Name: Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Keşfedin, akut lenfoblastik lösemi hasta kaynaklı ksenogreft fare modelinde CD19 hedefli kimerik antijen reseptörü T hücresi toksisitelerini değerlendirme yöntemini. Bu platform, klinik öneme sahip toksisite analizi için insan hücreleri kullanarak translatable bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R37CA266344, 1K99CA273304), Savunma Bakanlığı (CA201127), Mayo Clinic K2R boru hattı (SSK), Mayo Clinic Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi (SSK) ve Predolin Vakfı (RLS) aracılığıyla desteklenmiştir. Ayrıca, Mayo Clinic NMR Çekirdek Tesis personeline teşekkür ederiz. Şekil 1 BioRender.com'de oluşturuldu

Bu protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC A00001767) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC, Bios00000006.04) yönergelerini takip eder.
NOT: Farelerle çalışmak için kullanılan tüm malzemeler steril olmalıdır.
1. NSG farelerine busulfan enjeksiyonu
<ol><li>Erkek, 8-12 haftalık, bağışıklığı baskılanmış, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) fareler edinin ve enjeksiyondan önce tartın. NOT: İstatistiksel anlamlılık için, grup başına en az beş fare kullanılması ve bu deneyin dişi farelerle en az bir kez daha tekrarlanması önerilir.</li>
	<li>Busulfan'ı intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon için hazırlayın. 1 mL'lik bir insülin şırıngası kullanarak, şırıngayı tam olarak 30 mg / kg busulfan ile yavaş ve dikkatli bir şekilde doldurun, ardından farelere i.p enjeksiyonu yapın ve tekrar kafese yerleştirin.</li>
</ol>2. NSG farelerine TÜM hasta kaynaklı blastların (CD19+) enjeksiyonu
NOT: Bu protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC, Bios00000006.04) yönergelerini takip eder.
<ol><li>Nüks ve refrakter ALL'li hastaların periferik kanından primer lösemik patlamaları toplayın.</li>
	<li>Hedef hücreleri intravenöz (i.v.) enjeksiyon için hazırlayın.<ol><li>Bir hemositometre kullanarak CD19 + hedef hücrelerini sayın ve hücrelerin son hacmini ve konsantrasyonunu kaydedin. NOT: Hücre canlılığını belirlemek için, hücreleri sayarken tripan mavisi kullanılması şiddetle tavsiye edilir.</li>
		<li>Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyerek pelet haline getirin.</li>
		<li>Hücre peletini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 50 ×10 6 hücre/mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin ve buz üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Hedef hücreleri içeren 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpünü, hücreler tamamen homojen hale gelene kadar parmakla girdaplayın.</li>
		<li>1 mL'lik bir insülin şırıngası kullanarak, şırıngayı tam olarak 100 μL hazırlanan hedef hücrelerle yavaşça ve dikkatlice doldurun ve kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı hafifçe vurun. NOT: 100 μL'lik hacim, her fareye 5 × 106 hücre uygulayacaktır.</li>
		<li>Fareleri 5-10 dakika ılık ışık altına koyun. Kuyruk damarı tıkandığında ve çıplak gözle daha görünür hale geldiğinde, fareleri uygun bir hapsetme/kısıtlama odasına yerleştirin.</li>
		<li>Farenin kuyruğunu alkollü bir bezle silin. Hedef hücreleri doğrudan kuyruk damarına (i.v.) enjekte edin ve fareyi kafese geri yerleştirin. Hedef hücrelerin aşılanmasından sonra, fareleri günlük olarak veya yerel hayvan etik komitesi tarafından önerildiği şekilde izleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tümör aşılama değerlendirmesi
<ol><li>Hedef hücre enjeksiyonundan 6 hafta sonra başlayarak, periferik kandaki CD19 + hücrelerinin ekspresyonunu ölçmek için akış sitometrisi kullanarak tümör aşılamasını değerlendirin.</li>
	<li>CD19 + genişlemesini değerlendirmek için periferik kan testi<ol><li>CART19 hücre enjeksiyonundan 6-8 hafta sonra farelerden kan alın. NOT: Kan almak için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Bu protokol için submandibular kan alma tercih edilen yöntemdir.</li>
		<li>Fareyi% 5 izofluran içeren bir indüksiyon odasında izofluran ile uyuşturun. Anestezi sağlandıktan sonra, bir burun konisinden solunan izofluranın% 1-3'ünde tutun. NOT: Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürülmesi şiddetle tavsiye edilir.</li>
		<li>Fareyi hazneden çıkarın ve gevşek deriyi boynundan kavrayarak baskın olmayan elinizle tutun. Damarı mandibulanın biraz arkasında bir neşter ile delin. NOT: Damara girmek için sadece iğne ucu (1-2 mm) gereklidir.</li>
		<li>Kan damlarken, heparin kaplı bir tüpte en az 50 μL toplayın ve tüpü birkaç kez yukarı ve aşağı çevirerek iyice karıştırın. 30 μL kanı 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polistiren tüpe aktarın. NOT: Kalan kan için, tüpü 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17.000 × g'da döndürün. Serumu (süpernatan tabaka) temiz ve etiketli 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve −80 ° C'de saklayın (sitokin testinde kullanım için).</li>
