi için 2,5 mL ortam yapın.</li>
		<li>Bir hemositometre ve tripan mavisi leke kullanarak T hücrelerini (taze saflaştırılmış veya önceden saflaştırılmış, dondurulmuş, çözülmüş ve yıkanmış) sayın. Adım 2.1.2'de hazırlanan ortama T hücreleri ekleyin ve karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin. T hücreleri, hücrelerin kaynağına ve genel sağlığına bağlı olarak en az 20 kat genişleyecektir. Fareleri tedavi etmek için gereken sayıyı hesaplayarak ve 20'ye bölerek aktive edilecek T hücrelerinin sayısını belirleyin. Burada, ön deneylere dayanarak fare başına 20 x 106 T hücre kullanılmıştır.</li>
		<li>24 delikli bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda iki milyon T hücresi, boncuk ve IL-2 içeren 2.5 mL ortam plakası. Nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de kültür.</li>
		<li>Lusiferaz ile ne zaman transdübe edileceğini belirlemek için T hücrelerini önümüzdeki 3 gün boyunca her gün 20x mikroskop altında inceleyin. Hücreler bir araya toplandıklarında ve medyayı tükettiklerinde, kırmızı / pembeden açık turuncuya dönüştürdüklerinde hazırdırlar.</li>
	</ol></li>
	<li>Retronektin plakalarının hazırlanması NOT: Retronektin, gen iletimini arttırdığı için transdüksiyonda kullanılan plakaları kaplamak için kullanılır15.<ol><li>PBS'de 2 mL 20 μg / mL retronektin, işlenmemiş 6 delikli bir plakanın kuyucuğuna ekleyin. RT'de 2 saat veya 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Her iki milyon T hücresinin dönüştürülmesi için retronektin kaplı bir kuyu gereklidir.</li>
		<li>Plakanın tabanını çizmeden retronektini aspire edin.</li>
		<li>6 delikli plakadaki kuyucuk başına PBS'de (steril filtreli) 3 mL% 2 BSA ekleyin. RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Spinokülasyon<ol><li>BSA'yı plakanın tabanını çizmeden aspire edin.</li>
		<li>Kuyucukları bir kez kuyu başına 3 mL PBS ile yıkayın. Devam edin veya taze PBS ile değiştirin ve plakayı gece boyunca 4 ° C'de kapalı bırakın.</li>
		<li>Kuyucuk başına 2 mL CBR-TDR lusiferaz viral süpernatant (adım 1.3'te toplanır) ekleyin.</li>
		<li>32 °C'de 90 dakika boyunca 1.240 x g'de santrifüj.</li>
	</ol></li>
	<li>Iletim<ol><li>T hücrelerini sayın.</li>
		<li>Viral süpernatantı plakanın dibini çizmeden aspire edin.</li>
		<li>30 IU / mL insan IL-2 içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'unun (DMEM) 6 mL'sinde kuyu başına iki milyon T hücresi plakası.</li>
		<li>T hücrelerini günlük olarak inceleyin. T hücreleri, genellikle 2 gün sonra, neredeyse birleştiklerinde genişlemeye hazırdır.</li>
		<li>Hücreler neredeyse birleştiğinde, bir pipet kullanarak plakanın altından yavaşça yıkayın ve her bir kuyucuğu ayrı bir T75 şişesine aktarın. Şişe başına toplam 15 mL ortam için 9 mL ortam ekleyin.</li>
		<li>Ertesi gün, ek olarak 15 mL ortam ekleyin. Hücreler, bu ortam ilavesinden bir gün sonra farelere enjekte edilmeye hazır olmalıdır. Akış sitometrisi yaparak başarılı transdüksiyonu onaylayın (lusiferaz yapısı, PE kanalında görülebilen bir TD domates floroforu içerir)16.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde lusiferaz transdüslü T hücrelerinin engraftmanı
<ol><li>T hücrelerini enjeksiyon için hazırlayın ve sayın.<ol><li>T hücrelerini şişelerden çıkarın ve sayın. Hücreler, 20x-30x genişlediklerinde, genellikle aktivasyon sonrası 7. günde enjekte etmeye hazırdır.</li>
		<li>T hücrelerini 800 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. 2 mL ortamda tekrar askıya alın ve bir mıknatıs rafı kullanarak boncukları çıkarın.</li>
