Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu
6 Ekim 2022
Büyük miktarlarda rekombinant adenovirüslerin üretimi için yöntemler tanımlanmıştır, bu daha sonra transgenlerin ekspresyonuna veya endojen gen ürünlerinin aşağı regülasyonuna izin veren doğal kemirgen ürotelyumunu dönüştürmek için kullanılabilir.
Bu protokol, araştırmacıların doğal mesane ürotelyumunda CDNA'ları veya SIRNA'ları eksprese etmelerine izin veren yöntemleri açıklar. Bu tekniğin temel avantajları, göreceli basitliği, cDNA'ları, siRNA'ları ürotelyumda yüksek verimlilikle ve nispeten kısa bir süre içinde ifade etme yeteneğidir. Bu tekniğin en zor kısmı kateterizasyondur.
Bununla birlikte, genel tekniğin öğrenildikten sonra ustalaşması nispeten kolaydır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda Araştırma Uzmanı IV olan Giovanni Ruiz olacak. Başlamak için, anestezi uygulanan fareyi burun konilerinin yanındaki bir ısıtma yastığına yerleştirin.
Protokol süresince hayvanı anestezi altında tutun. Farenin bir parmak tutamağı tutamıyla tamamen uyuşturulduğunu onaylayın. Mesaneye hava girmesini önlemek için, bir IV kateterinin plastik kateter kısmını ve ilişkili göbeği steril bir transfer pipeti veya şırınga kullanarak steril PBS ile doldurun.
Hayvan sırtüstü pozisyondayken, dış üretral meatusu% 70 alkol ile sürün. Daha sonra dış üretral meatusu oluşturan dokuyu yavaşça tutun ve ince forsepsler kullanarak hayvandan dikey olarak uzatın. Steril kateteri dış meatusa yerleştirin.
Diğer elinizi dikkatlice kullanarak kateteri üretral meatusa dikey olarak yaklaşık üç ila dört milimetre yerleştirin. Daha sonra dış meatusa yerleştirilen kateteri hayvanın kuyruğuna doğru indirin, bu da üretranın kasık kemiğinin altından geçen kısmına ve nihayetinde mesaneye girişini kolaylaştırır. Mesanedeki idrarın dışarı sızmasına izin verin.
Crede'in manevrasını yaparak kalan idrarı masaj yaparak ve alt karın bölgesindeki mesane yumruğuna hafifçe bastırarak çıkarın. Ürotelyumu transdüksiyona duyarlı hale getirmek için, kateter göbeğine PBS ile doldurulmuş steril bir mililitrelik bir şırınga takarak fare veya sıçan mesanesini yıkayın. Fare kesesine 100 mikrolitre steril PBS enjekte edin.
Şırıngayı kateter bağlantısından ayırdıktan sonra, PBS'nin boşalmasına izin verin. PBS'de çözünmüş% 0.1 N-dodesil-beta-D-maltosid 100 mikrolitre ve steril bir mililitrelik bir şırınga kullanılarak fare kesesine sterilize edilmiş 0.2 mikrometre filtre aşılayın. Şırıngayı yerinde bırakarak N-dodecyl-beta-D-maltoside'i mesanede 10 dakika tutun.
N-dodecyl-beta-D-maltoside'ı, şırıngayı ayırarak ve boşalmasına izin vererek mesaneden çıkarın. Virüsü mesaneye sokmak için kateter göbeğine steril bir mililitrelik bir şırınga takın ve fareler için 100 mikrolitre steril PBS'de seyreltilmiş 5.000.000 ila 100.000.000 IVP adenovirüs veya sıçanlar için 450 mikrolitre adenovirüsü mesaneye aşılayın. 30 dakika sonra, şırıngayı ayırın ve virüs çözeltisinin mesaneyi tek kullanımlık bir ped üzerine boşaltmasına izin verin.
Kalan virüs çözeltilerini pedi atarken emici bir mendille lekeleyin ve biyolojik olarak tehlikeli atıkları silin. Hayvanın iyileşmesine izin vermek için, izofluran akışını durdurun. Hayvanın kafesine geri dönmeden önce, özellikle de hayvanlar grup halinde barındırılıyorsa, iyileşmesine ve tamamen hareketli olmasına izin verin.
Transgen ekspresyonunun etkilerini, mRNA in situ hibridizasyon, Western lekesi veya immünofloresan gibi yöntemleri kullanarak tedaviden 12 ila 72 saat sonra analiz edin. Ürotelyal lizatların Batı leke analizi, transdüe edilmiş mesanelerin ürotelyumunda V5 etiketli insan büyüme hormonu ekspresyonunu ortaya çıkardı, ancak transdüne edilmemiş olanlarda değil. İfade ayrıca, insan büyüme hormonunu veya V5 epitop etiketini tanıyan antikorlar kullanılarak immünofloresan ile doğrulandı.