		<li>Kanı içeren 5 mL'lik yuvarlak tabanlı tüpe 2 mL lizis tamponu (nükleaz içermeyen su kullanılarak 1x'e seyreltilmiş 10x amonyum klorür bazlı parçalama tamponu) ekleyin. Tüpü girdaplayarak çok iyi karıştırın. Kırmızı kan hücrelerinin uygun şekilde parçalanmasını sağlamak için tüpü oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.</li>
		<li>2 mL akış tamponu ekleyin (PBS, 0.2 g / L potasyum klorür, 0.2 g / L potasyum fosfat monobazik, 8 g / L sodyum klorür ve 1.15 g / L sodyum fosfat dibazik % 2 fetal sığır serumu ve% 1 sodyum azid içerir).</li>
		<li>Tüpü 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve 2 mL akış tamponu ekleyin. Bu yıkama adımını 2 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Tüpün içeriğini dikkatlice boşaltın. Tüpte kalan bir pelet ile az miktarda sıvıyı gözlemleyin. 100 μL akış tamponu ekleyin ve çok iyi bir şekilde yeniden süspanse edin.</li>
		<li>5 mL akış tüpünde kalan tüm sıvıyı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Her numunenin uygun şekilde etiketlendiğinden emin olun. İlgili kuyucuklara 100 μL akış tamponu ekleyin ve 96 oyuklu plakayı 650 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometrisi ile CD19+ hedef hücrelerinin genişlemesini değerlendirin (Şekil 2).<ol><li>0.3 μL canlı/ölü leke, 0.13 μg (2.5 μL) anti-insan CD19 antikoru, 0.06 μg (2.5 μL) anti-insan CD45 antikoru, 5 μg (2.5 μL) anti-fare CD45 ve 42.2 μL akış tamponu içeren bir ana karışım hazırlayın ve numune başına toplam 50 μL. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>150 μL akış tamponu ile yıkayın, ardından 650 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve peleti 195 μL akış tamponu ve 5 μL sayma boncuğu içinde yeniden süspanse edin.</li>
		<li>CD19 + hücre ekspresyonunun seviyesini belirlemek için bir akış sitometresinde edinin. Geçit ve analiz amacıyla, önce ileri ve yan saçılma özelliklerine dayalı olarak ilgilenilen popülasyonu (CD19+), ardından tek bir geçit popülasyonu ve ardından canlı hücreler geçit sağlar. Canlı hücreler kapılandıktan sonra, insan CD45 ile fare CD45 popülasyonunu değerlendirin ve insan popülasyonundan CD19 + hedef popülasyonunu kapılayın.</li>
	</ol></li>
	<li>70 μL'de bulunan miktarı belirlemek için nicelleştirin ve ardından denklem (1)'i kullanarak hücreler/μL cinsinden ifade edin: Mutlak CD19+ hücre sayısı = ([CD19+ hücreler/boncuk sayma] × 5 μL içindeki boncuk sayma sayısı)/70 NOT: CD19 + hücre genişlemesini değerlendirmek için periferik kan testini her 5 günde bir tekrarlayın. Yerel hayvan etik komitesi yönergelerine uygun olarak her 2 haftada bir kümülatif olarak 200 μL'den fazla kan toplamayın. Fareler ≥10 hücre/μL'lik bir hastalık yüküne ulaştığında, CART19 hücresine veya kontrol gruplarına randomize edin (bölüm 4).</li>
</ol>4. CART19 hücrelerinin in vivo olarak uygulanması
<ol><li>CART19 hücrelerinin hazırlanması (~ Gün 80): NOT: CART19 hücrelerinin oluşturulması daha önce 27,30,31 yayınlanmıştır. Bu prosedür, aseptik teknik ve kişisel koruyucu ekipman kullanılarak Seviye 2+ Biyogüvenlik Kabini içinde gerçekleştirilmelidir.<ol><li>CART19 hücrelerini bir su banyosu kabında (37 °C) çözdürün. Ardından, dimetil sülfoksiti çıkarmak için hücreleri ılık T hücresi ortamında (TCM) yıkayın. NOT: TCM, %10 insan AB serumu (h/v), %1 penisilin-streptomisin-glutamin (h/v) ve serumsuz hematopoietik hücre ortamından 27,30'dan yapılmıştır.</li>
		<li>CART19 hücrelerini 300 × g'da 8 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin ve ılık TCM'de 2 × 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin. CART hücrelerinin bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) gece boyunca dinlenmesine izin verin, ancak 16 saatten fazla olmamalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>CART19 hücrelerinin i.v. enjeksiyonu ile uygulanması (Gün ~ 80)<ol><li>CART19 hücrelerini sayın ve 300 ° C'de 8 dakika boyunca 4 × g'da döndürün.</li>
		<li>CART19 hücrelerini 10 mL PBS ile yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 8 dakika boyunca 300 × g'da döndürün.</li>
		<li>CART19 hücrelerini PBS ile 40 × 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin, hücreleri steril bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin.</li>
		<li>100 μL yeniden süspanse hücre iv enjekte ederek CART19 hücre kuyruk damarı enjeksiyonlarını (yukarıda detaylandırıldığı gibi) gerçekleştirin. NOT: 100 μL'lik bir hacim, her fareye 4 × 106 hücre uygulayacaktır. Negatif kontrol olarak bir grup tedavi edilmemiş fareyi dahil edin.</li>
	</ol></li>