		<li>T hücrelerinin bispesifik antikorlardan ayrı olarak enjekte edileceği deneyler için, T hücrelerini sayın ve nihai konsantrasyonun 100 μL ortam başına 20 milyon T hücresi olacak şekilde yeniden askıya alın. 3.2 adımına geçin. Ex vivo silahlı T hücreleri (EAT) kullanan deneyler için adım 3.1.4'e atlayın.</li>
		<li>Ex vivo silahlı T hücrelerini kullanan deneyler için, T hücrelerini sayın ve bunları fare başına 20 milyon hücre ile her grup için ayrı ayrı 1,5 mL tüplere ayırın. Örneğin, her biri beş fareden oluşan üç grup varsa, her biri 100 milyon T hücreli üç adet 1,5 mL tüp hazırlayın.</li>
		<li>1,5 mL'lik tüpleri 800 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Ortamın T hücresi topaklarını rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın. Bispesifik antikorları içeren en fazla 50 μL'lik ortamda yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Bu çalışmada yapılan deneylerin amaçları doğrultusunda, laboratuvarda üretilen tescilli IgG-[L]-scFv T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorlar kullanılmıştır. T hücresi silahlandırması için, 20 x 106 T hücresi başına 5 μg antikor kullanın. Ticari olarak temin edilebilen bispesifik antikorlar da kullanılabilir.</li>
		<li>Her tüpe 1.450 μL ortam ekleyerek fazla antikorları yıkayın. 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj yapın, ortamı dikkatlice aspire edin ve 100 μL ortam başına 20 milyon silahlı T hücresi konsantrasyonunda yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
	<li>Farelere enjeksiyon ve engraftman<ol><li>Fareleri, 1 L / dak oksijende% 3.5 (v / v) inhale izofluran sağlayan bir odada uyuşturun. Arka bacak pedalı çekilme refleksi ortadan kalktığında fareler tamamen uyuşturulur. NOT: İşlem boyunca termal destek sağlayın.</li>
		<li>26 G'lik bir iğne kullanarak, fare başına geriye dönük olarak 100 μL ortama 20 milyon T hücresi enjekte edin.</li>
		<li>T hücresi sağkalımını in vivo olarak desteklemek için 1.000 U rekombinant IL-2'yi deri altından uygulayın.</li>
		<li>Bispesifik antikorları retroorbital olarak (T hücresi enjeksiyonu için kullanılmayan göz içine) veya intraperitoneal olarak uygulayın. Farelerin anesteziden kurtulmasına ve kafeslerine dönmesine izin verin. NOT: Yine, burada, laboratuarda üretilen tescilli antikorlar kullanıldı, ancak bunun yerine ticari olarak temin edilebilen antikorlar kullanılabilir. Buradaki deneylerde, doz başına fare başına 0.3-10 μg antikor uygulandı. Antikorlar 3-4 hafta boyunca haftada iki kez uygulandı.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lusiferaz transdüslü T hücreleri ile aşılanmış farelerin in vivo görüntülemesi
NOT: Bu adım, T hücrelerinin ve / veya antikorların farelere uygulandığı gün olması gerekmeyen görüntüleme gününde gerçekleştirilmelidir. Tipik olarak, lusiferaz transdüe T hücrelerinin uygulanmasından 24 saat sonra görüntüleme yapıyoruz.
<ol><li>D-luciferin'in hazırlanması<ol><li>1 g D-lusiferini 33.3 mL steril PBS içinde çözün (nihai konsantrasyon: 30 mg / mL).</li>
		<li>Çözünmüş D-lusiferini 33 x 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve tüpleri -20 ° C'de tutun.</li>
		<li>Görüntüleme gününde, görüntülenecek hayvan sayısı için yeterli miktarda 30 mg / mL D-lusiferin alikotunu çözün. Bir tüp 10 hayvan için yeterlidir. NOT: Kullanımdan sonra kalan D-luciferin'i tekrar dondurun. D-lusiferin en az beş donma / çözülme döngüsü için kararlıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>D-luciferin'in farelere uygulanması NOT: D-luciferin'i farelere uygulamadan önce, görüntüleme yazılımını açın ve sistemi başlatın. Kameranın soğuması birkaç dakika sürebilir ve bu, substratın uygulanmasından 5 dakika sonra görüntülemenin yapılabilmesini sağlamak için farelere D-lusiferin enjekte edilmeden önce yapılmalıdır.<ol><li>1 L/dak oksijende %3,5 (v/v) solunan izofluran sağlayan bir odada beş fareye kadar anestezi uygulayın. Arka bacak pedalı çekilme refleksi ortadan kalktığında fareler tamamen uyuşturulur.</li>
