Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu

Bu protokol, araştırmacıların doğal mesane ürotelyumunda CDNA'ları veya SIRNA'ları eksprese etmelerine izin veren yöntemleri açıklar. Bu tekniğin temel avantajları, göreceli basitliği, cDNA'ları, siRNA'ları ürotelyumda yüksek verimlilikle ve nispeten kısa bir süre içinde ifade etme yeteneğidir. Bu tekniğin en zor kısmı kateterizasyondur.

Bununla birlikte, genel tekniğin öğrenildikten sonra ustalaşması nispeten kolaydır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda Araştırma Uzmanı IV olan Giovanni Ruiz olacak. Başlamak için, anestezi uygulanan fareyi burun konilerinin yanındaki bir ısıtma yastığına yerleştirin.

Protokol süresince hayvanı anestezi altında tutun. Farenin bir parmak tutamağı tutamıyla tamamen uyuşturulduğunu onaylayın. Mesaneye hava girmesini önlemek için, bir IV kateterinin plastik kateter kısmını ve ilişkili göbeği steril bir transfer pipeti veya şırınga kullanarak steril PBS ile doldurun.

Hayvan sırtüstü pozisyondayken, dış üretral meatusu% 70 alkol ile sürün. Daha sonra dış üretral meatusu oluşturan dokuyu yavaşça tutun ve ince forsepsler kullanarak hayvandan dikey olarak uzatın. Steril kateteri dış meatusa yerleştirin.

Diğer elinizi dikkatlice kullanarak kateteri üretral meatusa dikey olarak yaklaşık üç ila dört milimetre yerleştirin. Daha sonra dış meatusa yerleştirilen kateteri hayvanın kuyruğuna doğru indirin, bu da üretranın kasık kemiğinin altından geçen kısmına ve nihayetinde mesaneye girişini kolaylaştırır. Mesanedeki idrarın dışarı sızmasına izin verin.

Crede'in manevrasını yaparak kalan idrarı masaj yaparak ve alt karın bölgesindeki mesane yumruğuna hafifçe bastırarak çıkarın. Ürotelyumu transdüksiyona duyarlı hale getirmek için, kateter göbeğine PBS ile doldurulmuş steril bir mililitrelik bir şırınga takarak fare veya sıçan mesanesini yıkayın. Fare kesesine 100 mikrolitre steril PBS enjekte edin.

Şırıngayı kateter bağlantısından ayırdıktan sonra, PBS'nin boşalmasına izin verin. PBS'de çözünmüş% 0.1 N-dodesil-beta-D-maltosid 100 mikrolitre ve steril bir mililitrelik bir şırınga kullanılarak fare kesesine sterilize edilmiş 0.2 mikrometre filtre aşılayın. Şırıngayı yerinde bırakarak N-dodecyl-beta-D-maltoside'i mesanede 10 dakika tutun.

N-dodecyl-beta-D-maltoside'ı, şırıngayı ayırarak ve boşalmasına izin vererek mesaneden çıkarın. Virüsü mesaneye sokmak için kateter göbeğine steril bir mililitrelik bir şırınga takın ve fareler için 100 mikrolitre steril PBS'de seyreltilmiş 5.000.000 ila 100.000.000 IVP adenovirüs veya sıçanlar için 450 mikrolitre adenovirüsü mesaneye aşılayın. 30 dakika sonra, şırıngayı ayırın ve virüs çözeltisinin mesaneyi tek kullanımlık bir ped üzerine boşaltmasına izin verin.

Kalan virüs çözeltilerini pedi atarken emici bir mendille lekeleyin ve biyolojik olarak tehlikeli atıkları silin. Hayvanın iyileşmesine izin vermek için, izofluran akışını durdurun. Hayvanın kafesine geri dönmeden önce, özellikle de hayvanlar grup halinde barındırılıyorsa, iyileşmesine ve tamamen hareketli olmasına izin verin.

Transgen ekspresyonunun etkilerini, mRNA in situ hibridizasyon, Western lekesi veya immünofloresan gibi yöntemleri kullanarak tedaviden 12 ila 72 saat sonra analiz edin. Ürotelyal lizatların Batı leke analizi, transdüe edilmiş mesanelerin ürotelyumunda V5 etiketli insan büyüme hormonu ekspresyonunu ortaya çıkardı, ancak transdüne edilmemiş olanlarda değil. İfade ayrıca, insan büyüme hormonunu veya V5 epitop etiketini tanıyan antikorlar kullanılarak immünofloresan ile doğrulandı.

Western blot analizi, adenovirüs ile transdübe edilen sıçanlarda Claudin-2 ekspresyonunu doğruladı, ancak kontrollü bir GFP kodlayan virüs ile dönüştürülenlerde değil. İmmünofloresan analizi, virüs kodlayan Claudin-2 cDNA ile dönüştürülen ürotelyal şemsiye hücrelerinde eksojen Claudin-2 ekspresyonunu daha da doğruladı. İmmünofloresan ve tüm monte edilmiş veya kesitli urothelyumun konfokal mikroskopisi ile Sıkı Bağlantı Proteini 1'de eksojen Claudin-2'nin saptanması, hücre sitoplazmasında Sıkı Kavşak ve hücre içi Claudin-2 birikimlerinin varlığını ortaya koymuştur.

Görüntü alanı, transdüe edilmiş şemsiye hücrelerinin sayısını saymanın% 95'e yaklaşan bir verimlilik ortaya koyduğunu ve mesane duvarının tamamında sadece ürotelyumun dönüştürüldüğünü ve aşılanan adenovirüs tarafından başka hiçbir dokunun hedeflenmediğini göstermektedir. Kateterizasyon, protokolün amaçlandığı gibi çalışması için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, araştırmacıların normal ürotelyal biyolojiyi incelemelerine ve ayrıca protein aşırı ekspresyonunun veya az ekspresyonunun hastalığa yol açtığı koşulları anlamalarına olanak tanır.