</ol>5. CART19 hücresi ile ilişkili toksisitelerin değerlendirilmesi
<ol><li>CART19 hücre uygulamasından sonra, motor zayıflığı, kambur vücut ve vücut ağırlığı kaybı gibi sağlıklarındaki değişiklikleri değerlendirmek için fareleri günde 2 kez izleyin. NOT: Tüm bu fiziksel değişiklikler, bu modeldeki KRS semptomları ile ilişkilidir28.</li>
	<li>Fareler motor güçsüzlük ve kilo kaybı geliştirmeye başladığında (taban çizgisinden% 10-20 azalma), tümör yükünü analiz etmek için periferik kan toplayın ve bölüm 3'te açıklanan metodolojiye göre sitokinler için serum izolasyonu yapın (Şekil 3).</li>
	<li>Serum mikrosantrifüj tüplerini −80 °C'de saklayın ve serumları bir Multipleks testi kullanarak kemokinleri ve sitokinleri analiz etmek için kullanın (Şekil 4). NOT: Fareler arka bacak felci belirtileri gösteriyorsa, can çekişiyor veya uyuşuk görünüyorsa ve kilo kaybı, yiyecek ve / veya suya ulaşma yeteneklerini sınırlayan noktaya kadar vücut ağırlıklarının >% 20'si ise, ötenaziye tabi tutulacaklardır.</li>
</ol>6. MRI görüntüleme
NOT: İn vivo manyetik rezonans ve görüntü elde etmek için dikey delikli mıknatıslı klinik öncesi (küçük hayvanlar için) bir MRI tarayıcı kullanıldı32,33.
<ol><li>120 μL Gadolinyum + 880 μL salin solüsyonunu karıştırın ve 1 mL'lik bir insülin şırıngasına yükleyin. Her fareye 100 μL enjekte edin (i.p.). NOT: Gadolinyum, deneyin başlamasından 15-20 dakika önce enjekte edilmelidir.</li>
	<li>Fareyi 10-15 dakika boyunca bir indüksiyon odasında izofluran (% 2-3) kullanarak uyuşturun. NOT: Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürülmesi şiddetle tavsiye edilir.</li>
	<li>Fare omurgasını kemirgenlerle uyumlu yuva probunun üzerine yerleştirin. Ardından, dişlerini ısırma çubuğuna asarak fareyi konumlandırmaya devam edin.</li>
	<li>Farenin kafasını 25 mm hacimli bobine çekin ve izofluran anestezi sistemine bağlı burun konisini ayarlayın. Tarama süresince konumu korumak için ısırma çubuğunun düğmesini sıkın. NOT: Kontrastlı bir MRI taraması yapıyorsanız, cihazı delik mıknatısına yerleştirmeden en az 10 dakika önce gadolinyum (bu durumda) veya kontrast maddenin enjekte edildiğinden emin olun. Görüntüleme süresi boyunca, fareler burun konisi yoluyla havada% 2-3 izofluran solunarak uyuşturulacak ve solunum hızları eş zamanlı olarak izlenecektir.</li>
	<li>Solunum değerlendirmesi için bir solunum/solunum izleme cihazı kullanın. NOT: Anesteziye uzun süre maruz kalma nedeniyle olası hipotermiyi önlemek için vücut ısısının da değerlendirilmesi önemlidir. Vücut ısısını kontrol etmek için ısı yastıklarının kullanılması tavsiye edilir.<ol><li>Solunum monitörü probunu diyaframa yakın bir yere takın ve cerrahi bantla sabitleyin. Farenin durumunun stabil olması için solunum hızını dakikada 20-60 nefes arasında tutun. NOT: Bu oran daha stabil MRI görüntüleri sağlar ve elde edilen görüntüde hareket artefaktlarını önler. Solunum hızı dakikada 20-60 nefes aralığından yüksekse, izofluran konsantrasyonunu arttırın. Solunum hızı dakikada 20 nefesten azsa, anestezi çok derindir; Bu nedenle konsantrasyonun azaltılması gerekir.</li>
	</ol></li>
	<li>Hayvan sondasını dikey delikli küçük hayvan MRI sistemi içindeki küçük deliğe yerleştirin. Hayvanın kafasını bobinin ortasına ayarlayın. Dik durabilmesi için cihazı kilitle sabitleyin ve cihazı bilgisayara bağlayın.</li>
	<li>Tarama konumlarını ve tarama türlerini ayarlamak için yazılımı (örneğin, Paravision) açın ve kullanın. Tüm deney grupları için tutarlı tutarken optimal eksenel ve sagital pozisyonları belirleyin. NOT: Gerçek tam uzunlukta MRI taramalarından önce referans olarak bir deneme taramasının alınması önerilir.</li>
	<li>MRG veri toplamaya devam edin (daha önce açıklandığı gibi32,34,35,36). Aşağıda belirtilen önerilen kurulumu kullanarak hem T1 ağırlıklı hem de T2 ağırlıklı MRI görüntüleri elde edin.<ol><li>T1 ağırlıklı MRG görüntüleri için, 300 ms tekrarlama süresi (TR), 9,5 ms yankı süresi (TE), 4 cm x 2 cm x 2 cm görüş alanı (FOV) ve 192 x 96 x 96 matris ile T1 ağırlıklı çok kesitli multiecho (MSME) dizisi kullanın.</li>
		<li>T2 ağırlıklı MRG görüntüleri için, TR 300 ms, TE 9.5 ms, FOV 4 cm x 2 cm x 2 cm ve 192 x 96 x 96 matris ile Çok Kesitli Multiecho (MSME) dizisi kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Taramalar tamamlandıktan sonra probu delikten çıkarın. Dişleri ısırma çubuğundan çıkararak fareyi nazikçe çıkarın. Hayvanı tamamen bilinçli olana ve yeterli motor fonksiyonunu yeniden kazanana kadar ayrı bir kafeste izleyin.</li>
	<li>Yazılımdan verilerin çıkarılmasından sonra, hiperyoğunluk bölgelerinin nicelleştirilmesi ve 3B hacim oluşturma (Şekil 4) için analiz yazılımı kullanın. NOT: Mümkünse, veri analizi için iki ayrı kör gözlemcinin olması şiddetle tavsiye edilir.</li>
</ol>