Western blot analizi, adenovirüs ile transdübe edilen sıçanlarda Claudin-2 ekspresyonunu doğruladı, ancak kontrollü bir GFP kodlayan virüs ile dönüştürülenlerde değil. İmmünofloresan analizi, virüs kodlayan Claudin-2 cDNA ile dönüştürülen ürotelyal şemsiye hücrelerinde eksojen Claudin-2 ekspresyonunu daha da doğruladı. İmmünofloresan ve tüm monte edilmiş veya kesitli urothelyumun konfokal mikroskopisi ile Sıkı Bağlantı Proteini 1'de eksojen Claudin-2'nin saptanması, hücre sitoplazmasında Sıkı Kavşak ve hücre içi Claudin-2 birikimlerinin varlığını ortaya koymuştur.
Görüntü alanı, transdüe edilmiş şemsiye hücrelerinin sayısını saymanın% 95'e yaklaşan bir verimlilik ortaya koyduğunu ve mesane duvarının tamamında sadece ürotelyumun dönüştürüldüğünü ve aşılanan adenovirüs tarafından başka hiçbir dokunun hedeflenmediğini göstermektedir. Kateterizasyon, protokolün amaçlandığı gibi çalışması için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, araştırmacıların normal ürotelyal biyolojiyi incelemelerine ve ayrıca protein aşırı ekspresyonunun veya az ekspresyonunun hastalığa yol açtığı koşulları anlamalarına olanak tanır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, rekombinant adenovirüsler kullanarak yerli kemirgen ürotelyumunun etkili bir şekilde transdüksiyonu için bir protokol sunmaktadır ve cDNA'ların ve siRNA'ların ekspresyonunu mümkün kılar. Temel sonuçlar arasında ürotelyal hücrelerde yaklaşık %95'lik bir transdüksiyon verimliliği elde edilmesi ve ürotelyal biyoloji ve ilgili hastalıklar üzerinde araştırmaların kolaylaştırılması yer almaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Ürotelyal biyoloji
- Gen ekspresyonu düzenlemesi
- Transdüksiyon teknikleri
Arka Plan
- Metilyumun mesane fonksiyonundaki önemi
- Canlı ortamda gen ekspresyonunu incelemenin zorlukları
- Etkili transdüksiyon yöntemlerine duyulan ihtiyaç
Kullanılan Yöntemler
- Gen teslimi için rekombinant adenovirüs kullanımı
- Fare ve sıçan modelleri
- Analiz için Western blot ve immünofloresan tahlilleri
Ana Sonuçlar
- Ürotelyal hücrelerde yüksek transgen ekspresyonu verimliliğinin gösterilmesi
- Claudin-2 ve insan büyüme hormonu gibi spesifik proteinlerin ekspresyonunun doğrulanması
- Adenovirüzün spesifik olarak ürotelyumu transdüze ettiğinin ve bitişik dokuları etkilememesinin belirlenmesi
Sonuçlar
- Bu protokol, ürotelyumda gen fonksiyonunun derinlemesine çalışmasına olanak tanımaktadır
- Mesane biyolojisini etkileyen durumlar hakkında bilgiler sunarak daha geniş biyolojik araştırmalara katkıda bulunur
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Adenovirus-mediated transgene delivery in native bladder urothelium enables rapid, high-efficiency modulation of gene expression in vivo, addressing a critical bottleneck in functional target validation for lower urinary tract research. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence at the discovery and preclinical interface, facilitating portfolio decisions for programs targeting urothelial biology. The method's specificity and scalability position it as a reusable platform for interrogating gene function and disease mechanisms in rodent models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in native urothelial tissue for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of candidate targets through controlled overexpression or knockdown.
- Facilitates rapid hypothesis testing in disease-relevant rodent models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo systems for downstream phenotypic or biomarker assays.
- Delivers reproducible, high-efficiency transduction for quantitative protein expression analysis.
- Enables robust comparison of transgene effects using standardized readouts such as Western blot and immunofluorescence.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker exploration in bladder research.
- Provides continuity from discovery-stage gene modulation to preclinical functional assessment.
- Supports risk-adjusted advancement of urothelial targets based on in vivo functional data.
Pipeline & Workflow Integration
This adenoviral transduction protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical validation, enabling rapid target interrogation and functional assessment in rodent models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of gene function and pathway involvement in urothelial tissue.
- Screening: Provides a reproducible platform for quantitative assessment of transgene expression and downstream effects.
- Analytics: Enables robust measurement of protein expression via Western blot and immunofluorescence for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by enabling disease-relevant gene modulation in vivo.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable protocol for repeated use across multiple gene targets and rodent models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in urothelial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, high-efficiency gene delivery with reproducible outcomes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by providing rapid in vivo functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of urothelial targets for advancement or deprioritization.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in rodent catheterization and in vivo gene delivery.
- Needs access to high-titer adenoviral vectors and analytical tools for protein detection.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to other tissues or species may require protocol optimization.
- Catheterization is a critical step and may present a learning curve for new operators.