		<li>Fareler tamamen anestezi altına alındıktan sonra, 26 G iğne ile retroorbital enjeksiyonla fare başına 100 μL 30 mg / mL D-lusiferin (fare başına 3 mg) uygulayın. D-luciferin'i bir sonraki gruba uygulamadan önce bu fare grubunu görüntüleyin. Bir sonraki fare grubunu, önceki grup görüntülenirken anestezi uygulanacak izofluran odasına yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Lusiferaz transdüne T hücrelerinin görüntülenmesi<ol><li>Anestezi uygulanan fareleri görüntüleyicinin ışık geçirmez odasına taşıyın ve 0,5 L/dak'da %3 izofluran uygulamaya devam edin. Fareleri, ksenogrefti taşıyan kanat kameraya doğru bakacak şekilde yanlarına yerleştirin. Akciğerlerdeki T hücresi varlığını değerlendirmek için farelerle sırtüstü pozisyonda başka bir dizi görüntü alın.</li>
		<li>Edinme Denetim Masası'nı kullanarak Lüminesan, Fotoğraf ve Bindirme'yi seçin. Pozlama süresini otomatik, gruplamayı orta ve F/Stop değerini 1 olarak ayarlayın. Görüntüleri alın. İlk görüntüden sonra, sonraki görüntülerin doğrudan karşılaştırılabilmesi için pozlama süresini ilk görüntü için otomatik olarak hesaplananla eşleşecek şekilde ayarlayın. Piksel doygunluğu olmadan en parlak sinyali elde etmek için en uygun pozlama süresini belirlemek üzere birden fazla pozlama süresine sahip görüntüler yakalamak yararlı olabilir.</li>
		<li>Fareleri izoflurandan çıkarın, kafeslerine geri dönün ve uyanık ve ayakta olana kadar gözlemleyin.</li>
		<li>Tüm gruplar görüntülenene kadar adım 4.2.1'deki adımları tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Gökbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li>
<li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50(2018).</li>
<li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-%2FCD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li>
<li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li>
<li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005(2020).</li>
<li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-%5BL%5D-scFv+T+cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315(2020).</li>
<li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li>
<li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172(2020).</li>
<li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33%2Fanti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li>
<li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114(2021).</li>
<li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626(2020).</li>
<li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li>
<li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509(2021).</li>
<li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li>
<li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+in+human+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57(2021).</li>
<li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li>
<li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222(2021).</li>
<li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142(2021).</li>
<li>Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li>
<li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li>
<li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors%3A+Translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li>
</ol>