S.S.K., OCAR immünoterapisi alanında Novartis'e (Mayo Clinic, Pennsylvania Üniversitesi ve Novartis arasındaki bir anlaşma yoluyla) ve Mettaforge'a (Mayo Clinic aracılığıyla) lisanslanan patentlerin mucididir. R.L.S. ve S.S.K., CAR immünoterapisi alanında Humanigen'e lisanslı patentlerin mucitleridir. S.S.K. Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs ve Lentigen'den araştırma fonu alıyor.

Bu raporda, bir ALL PDX modeli kullanarak CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek için bir metodoloji tanımlanmıştır. Daha spesifik olarak, bu model, hastaların CART hücrelerinin infüzyonundan sonra sıklıkla yaşadığı yaşamı tehdit eden iki toksisiteyi, CRS ve NI'yi taklit etmeyi amaçlamaktadır. Klinikte gözlenen CART toksisitelerinin birçok ayırt edici özelliğini özetler: kilo kaybı, motor disfonksiyon, nöroinflamasyon, inflamatuar sitokin ve kemokin üretimi ve farklı efektör hücrelerin merkezi sinir siste...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

Kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, kanser immünoterapisi alanında devrim yaratmıştır. Nüks/refrakter akut lenfoblastik lösemi (ALL), büyük B hücreli lenfoma, manto hücreli lenfoma, foliküler lenfoma ve multipl miyelom 1,2,3,4,5,6,7 tedavisinde başarılı olduğu kanıtlanmıştır ve bu da son FDA onaylarına yol açmıştır. Klinik çalışmalardaki ilk başarıya rağmen, CART hücre tedavisi ile tedavi, genellikle şiddetli ve bazen ölümcül olan toksisitelere neden olur. CART hücre tedavisinden sonra en yaygın toksisiteler, immün efektör hücre ile ilişkili nörotoksisite sendromu (ICANS) olarak da adlandırılan CRS ve NI'nin gelişimini içerir8,9. CRS, CART hücrelerinin in vivo aşırı aktivasyonu ve büyük genişlemesi nedeniyle ortaya çıkar ve daha sonra interferon-γ, tümör nekroz faktörü-α, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve interlökin-6 (IL-6) dahil olmak üzere çoklu inflamatuar sitokinlerin salgılanmasına yol açar. Bu durum hipotansiyon, yüksek ateş, kılcal damar kaçağı sendromu, solunum yetmezliği, çoklu organ yetmezliği ve bazı durumlarda ölümle sonuçlanır10,11. CRS, CART19 hücre tedavisinden sonra vakaların% 50-100'ünde gelişir11,12,13. ICANS, CART hücre tedavisi ile ilişkili bir başka benzersiz advers olaydır ve genelleştirilmiş serebral ödem, konfüzyon, obtundasyon, afazi, motor güçsüzlük ve bazen nöbetler ile karakterizedir 9,14. Hastaların %70'ine kadar herhangi bir ICANS derecesi görülür ve hastaların %20-30'unda Derece 3-4 bildirilir 5,10,15,16. Genel olarak, CRS ve ICANS yaygındır ve ölümcül olabilir.
CART hücre tedavisinden sonra ICANS'ın yönetimi zordur. ICANS'lı hastaların çoğu, genellikle IL-6 reseptör antagonisti tocilizumab veya steroidler18 ile tedavi edilebilen CRS17'yi de yaşar. Önceki bir rapor, tocilizumab ile erken müdahalenin şiddetli CRS oranını azalttığını, ancak ICANS19'un insidansını veya şiddetini etkilemediğini ortaya koydu. Şu anda, ICANS için etkili bir tedavi veya profilaktik ajan yoktur ve önleyici stratejilerin araştırılması çok önemlidir20.
Miyeloid hücrelerin ve ilişkili sitokinlerin/kemokinlerin, CRS ve ICANS21'in gelişiminin ana itici güçleri olduğu düşünülmektedir. KRS, sitokinlerin aşırı yükselmesi ve T hücre genişlemesi ile doğrudan ilişkili olsa da, ICANS'ın patofizyolojisi büyük ölçüde bilinmemektedir22,23. Bu nedenle, mekanizmaları incelemek ve önleyici stratejiler geliştirmek için CART hücre tedavisinden sonra bu toksisiteleri özetleyen bir fare modeli oluşturmak zorunludur.
Şu anda CART hücrelerinin etkinliğini incelemek, optimize etmek ve doğrulamak ve ayrıca ilişkili toksisitelerini izlemek için kullanılan çok sayıda klinik öncesi hayvan modeli vardır. Bunlar, primat modellerine ek olarak sinjeneik, ksenogreft, immünokompetan transgenik, insanlaştırılmış transgenik ve hasta kaynaklı ksenogreft farelerini içerir. Bununla birlikte, bu modellerin her birinin dezavantajları vardır ve bazıları CART hücrelerinin gerçek etkinliğini veya güvenlik endişelerini yansıtmamaktadır24,25. Bu nedenle, çalışmanın amaçlanan hedefleri için en iyi modeli dikkatlice seçmek zorunludur.
Bu makale, ALL hastadan türetilmiş bir ksenogreft (PDX) in vivo model kullanarak CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri, CRS ve NI'yi değerlendirmek için kullanılan metodolojiyi açıklamayı amaçlamaktadır (Şekil 1). Spesifik olarak, burada açıklanan yöntemlerde, yazarların laboratuvarında üretilen CART19 hücreleri, daha önce açıklanan protokoller izlenerek kullanılır. Kısaca, insan T hücreleri, sağlıklı donör periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) bir yoğunluk gradyan tekniği ile izole edilir, 0. günde CD3/CD28 boncukları ile uyarılır ve 1. günde 4-1BB ve CD3ζ sinyal alanlarına kaynaşmış bir CD19 hedefli tek zincirli değişken fragmandan oluşan CAR'larla lentiviral olarak transdüksiyona tabi tutulur. Bu CART hücreleri daha sonra genişletilir, 6. günde boncukları çıkarılır ve 8. günde 26,27,28,29,30. günde dondurularak saklanır. Daha önce belirtildiği gibi, fareler lenfodeplesyon tedavisine tabi tutulur, ardından hasta kaynaklı lösemik blastlar (ALL) uygulanır28. İlk olarak, tümör aşılaması submandibular kan alma yoluyla doğrulanır. Uygun bir tümör yükünün oluşturulmasını takiben, CART19 hücreleri farelere uygulanır. Daha sonra, fareler refahı değerlendirmek için günlük olarak tartılır. NI'yi değerlendirmek için küçük hayvan manyetik rezonans görüntüleme (MRI), T hücresi genişlemesini ve sitokin / kemokin üretimini değerlendirmek için kuyruk kanaması ile birlikte yapılır. Aşağıda açıklanan tekniklerin, bir PDX modelinde CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri incelemek için bir model olarak kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; APC Anti-İnsan CD19</td><td>Biolegend</td><td>302211</td><td></td></tr><tr><td>Alkol Hazırlama Pedi</td><td>Wecol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>14.0 yazılımını analiz</td><td>edin AnalyzeDirect, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td></tr> <tr><td>Suni gözyaşı (Mineral yağ ve vazelin)</td><td>Akorn</td><td>17478-062-35</td><td>Göz kuruluğunu önlemek için topikal oftalmik jel</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution&nbsp;</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Kırmızı kan hücreleri parçalanan tampon</td></tr><tr><td>BD Micro-Fin IV insülin şırıngaları</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Brillian Violet 421 Anti-İnsan CD45</td><td>Biolegend</td><td>304032</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance II 7 Tesla&nbsp;</td><td>Bruker Biospin</td><td>N/A</td><td>MRI makinesi</td></tr><tr><td>Busulfan (NSC-750)</td><td>Selleckchem</td><td>S1692</td><td></td></tr><tr><td>CountBright mutlak sayma boncukları</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>akış sitometresi</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ERT Kontrol/Yolluk Modülü&nbsp;</td><td>SA Instruments</td><td>Model 1030</td><td>Küçük Hayvan İzleme Solunum ve Geçit Sistemi</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Parlak Çizgi</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>İnsan AB Serumu; Erkek Bağışçılar; AB tipi; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Sıvı)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarma için</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Microvette 500 Lityum heparin</td><td>Sarstedt</td><td>20.1345.100</td><td>Kan alma tüpü</td></tr><tr><td>MILLIPLEX Huma / Sitokin / Kemokin Manyetik Boncuk Paneli</td><td>Millipore Sigma</td><td>Sitokinleri ve kemokinleri tanımlamak için</td> <td>HCYTMAG-60K-PX38</td> İmmünoloji Multipleks Testi</tr><tr><td>Omniscan</td><td>Ge Healthcare Inc.</td><td>0407-0690-10</td><td>Gadolinyum bazlı konstrast ajan</td></tr><tr><td>Pd Anti-Fare CD45</td><td>Biolegend</td><td>103106</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100x), Sıvı</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak Alt Polietilen Test tüpü</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azide,% 5 (a / h)</td> <td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Cerrahi Blade</td><td>Bard-Parker</td><td>371215</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre Ortamı</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