NKC, Y-mAbs Therapeutics'ten ticari araştırma hibeleri aldığını bildiriyor. NKC, MSK tarafından Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon / Lallemand ve Abpro-labs'a lisanslanan patentlerin mucidi ve sahibidir. MSK ve NKC'nin Y-mAbs'de finansal çıkarları vardır. NKC, Eureka Therapeutics'ten hisse senedi opsiyonları aldığını bildirdi. HFG ve MEC'nin konuyla ilgili herhangi bir açıklaması yoktur.

T-BsAb blinatumomab CD19 pozitif hematolojik maligniteler için onaylanmış olsa da, T-BsAbs'nin solid tümörlerde başarılı bir şekilde uygulanmasının çok daha zor olduğu kanıtlanmıştır. Epitel hücre adezyon molekülüne (EPCAM) karşı yönlendirilmiş bir T-BsAb olan Catumaxomab, yumurtalık kanseri hastalarında malign asitlerin tedavisi için onaylandı, ancak ilacın üretimi daha sonra ticari nedenlerle durduruldu19. Katı tümörler için başka hiçbir T-BsAb onaylanmamıştır, bu da bu tür bir tedaviyle ilişkil...

T hücresine bağlı bispesifik antikorlar (T-BsAbs), T hücrelerini bir bağlanma kolundan ve bir tümör antijenini başka bir bağlanma kolundan geçirerek poliklonal T hücrelerine yapay özgüllük sağlamak için kullanılan mühendislik antikorlarıdır. Bu teknoloji hematolojik kanserlere (CD19 hedefli blinatumomab1) başarıyla uygulanmıştır ve çok sayıda T-BsAb, çeşitli solid tümörler için preklinik ve klinik gelişim aşamasındadır2. T-BsAb'lar, poliklonal T hücrelerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) bağımsız bir şekilde meşgul eder ve bu nedenle insan lökosit antijenlerini (HLA'lar) aşağı regüle eden tümörler bile bu tür bir tedaviye duyarlıdır 3,4. T-BsAb'lar, T hücresinin ve tümör bağlama kollarının değerliği ve mekansal düzeni, alanlar arası mesafeler ve yarı ömrü etkileyen ve varsa efektör fonksiyonlarını indükleyebilen bir Fc alanının dahil edilmesindeki farklılıklarla düzinelerce farklı formatta geliştirilmiştir5. Laboratuvarımızdaki önceki çalışmalar, bu faktörlerin T-BsAbs'nin anti-tümör etkinliğini önemli ölçüde etkilediğini ve potens6'da 1.000 kata kadar farklılıklar olduğunu göstermiştir. Bu çalışma sayesinde, IgG-[L]-scFv formatını T-BsAbs için ideal platform olarak tanımladık (T-BsAb formatları hakkında daha fazla ayrıntı için Temsilci Sonuçlar bölümüne bakın) ve bu platformu GD2 (nöroblastom), HER2 (meme kanseri ve osteosarkom), GPA33 (kolorektal kanser), STEAP1 (Ewing Sarkomu), CD19 (B hücreli maligniteler) ve CD33 (B hücreli maligniteler)7 dahil olmak üzere hedeflere uyguladık. 8,9,10,11,12,13.
Katı tümörlerde T-BsAb tedavisinin başarılı bir şekilde uygulanmasındaki en büyük zorluklardan biri, tümörlere T hücresi kaçakçılığını sağlamak için immünosüpresif tümör mikroçevresinin (TME) üstesinden gelmektir14. Yukarıda tarif edilen T-BsAb etkinliğini etkileyen faktörler, T-BsAbs'nin tümörlere T hücresi homing'i etkili bir şekilde indükleme kabiliyeti üzerinde önemli bir etkiye sahiptir, ancak bu etkinin in vivo bir sistemde gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi zordur. Bu makalede, tedavi sırasında deneysel immün sistemi baskılanmış fare modellerinde çeşitli dokulara T hücre kaçakçılığını değerlendirmek için T-BsAbs'nin klinik öncesi çalışmalarında lusiferaz transdüne T hücrelerinin kullanımının ayrıntılı bir açıklaması sunulmaktadır. Bu yöntemin genel amacı, tümörlerde ve diğer dokularda T hücresi infiltrasyonunu değerlendirmek için bir araç sağlamanın yanı sıra, tedavi sırasında hayvanları feda etmeye gerek kalmadan T hücresi homing kinetiği ve kalıcılığı hakkında gerçek zamanlı bir bakış açısı sağlamaktır. Hücresel immünoterapilere odaklanan artan sayıda araştırmacı için, klinik öncesi hayvan modellerinde T hücrelerini in vivo olarak izleme yeteneği çok önemlidir. Diğer araştırmacıların bu tekniği kolayca çoğaltmalarını sağlamak için lusiferaz transdüne T hücrelerini izlemek için kullandığımız yöntemin kapsamlı ve ayrıntılı bir açıklamasını sunmayı amaçlıyoruz.