akut lenfoblastik lösemi hasta kaynaklı ksenogreft fare modeli kullanılarak kimerik antijen reseptörü t hücresi İlişkili toksisitelerin değerlendirilmesi

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, birden fazla CD19 + malignite tipinin tedavisi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır ve bu da yakın zamanda birkaç CD19 hedefli CART (CART19) hücre tedavisinin FDA onayına yol açmıştır. Bununla birlikte, CART hücre tedavisi, kendi morbidite ve mortalitelerini taşıyan benzersiz bir dizi toksisite ile ilişkilidir. Buna sitokin salınım sendromu (CRS) ve nöroinflamasyon (NI) dahildir. Klinik öncesi fare modellerinin kullanımı, hem CART etkinliğini hem de CART toksisitesini değerlendirmek için CART teknolojisinin araştırılması ve geliştirilmesinde çok önemli olmuştur. Bu adoptif hücresel immünoterapiyi test etmek için mevcut preklinik modeller arasında sinjeneik, ksenogreft, transgenik ve insanlaştırılmış fare modelleri bulunur. İnsan bağışıklık sistemini sorunsuz bir şekilde yansıtan tek bir model yoktur ve her modelin güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bu yöntem makalesi, CART19 ile ilişkili toksisiteleri, CRS ve NI'yi değerlendirmek için bir strateji olarak akut lenfoblastik lösemili hastalardan lösemik blastlar kullanan hasta kaynaklı bir ksenogreft modelini tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu modelin, klinikte görüldüğü gibi terapötik etkinliğin yanı sıra CART19 ile ilişkili toksisiteleri özetlediği gösterilmiştir.