<table><tbody><tr><td>293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>CD3 / CD28 boncukları</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td> <td>11161D</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potasyum Tuzu</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNA in vitro transfeksiyon reaktifi (polijet)</td><td>SignaGen Laboratuvarları</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Gag/pol plazmid</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>GFP plazmid</td><td>Addgene</td><td>11150-DNA.cg</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomisin</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan IL-2</td><td>R& D Sistemleri</td><td>202-IL-010 / CF</td><td></td></tr><tr><td>Retronektin</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td> <td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G plazmid</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr></tbody></table>

luciferaz dönüştürülmüş İnsan t hücrelerini kullanarak bispesifik antikor kaynaklı t hücresi kaçakçılığını İzleme

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

T hücresini tutan bispesifik antikorlar (T-BsAbs), solid tümörler için klinik öncesi gelişim ve klinik testlerin çeşitli aşamalarındadır. Değerlik, mekansal düzenleme, alanlar arası mesafe ve Fc mutasyonları gibi faktörler, bu tedavilerin anti-tümör etkinliğini, genellikle T hücrelerinin tümörlere yönlendirilmesini etkileyerek etkiler ve bu da büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, aktif insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tarif ediyoruz, bu da T-BsAb terapi çalışmaları sırasında T hücrelerinin in vivo izlenmesine izin veriyor. T-BsAbs'nin T hücrelerini tümörlere yönlendirme yeteneği, tedavi sırasında birden fazla zaman noktasında kantitatif olarak değerlendirilebilir ve araştırmacıların T-BsAbs'nin anti-tümör etkinliğini ve diğer müdahaleleri tümörlerdeki T hücrelerinin kalıcılığı ile ilişkilendirmelerini sağlar. Bu yöntem, T hücresi infiltrasyonunu histolojik olarak değerlendirmek için tedavi sırasında hayvanları kurban etme ihtiyacını hafifletir ve tedavi sırasında ve sonrasında T hücresi kaçakçılığının kinetiğinin belirlenmesi için birden fazla zaman noktasında tekrarlanabilir.

Adım 4.3'te açıklandığı gibi, fareler farklı dokulardaki T hücrelerinin varlığını değerlendirmek için görüntüleme sırasında farklı pozisyonlarda yönlendirilebilir. Sırtüstü konumlandırma, enjeksiyondan sonra erken zaman noktalarında yaygın olan akciğerlerdeki T hücrelerinin değerlendirilmesine izin verir. Subkutan ksenogreft yukarı bakacak şekilde lateral pozisyonlama, tümöre T hücre kaçakçılığını en iyi şekilde değerlendirmek için kullanılır. Bu makalede açıklanan tüm deneyler için dişi C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm...