Bu protokolün amacı, ALL'li hastaların tümör hücrelerinden bir PDX fare modeli kullanarak CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmektir (Şekil 1). İlk olarak, NSG fareleri, immünosupresif hale getirmek ve CART hücre aşılamasını kolaylaştırmak amacıyla i.p. busulfan (30 mg / kg) enjeksiyonları aldı28. Ertesi gün, TÜM hastalardan türetilen ~ 5 × 106 PBMC (i.v.) aldılar. Fareler, kuyruk kanaması testi ile ~ 13 hafta boyunca aşılama açısınd...

Burada, akut lenfoblastik lösemi hastası kaynaklı ksenogreft modelinin, CD19 hedefli kimerik antijen reseptörü T hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek ve izlemek için bir strateji olarak kullanıldığı bir protokol tanımlanmıştır.

Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Bu protokol, insan CAR-T ve tümör hücrelerini kullanır ve CART19 uygulamasıyla ilişkili toksisiteleri doğru bir şekilde gösterir. Bu nedenle, klinikte gözlemlenenleri özetlemek. Bu platformu kullanmanın temel avantajı, insan T hücrelerinin ve tümör hücrelerinin kullanıldığı çevrilebilir ve klinik olarak ilgili bir model sağlamasıdır.Bu model sadece CART19 ile ilişkili toksisitelerin verimli bir şekilde değerlendirilmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda gelişmiş tedavi stratejileri yoluyla bu toksisitelerin üstesinden nasıl gelebileceğimizi daha iyi anlamamızı sağlar. Başlamak için, motor zayıflığı, kambur vücut ve vücut ağırlığı kaybı gibi sağlıklarındaki değişiklikleri değerlendirmek için CART19 uygulanan fareleri günde iki kez izleyin. Fareler motor zayıflığı ve kilo kaybı geliştirdiğinde, tümör yükünü analiz etmek için periferik kanlarını toplayın.Ve makalede tarif edildiği gibi sitokinler için serum izolasyonu yapın. İzolasyondan sonra, serum mikro-santrifüj tüplerini 80 santigrat derecede saklayın ve multipleks tahlili kullanarak kemokinleri ve sitokinleri analiz etmek için cera kullanın. MRI görüntüleme için, 120 mikrolitre gadolinyumu 880 mikrolitre salin solüsyonu ile karıştırın ve bir mililitrelik bir insülin şırıngasına yükleyin.Hazırlanan çözeltinin 100 mikrolitresini intraperitoneal olarak her fareye enjekte edin. Fareyi uyuşturun ve kemirgen uyumlu beşik probuna yerleştirin. Sonra dişlerini ısırma çubuğuna asın.Farenin kafasını 25 milimetre hacimli bobine çekin ve izofluran anestezi sistemine bağlı burun konisini ayarlayın. Tarama süresince konumu korumak için ısırma çubuğunun düğmesini sıkın. Solunum değerlendirmesi için, bir solunum izleme cihazının probunu diyaframa yakın bir yere takın ve cerrahi bantla sabitleyin.Farelerin durumunun sabit kalması için solunum hızını dakikada 20 ila 60 nefes arasında tutun. Hayvan probunu Dikey Delikli Küçük Hayvan MRI sistemi içindeki küçük deliğe yerleştirin ve hayvanın kafasını bobinin ortasına yerleştirin. Kilidi kullanarak cihazı dik konumda sabitleyin ve cihazı bilgisayara bağlayın.Ardından, tarama konumlarını ve tarama türlerini ayarlamak için ParaVision yazılımını açın. Tüm deney grupları için tutarlı tutarken optimal sagital ve eksenel pozisyonları belirleyin. T1 ağırlıklı MRI verilerini toplamak için, 300 milisaniye tekrarlama süresi, 9,5 milisaniye yankı süresi, 4,00 X 2,00 X 2,00 santimetre görüş alanı ve 192 X 96 X 96 matris ile T1 ağırlıklı çok kesitli, çoklu eko dizisi kullanın.T2 ağırlıklı MRI görüntüleri için, benzer parametrelere sahip çok kesitli, çok yankılı bir dizi kullanın. Taramalar tamamlandıktan sonra, probu delikten çıkarın ve dişleri ısırma çubuğundan çıkararak fareyi nazikçe çıkarın. Yazılımdan veri çıkarıldıktan sonra, hiperyoğunluk bölgelerinin miktar tayini ve 3D hacim sunumu için analiz yazılımı kullanın CD19 + tümör hücresi popülasyonları, CART19 ile tedavi edilen fareler ve akış sitometrisi kullanılarak tedavi edilmeyen fareler arasında karşılaştırıldı.CART19 hücreleri ile tedavi edilen farelerde önemli ağırlık azalması gözlendi. Kilo kaybı, CART hücresi ile ilişkili toksisitelerle ilişkili olan CRS görünümünün bir belirtisi olarak kabul edilir. Multipleks bir test, CART19 uygulamasından önce ve sonra NSG fare serumunda sitokinlerin ve kemokinlerin ekspresyonunu ortaya çıkardı.T2 ağırlıklı görüntüler, CART19 ile tedavi edilen farelerde nöroinflamasyon sırasında ödem ve olası inflamatuar infiltrasyon kanıtlarını ortaya çıkardı. T1 ağırlıklı MRG, beyin parankiminde kontrast artışı gösterirken, vasküler geçirgenliğin arttığını gösterir. Kemirgen beyninin üç boyutlu rekonstrüksiyonları, beyindeki gadolinyum sızıntısının hacmini oluşturan vasküler geçirgenliğe karşılık gelen T1 hiperintens bölgelerine dayalı olarak birleştirildi.CART19 uygulamasından sonra farelerin günlük fiziksel izlenmesinin, periferik kanama ile birlikte, beyinde CRS veya nörotoksisiteyi gösteren herhangi bir değişikliği tam olarak değerlendirmek için MRG'ye devam etmenin en iyi göstergesi olacağını hatırlamak önemlidir. Bu teknoloji, ek CAR-T hücre tedavilerine yaygın olarak uygulanabilir ve bilim adamlarının yeni CAR-T hücrelerinden kaynaklanan potansiyel toksisiteleri verimli bir şekilde test etmelerini sağlayacaktır. Önerilen bu model, CAR-T hücresi ile ilişkili toksisitelerin nasıl izlenebileceğini, tedavi edilebileceğini ve yeni CAR-T-hücresi modellerini doğrulamak için kullanılabileceğini anlamada bir basamak taşıdır.