Burada, T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorların anti-tümör etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için yapılan çalışmalarda, bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığının tümörlere in vivo izlenmesini kolaylaştırmak için insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Bu yöntem, kullanıcıların homing kinetiğini değerlendirmek ve T hücresi kalıcılığını izlemek için T hücrelerini in vivo olarak kolayca izlemelerini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, akış sitometrisinde veya immünohistokimyada fedakarlık gerektirmeden aynı hayvan üzerinde birden fazla zaman noktasında tekrarlanabilmesidir. Bu teknik, diğer bağışıklık hücresi türlerini izlemek için de değiştirilebilir.293T hücrelerini kültürlemek için, 110 mililitre ısıl inaktive fetal sığır serumu ve 11 mililitre penisilin streptomisin ekleyerek bir litre DMEM hazırlayın. Altıncı 293T hücrelerine beş kez 10 kez çözün ve bunları DMEM içeren bir T175 şişesine aktarın. Hücreler% 90'dan fazla birleşene gelmeden önce hücreleri altı gün boyunca her üç günde bir ila 10 arasında bölün.Transfeksiyon için, 1,5 mililitre ortamı bir pipet kullanarak iki adet 50 mililitrelik tüpe aktarın. Bir tüpe 10 mikrogram VSVG plazmid, 20 mikrogram gag pol ve 20 mikrogram tıklama böceği kırmızı Domates veya TCMBDR lusiferaz plazmidi ekleyin ve karıştırın. Başka bir tüpe 100 mikrolitre DNA in vitro transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırın.Her iki tüpü de oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. DNA in vitro transfeksiyon reaktifini içeren ortamı, DNA plazmidlerini içeren tüpe damla damla aktarın ve bir pipetle hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.Kuluçka sırasında, beş ila 10 mililitre% 0.05 tripsin ekleyerek 293T hücrelerini ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mililitre ortam ekleyin ve beş dakika boyunca 800 G'de santrifüj yapın. Hücreleri 1,5 mililitre ortamda yeniden askıya alın.DNA in vitro transfeksiyon reaktifini ve DNA plazmidlerini içeren ortamı 293T hücrelerine ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süspansiyonu bir T175 şişesine aktarın. 18 mililitre medya ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, hücreleri ayırmadan ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin ve 18 mililitre taze ortam ile değiştirin. Yine, gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, buza konan bir pipet kullanarak viral süpernatantı çıkarın ve hücreleri ve kalıntıları pellet etmek için beş dakika boyunca 800 G'de santrifüj yapın.Viral süpernatantı 0.22 mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyin ve hemen buzun üzerine yerleştirin. İnsan T hücrelerinin in vitro aktivasyonu için,% 0.1 sığır serum albümini veya BSA içeren 10 mililitre PBS ve steril 15 mililitrelik bir tüpe iki milimolar EDTA ekleyin. Daha sonra boncukları yıkamak için bir tüpe boncuk ekleyin ve tüpü manyetik bir rafa yerleştirin.İki dakika sonra, PBS'yi tüpten çıkarın. DMEM'i hazırladıktan sonra, yıkanmış boncukları ve interlökin-2 veya IL-2'yi mililitre başına 30 uluslararası birimlik son konsantrasyona ekleyin. Bir hemo sitometre ve Trypan mavisi boya kullanarak T hücrelerini sayın.Saydıktan sonra, ortama istediğiniz sayıda T hücresi ekleyin ve karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin. 24 delikli bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda iki milyon T hücresi, boncuk ve IL-2 içeren 2.5 mililitre ortam plakası. Nemlendirilmiş% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede kültür.Lusiferaz ile ne zaman transdübe edileceğini belirlemek için T hücrelerini üç gün boyunca her gün 20X'lik bir hedef altında inceleyin. Daha sonra, bir RetroNectin plakası hazırlamak için, PBS'de mililitre başına iki mililitre 20 mikrogram RetroNektin ilave edilmemiş altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. RetroNektin'i plakanın tabanını çizmeden aspire edin ve altı kuyucuklu plakadaki kuyucuk başına PBS'de üç mililitre% 2 BSA ekleyin.Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, spinokülasyon için, BSA'yı aspire edin ve kuyucukları bir kez üç mililitre PBS ile yıkayın. Taze PBS ile devam edin veya değiştirin ve plakayı gece boyunca dört santigrat derecede kapalı bırakın.Ertesi gün, kuyu başına iki mililitre TCMBDR lusiferaz viral süpernatant ekleyin ve 32 santigrat derecede 90 dakika boyunca 1.240 G'de santrifüj yapın. Transdüksiyon için, T hücrelerini saydıktan sonra, viral süpernatantı aspire edin ve insan IL-2'nin mililitresi başına 30 uluslararası birim içeren altı mililitre DMEM'de kuyu başına iki milyon T hücresini plakalayın. T hücrelerini iki gün boyunca inceleyin.Hücreler neredeyse birleştiğinde, bir pipet kullanarak plakanın altından yavaşça yıkayın ve her bir kuyucuğu ayrı bir T75 şişesine aktarın. Şişe başına toplam 15 mililitre hacim için dokuz mililitre ortam ekleyin. Ertesi gün, 15 mililitre ortam ekleyin ve akış sitometrisi yaparak başarılı transdüksiyonu onaylayın.Fareyi uyuşturduktan sonra, 26 gauge'lik bir iğne kullanarak, geriye dönük olarak 100 mikrolitre ortama 20 milyon T hücresi enjekte edin. T hücresi sağkalımını in vivo olarak desteklemek için 1.000 ünite rekombinant IL-2'yi deri altından uygulayın. Daha sonra bispesifik antikoru retroorbital veya intraperitoneal olarak uygulayın.İn vivo görüntüleme için, anestezi uygulanmış bir farede 26 gauge iğne ile retroorbital enjeksiyon ile 100 mikrolitre üç miligram D-lusiferin uygulayın. Görüntü yakalamak için, fareyi görüntüleyicinin ışık geçirmez haznesine, ksenogrefti taşıyan yan taraf kameraya doğru bakacak şekilde yerleştirin. Edinme kontrol panelini kullanarak ışıldayan, fotoğraf ve bindirmeyi seçin.Pozlama süresini otomatik, gruplamayı orta ve f-stop olarak ayarlayın ve görüntüleri alın. İlk görüntüden sonra, sonraki görüntülerin doğrudan karşılaştırılabilmesi için pozlama süresini ilk görüntü için otomatik olarak hesaplananla eşleşecek şekilde ayarlayın. Akciğerlerdeki T hücresi varlığını değerlendirmek için fare sırtüstü yatarken başka bir dizi görüntü alın.Silahlı T hücreleri, tümöre silahsız T hücrelerinden daha hızlı kaçakçılık yaptı ve akciğerleri iki gün erken terk etti. T hücre infiltrasyonunun zaman içinde tümörlere kantitasyonu biyolüminesans ile ölçüldü ve tümör konturu üzerine entegre edilmiş piksel başına toplam sürü veya ışıma olarak ifade edildi. T hücresi kaçakçılığı, lusiferaz transdüne T hücrelerinin enjeksiyonundan sonraki 28 gün boyunca izlenebilir ve tedavi boyunca T hücresi homing ve kalıcılığının izlenmesine izin verir.DKO farelerde HER2 pozitif insan meme kanseri hastası kaynaklı ksenogreftlere T hücresi kaçakçılığı gösterilmiştir. Susturulmamış bir FC ile HER2 bispesifik antikoru ile tedavinin, kontrollü bir bispesifik antikora kıyasla tümör büyümesi üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Buna karşılık, tek başına veya bir K322A mutasyonu ile kombinasyon halinde N297A mutasyonu içeren HER2 bispesifik antikoru ile tedavi, tümör büyümesini tamamen durdurabilmiştir.Susturucu mutasyonları olan gruplar için, T hücresi lüminesans sinyali, enjeksiyon sonrası üçüncü günde daha yüksek bir zirveye ulaştı ve kontrollü bispesifik antikor ve susturulmamış HER2 bispesifik antikoru ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir seviyede devam etti. Nöroblastom hastası kaynaklı ksenogreftler taşıyan fareler, Ly6C pozitif makrofajların tükenmesinin, tümörlere yönelik T hücresini önemli ölçüde artırdığını, bunun da tümör büyümesinin azalmasına ve sağkalımın uzamasına neden olduğunu göstermiştir. Etki, osteosarkom hasta kaynaklı ksenogreftlerde daha belirgindi.Tümör antijeni STEAP1'i hedef alan bispesifik antikorlar arasında, IGGL SCFV formatı, tedavi süresince devam eden T hücrelerinin ilk dozundan sonraki altıncı günde önemli ölçüde daha fazla T hücresi infiltrasyonu ile sonuçlandı. Bu tür gözlemler in vitro sitotoksisite testleri ile tahmin edilmemiştir. T hücrelerini in vivo olarak izledikten sonra, kullanıcılar T hücrelerinin tümör veya diğer normal dokular içinde nerede bulunduğunu daha spesifik olarak belirlemek için immünohistokimya yapabilirler.

tracking-bispecific-antibody-induced-t-cell-trafficking-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için...

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu video, bir fare modelinde tümörlere bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığını izlemek için bir yöntemi göstermektedir. Luciferaz ile transdüksiyonlu efektör T hücreleri, deri altı tümör hücresi ksenogrefti olan bir fareye enjekte edilir. Daha sonra T hücrelerine ve tümör hücrelerine bağlanan bispesifik antikorlar sokulur. T hücrelerinin lokalizasyonu, biyolüminesan görüntüleme kullanılarak izlenir ve sinyalin büyüklüğü tümöre T hücresi infiltrasyonunun derecesini gösterir.

Tümörlere Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Trafiğini İzlemek için İn Vivo Bir Teknik

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Bir hücre sedimantasyon manifoldu/slayt aparatı kullanarak yapışık olmayan bağışıklık hücrelerinin radyal hareketliliğini in vitro olarak izlemek için bir protokol açıklıyoruz. Hücre göçü, tümör hücrelerinin tek katmanlarında veya hücre dışı matriks proteinlerinde izlenir. Işık ve floresan mikroskobu ile inceleme, hücre hareketliliğinin ve sitotoksik işlevselliğin gözlemlenmesine izin verir.

Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

Bir transgenik fare, T hücresi reseptörüne bağlanan bir 64Cu-modifiye edilmiş monoklonal antikorun hazırlanmasını takiben, T hücreleri, canlılık, fonksiyonellik, etiketleme stabilitesi ve apoptoz için analiz, in vivo olarak radyoaktif işaretli olan ve adoptif bir nefes yolu gecikmeli tipte aşırı duyarlılık ile farelere aktarıldı pozitron emisyon tomografisi / bilgisayarlı tomografi (PET / BT) ile invazif olmayan görüntüleme için reaksiyon.

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em&gt; In Vivo</em&gt; PET / CT ile hücre Trafik

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Burada, üretim ve retroviral iletim ve kullanımı karşı kurulan syngeneic A20 B hücreli lenfoma veya lymphodepleting olmadan BALB/c farelerde tedavi olarak fare CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik test için bir iletişim kuralı mevcut önceden Klima.

Syngeneic fare B hücreli lenfoma manken CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik değerlendirme için

Bu protokol, klinik olarak mevcut bir platformla kimerik antijen reseptörlerini in vivo olarak eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücrelerini invaziv olmayan bir şekilde izleme metodolojisini açıklamaktadır.

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Kaçakçılık reseptörlerinin retroviral transdüksiyonu ve reseptör aracılı organ ve mikroçevreye özgü lenfosit konumlandırmasını incelemek için rekabetçi hedef arama için geliştirilmiş protokoller sunuyoruz. Bu yöntem, bağışıklık hücresi kaçakçılığı mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunar ve gelecekteki temel ve terapötik araştırmalarda potansiyel uygulamalara sahiptir.

Farklı Doku Mikroortamlarında GPCR Aracılı T Hücresi Lokalizasyonunu Araştırmak için Verimli Retroviral Transdüksiyon ve Rekabetçi Hedef Arama

Öğrenin, luciferaz dönüştürülmüş insan T hücreleriyle bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığını izlemeyi. Bu yöntem, tümör ortamında T hücre davranışlarını anlamak için tekrarlanabilir canlı görüntüleme sağlar.

Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

Daha fazla video keşfet