assessment-chimeric-antigen-receptor-t-cell-associated-toxicities

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Reseptör tirozin kinazlar, ektopik bir çok kanser olarak ifade edilmiştir ve akut lösemi terapötik hedefler olarak tespit edilmiştir. Bu makale, akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Mantle hücreli Lenfoma (MCL) bir B hücre bozukluğu tedavi etmek zordur ve eşit bir xenograft fare modeli eğitim ve tedavi geliştirmek için birincil MCL kurmak zordur. Burada, onun temel Biyoloji anlamak farelerde MCL xenografts başarılı kurulması açıklayın.

Tümör Engraftment insan Mantle hücreli lenfoma, Xenograft fare modeli

Burada, üretim ve retroviral iletim ve kullanımı karşı kurulan syngeneic A20 B hücreli lenfoma veya lymphodepleting olmadan BALB/c farelerde tedavi olarak fare CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik test için bir iletişim kuralı mevcut önceden Klima.

Syngeneic fare B hücreli lenfoma manken CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik değerlendirme için

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Burada, bir xenogeneic Graft-versus-Host hastalığı (xenoGVHD) modelinde hastalığı teşvik etmek ve puan vermek için bir protokol sunuyoruz. xenoGVHD, insan T hücrelerinin bağışıklık bastırılmasını incelemek için bir in vivo modeli sağlar. Ayrıca, immunobastırma ölçmek için bir araç olarak dijital PCR ile dokularda insan T hücrelerinin nasıl algılanmasını açıklar.

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Bu protokol, immüno-onkoloji çalışmaları için insan bağışıklık sistemi (HIS) farelerinin neslini özetlemektedir. Bu modelde implante edilen insan tümörleri üzerinde insan immünoterapötiklerini test etmek için bu modelin kullanımındaki talimatlar ve hususlar, insan bağışıklık sisteminin tümöre tepkisini karakterize etmeye vurgu yapılarak sunulmuştur.

İnsan Tümörleri Taşıyan İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde Kanser İmmünoterapötiklerinin Test Edilmesi

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Bu protokol, enjeksiyondan 4 gün sonra meydana gelen, hasta kaynaklı B ve T akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlemesini tanımlar.

Burada: Ovo Hasta Kaynaklı Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerinin Ksenogreftlenmesi (PDX-ALL)

Protokol, indüksiyon kemoterapisine yanıtın dinamiklerine dayalı olarak akut lenfoblastik löseminin nüksetmesine neden olan bir fare modelini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Akut Lenfoblastik Lösemi için İndüksiyon Kemoterapisine Nüks Löseminin Murin Modeli

Keşfedin, akut lenfoblastik lösemi hasta kaynaklı ksenogreft fare modelinde CD19 hedefli kimerik antijen reseptörü T hücresi toksisitelerini değerlendirme yöntemini. Bu platform, klinik öneme sahip toksisite analizi için insan hücreleri kullanarak translatable bir model sunar.

Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet