Name: Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Öğrenin, rekombinant adenovirüs kullanarak doğal mesane urothelyumunda cDNA ve siRNA ekspresyonu için yüksek verimli transdüksiyon yöntemini. Bu teknik, %95'e varan verimlilikle gen fonksiyonlarını in vivo çalışmalar için kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, P30DK079307 (M.G.D.'ye), NIH hibesi R01DK119183 (G.A. ve MDC'ye), NIH hibesi R01DK129473 (G.A.'ya), Amerikan Üroloji Derneği Kariyer Geliştirme ödülü ve Winters Vakfı hibesi (N.M.'ye), Pittsburgh Böbrek Araştırmaları Merkezi'nin Hücre Fizyolojisi ve Model Organizmalar Böbrek Görüntüleme Çekirdekleri (P30DK079307) tarafından bir pilot proje ödülü ile desteklenmiştir. ve bu el yazmasında sunulan görüntülerin bazılarını yakalamak için kullanılan konfokal sistemin satın alınmasını finanse eden S10OD028596 (G.A.'ya) tarafından.

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Urothelium%3A+Life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
<li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-regulated+exocytosis%2Fendocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li>
<li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li>
<li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li>
<li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li>
<li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li>
<li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+bladder%2C+cystitis+and+nerve%2Furothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li>
<li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li>
<li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463(2014).</li>
<li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conditional+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li>
<li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li>
<li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Quantitative+Cytology+and+Histology%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li>
<li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li>
<li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+delivery%3A+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li>
<li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal%2Ffusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li>
<li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Molecular+Biology+Organization+journal%22%5BJournal%5D)">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li>
<li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li>
<li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li>
<li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li>
<li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores%3A+identification+of+an+electrostatic+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li>
<li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li>
<li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaching+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804(2018).</li>
<li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888(2022).</li>
<li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Ramesh ve ark. mesane kanseri tedavisinde adenoviral transdüksiyonu kullanmak için stratejiler geliştirmeye odaklanmış olsalar da 18, daha yeni raporlar bu tekniklerin normal ürotelyal biyoloji / fizyoloji ve patofizyoloji 10,18,19,20,21 çalışmalarında yararlılığını göstermiştir . Bu yaklaşımın önemli özellikleri şunlardır: (i) Kemirgen...

Ürotelyum, renal pelvis, üreterler, mesane ve proksimal üretra1'i kaplayan özel bir epiteldir. Üç tabakadan oluşur: apikal yüzeyleri idrarla yıkanan, oldukça farklılaşmış ve polarize olmuş, genellikle iki çekirdekli şemsiye hücrelerden oluşan bir tabaka; akut kayıplarına yanıt olarak yüzeysel şemsiye hücrelerine yol açabilen bi-nükleat geçiş-yükseltici hücre popülasyonuna sahip bir ara hücre tabakası; ve bir alt kümesi, kronik hasara yanıt olarak ürotelyumun tamamını yenileyebilen kök hücreler olarak işlev gören tek bir bazal hücre tabakası. Şemsiye hücreleri, bileşenleri suya ve çözünürlere karşı düşük geçirgenliğe sahip bir apikal membran (kolesterol ve serebrosidler bakımından zengin) ve yüksek dirençli apikal bileşke kompleksi (sıkı bağlantılar, aderens kavşakları, dezmozomlar ve ilişkili bir aktomiyosin halkasından oluşan) içeren yüksek dirençli ürotelyal bariyerin oluşturulmasından başlıca sorumludur.1 . Hem şemsiye hücresinin apikal yüzeyi hem de bileşke halkası mesane dolgusu sırasında genişler ve 1,2,3,4,5 işedikten sonra hızla önceden doldurulmuş hallerine geri döner. Bariyer fonksiyonundaki rolüne ek olarak, ürotelyumun ayrıca hücre dışı ortamdaki değişiklikleri (örneğin, gerilme) algılamasına ve bu bilgiyi subürotelyal afferent sinir süreçleri de dahil olmak üzere altta yatan dokulara (ATP, adenosin ve asetilkolin dahil) salınımı yoluyla iletmesine izin veren duyusal ve dönüştürücü fonksiyonlara sahip olduğu varsayılmıştır 6,7,8 . Bu rolün son kanıtları, hem Piezo1 hem de Piezo2'nin ürotelyal ekspresyonundan yoksun farelerde bulunur ve bu da işeme fonksiyonunun değişmesine neden olur9. Ek olarak, şemsiye hücre tabakasında sıkı bağlantı gözenek oluşturan protein CLDN2'yi aşırı eksprese eden sıçanlar, interstisyel sistit10 hastalarında görülene benzer inflamasyon ve ağrı geliştirir. Ürotelyal duyusal/transdüser veya bariyer fonksiyonunun bozulmasının birçok mesane bozukluğuna katkıda bulunabileceği varsayılmıştır 6,11.
Normal ve hastalık durumlarında ürotelyumun biyolojisinin daha iyi anlaşılması, araştırmacıların endojen gen ekspresyonunu kolayca aşağı regüle etmelerine veya doğal dokudaki transgenlerin ekspresyonuna izin vermelerine izin verecek araçların mevcudiyetine bağlıdır. Gen ekspresyonunu aşağı regüle etmeye yönelik bir yaklaşım, koşullu ürotelyal nakavt fareleri üretmek olsa da, bu yaklaşım flokslu alelleri olan farelerin mevcudiyetine bağlıdır, emek yoğundur ve12'nin tamamlanması aylar ila yıllar sürebilir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırmacılar ürotelyumu transfekte etmek veya transdübe etmek için teknikler geliştirdiler ve bu da daha kısa bir zaman ölçeğinde sonuçlara yol açabilir. Transfeksiyon için yayınlanmış yöntemler arasında katyonik lipitler 13, anti-sens fosforothioated oligodeoksinükleotidler14 veya HIV TAT proteinine nüfuz eden 11-mer peptid15'e bağlı antisens nükleik asitlerin kullanımı bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokolün odak noktası, geniş bir hücre yelpazesine gen iletiminde etkili olan, çok sayıda klinik çalışmada test edilmiş ve en son COVID-19 kapsid proteinini kodlayan cDNA'yı COVID-19 aşısının bir varyantının alıcılarına iletmek için kullanılan iyi çalışılmış bir metodoloji olan adenoviral aracılı transdüksiyonun kullanılmasıdır16, 17. Adenovirüs yaşam döngüsünün, adenoviral vektörlerin ve adenovirüslerin klinik uygulamalarının daha kapsamlı bir açıklaması için, okuyucu referans17'ye yönlendirilir.
Ürotelyumu dönüştürmek için adenovirüslerin kullanımında önemli bir kilometre taşı, Ramesh ve ark. tarafından hazırlanan ve N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dahil olmak üzere deterjanlarla yapılan kısa ön işlemlerin, β-galaktosidaz18'i kodlayan bir adenovirüs tarafından ürotelyumun transdüksiyonunu önemli ölçüde artırdığını gösteren bir rapordu. Bu prensip kanıtı çalışmasını bir rehber olarak kullanarak, ürotelyumun adenoviral aracılı transdüksiyonu, Rab ailesi GTPazları, guanin-nükleotid değişim faktörleri, miyozin motor fragmanları, gözenek oluşturan sıkı bağlantı ile ilişkili klodinler ve ADAM17 10,19,20,21,22 dahil olmak üzere çeşitli proteinleri ifade etmek için kullanılmıştır . Aynı yaklaşım, etkileri transgen22'nin siRNA'ya dirençli varyantlarının birlikte eksprese edilmesiyle kurtarılan küçük müdahale eden RNA'ları (siRNA) ifade etmek için uyarlandı. Burada açıklanan protokol, bu teknikler için bir gereklilik olan büyük miktarlarda yüksek konsantrasyonlu adenovirüs üretmek için genel yöntemlerin yanı sıra, ürotelyumdaki transgenleri yüksek verimlilikle ifade etmek için Ramesh ve ark.18 yöntemlerinin uyarlanmasını içerir.

<table><tbody><tr><td>10 mL pipet</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4488</td><td>steril, serolojik pipet, ayrı ayrı sarılmış</td></tr><tr><td>12 mL ultrasantrifüj tüpü</td><td>ThermoFisher</td><td>06-752</td><td>PET ince duvarlı ultrasantrifüj tüpü</td></tr><tr><td>15 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352097</td><td>steril</td></tr><tr><td>18 G iğne</td><td>BD&nbsp;</td><td>305196</td><td>18 G x 1,5 inç iğne</td></tr><tr><td>20 mL pipet</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4489</td><td>steril, serolojik pipet, ayrı ayrı sarılmış</td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352098</td><td>steril</td></tr><tr><td>5 mL pipet</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4487</td><td>steril, serolojik pipet, ayrı ayrı sarılmış</td></tr><tr><td>Cavicide</td><td>Henry Schein</td><td>6400012</td><td>Anti-viral çözelti</td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı - 15 cm</td><td>Falcon (Corning)</td><td>353025</td><td>steril, doku kültürü ile tedavi edilmiş&nbsp; (150 mm x 25 mm çanak)</td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>Sarstedt</td><td>893.1832</td><td>sap uzunluğu 24 cm, bıçak uzunluğu 1,7 cm</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>C-4306</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı & ge;% 98</td></tr> <tr><td>DMEM kültür ortamı (yüksek glikoz)</td> <td>Gibco (ThermoFisher)</td><td></td> <td>11965092 4.5 g / L glikoz + L-glutamin + fenol kırmızısı</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>EDS</td><td>ile Bioiultra sınıfı & ge; %</td></tr><tr><td>99Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Hyclone (Cytiva)</td><td>SH30070.03</td><td>tanımlı serum</td></tr><tr><td>Cam pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>5.75 cam pipette, otoklavlanmış</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Millipore Sigma</td><td>G-5516</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı & ge;% 99</td></tr> <tr><td>HEK293 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK293T hücreleri, SV40 büyük T-antijeni İzofluranı eksprese eden HEK293 hücrelerinin bir çeşididir</td></tr><tr><td></td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>IV kateter - fare</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3063</td><td>24 G x 3/4 inç Güvenlik IV kateter ve nbsp; radyoopak</td></tr><tr><td>IV kateter - sıçan</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3060</td><td>22 G x 1 inç Güvenlik IV kateter radyoopak</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P-9541</td><td>Moleküler Biyoloji sınıf & ge;% 99</td></tr> <tr><td>KH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5655</td><td>Hücre kültürü sınıfı&nbsp;&ge;% 99</td></tr> <tr><td>Na2HPO4&bull; 7 H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>431478</td><td>&nbsp; &ge; % 99.99</td></tr> <tr><td></td><td>NaCl Millipore Sigma</td><td>S3014</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı &ge;% 99</td></tr> <tr><td>N-dodesil-&beta;-D-maltosit&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4641</td> <td>ve nbsp; &ge; Birden</td></tr> <tr><td>fazla hayvan için %98 burun konisi</td>, <td>özel olarak tasarlanmış</td><td></td><td>ticari seçenekler arasında Parkland Scientific (RES3200)</td></tr> <tr><td>PD-10 sütunundan</td> bir tane bulunur.<td>GE Healthcare</td><td>17-085-01</td><td>Sephadex G-25M</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin antibiyotik (100x)</td> <td>Gibco (ThermoFisher</td> <td>15070063</td>) ile doldurulmuş önceden paketlenmiş sütunlar <td>(100x) 100x konsantre çözelti</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Eppendorf ve nbsp;</td><td>Biyofotometre</td><td></td></tr><tr><td>Standı ve kelepçesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q ve 05-769-8FQ</td><td>çok sayıda tedarikçiden temin edilebilir</td></tr><tr><td>Steril filtre ünitesi</td><td>Fisher Scientific (Nalgene)</td><td>09-740-65B</td><td>0.2 & m hızlı akışlı filtre ünitesi (150 mL)</td></tr><tr><td>Steril filtre ünitesi 0.2 & mikro; m (şırınga)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SLGV004SL</td><td>Millipore Sigma Milex 0.22 ve mikro; şırıngaya takılan m filtre ünitesi</td></tr><tr><td>Süper hızlı santrifüj</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td>Eppendorf F34-6-38 sabit açılı rotorlu 5810R (12.000 rpm)</td></tr><tr><td>Şırınga (1 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309628</td><td>1 mL şırınga Luer-lok ucu - steril</td></tr><tr><td>Şırınga (3 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309656</td><td>3 mL şırınga kayma ucu - steril</td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj (düşük hız)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5702</td><td>sallanan kova rotorlu</td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>polietilen 3,4 mL transfer pipeti</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Millipore Sigma</td><td>648310-M</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE select proteaz çözeltisi</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>12604013</td><td>TrypLE ekspres enzimi (1x), fenol kırmızısı yok</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Beckman</td><td>Coulter</td><td>Optima L-80 XP</td><td>, Beckman SW41 rotorlu (41.000 rpm)</td></tr><tr><td>Buharlaştırıcı&nbsp;</td><td>Genel Anestezi Hizmetleri A.Ş.</td><td>Tec 3</td><td>İzofluran buharlaştırıcı</td></tr><tr><td>Vorteks Karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>analog girdap karıştırıcı</td></tr></tbody></table>

adenovirüs aracılı transdüksiyon kullanılarak doğal mesane urothelyumunda transgenlerin ekspresyonu

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Yüksek dirençli bir bariyer oluşturmanın yanı sıra, renal pelvis, üreterler, mesane ve proksimal üretrayı kaplayan ürotelyumun, çevresi hakkındaki bilgileri altta yatan dokulara algılamak ve iletmek, işeme fonksiyonunu ve davranışını teşvik etmek için varsayılmıştır. Ürotelyal bariyerin veya duyusal / dönüştürücü fonksiyonunun bozulması hastalığa yol açabilir. Bu karmaşık olayları incelemek, ürotelyumdaki gen ve protein ekspresyonunu değiştirmek için basit stratejilerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, araştırmacıların kemirgen ürotelyumunu yüksek verimlilikle ve nispeten basit bir şekilde dönüştürmek için kullanılabilecek büyük miktarlarda yüksek titreli adenovirüs üretmelerine izin veren yöntemler açıklanmaktadır. Hem cDNA'lar hem de küçük müdahale eden RNA'lar adenoviral transdüksiyon kullanılarak eksprese edilebilir ve transgen ekspresyonunun ürotelyal fonksiyon üzerindeki etkisi 12 saat ila birkaç gün sonra değerlendirilebilir. Bu yöntemler, fare veya sıçan hayvan modellerini kullanan normal ve anormal ürotelyal biyoloji çalışmalarına geniş uygulanabilirliğe sahiptir.

Virüs hazırlığı Yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile virüs saflaştırmanın bir örneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Yüklenen hücresel malzemenin ve 1.25 g / mL CsCl tabakasının arayüzünde bulunan açık pembe bant, esas olarak bozulmuş hücrelerden ve kalıntılarından oluşur ( Şekil 1A'daki macenta okuna bakınız). Pembemsi rengini, protokoldeki adım 1.5'ten taşınan az miktarda kültür ortamından alır. Süt beyazı bir bant olarak görünen ilgili virüs pa...

Büyük miktarlarda rekombinant adenovirüslerin üretimi için yöntemler tanımlanmıştır, bu daha sonra transgenlerin ekspresyonuna veya endojen gen ürünlerinin aşağı regülasyonuna izin veren doğal kemirgen ürotelyumunu dönüştürmek için kullanılabilir.

Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Bu protokol, araştırmacıların doğal mesane ürotelyumunda CDNA'ları veya SIRNA'ları eksprese etmelerine izin veren yöntemleri açıklar. Bu tekniğin temel avantajları, göreceli basitliği, cDNA'ları, siRNA'ları ürotelyumda yüksek verimlilikle ve nispeten kısa bir süre içinde ifade etme yeteneğidir. Bu tekniğin en zor kısmı kateterizasyondur.Bununla birlikte, genel tekniğin öğrenildikten sonra ustalaşması nispeten kolaydır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda Araştırma Uzmanı IV olan Giovanni Ruiz olacak. Başlamak için, anestezi uygulanan fareyi burun konilerinin yanındaki bir ısıtma yastığına yerleştirin.Protokol süresince hayvanı anestezi altında tutun. Farenin bir parmak tutamağı tutamıyla tamamen uyuşturulduğunu onaylayın. Mesaneye hava girmesini önlemek için, bir IV kateterinin plastik kateter kısmını ve ilişkili göbeği steril bir transfer pipeti veya şırınga kullanarak steril PBS ile doldurun.Hayvan sırtüstü pozisyondayken, dış üretral meatusu% 70 alkol ile sürün. Daha sonra dış üretral meatusu oluşturan dokuyu yavaşça tutun ve ince forsepsler kullanarak hayvandan dikey olarak uzatın. Steril kateteri dış meatusa yerleştirin.Diğer elinizi dikkatlice kullanarak kateteri üretral meatusa dikey olarak yaklaşık üç ila dört milimetre yerleştirin. Daha sonra dış meatusa yerleştirilen kateteri hayvanın kuyruğuna doğru indirin, bu da üretranın kasık kemiğinin altından geçen kısmına ve nihayetinde mesaneye girişini kolaylaştırır. Mesanedeki idrarın dışarı sızmasına izin verin.Crede'in manevrasını yaparak kalan idrarı masaj yaparak ve alt karın bölgesindeki mesane yumruğuna hafifçe bastırarak çıkarın. Ürotelyumu transdüksiyona duyarlı hale getirmek için, kateter göbeğine PBS ile doldurulmuş steril bir mililitrelik bir şırınga takarak fare veya sıçan mesanesini yıkayın. Fare kesesine 100 mikrolitre steril PBS enjekte edin.Şırıngayı kateter bağlantısından ayırdıktan sonra, PBS'nin boşalmasına izin verin. PBS'de çözünmüş% 0.1 N-dodesil-beta-D-maltosid 100 mikrolitre ve steril bir mililitrelik bir şırınga kullanılarak fare kesesine sterilize edilmiş 0.2 mikrometre filtre aşılayın. Şırıngayı yerinde bırakarak N-dodecyl-beta-D-maltoside'i mesanede 10 dakika tutun.N-dodecyl-beta-D-maltoside'ı, şırıngayı ayırarak ve boşalmasına izin vererek mesaneden çıkarın. Virüsü mesaneye sokmak için kateter göbeğine steril bir mililitrelik bir şırınga takın ve fareler için 100 mikrolitre steril PBS'de seyreltilmiş 5.000.000 ila 100.000.000 IVP adenovirüs veya sıçanlar için 450 mikrolitre adenovirüsü mesaneye aşılayın. 30 dakika sonra, şırıngayı ayırın ve virüs çözeltisinin mesaneyi tek kullanımlık bir ped üzerine boşaltmasına izin verin.Kalan virüs çözeltilerini pedi atarken emici bir mendille lekeleyin ve biyolojik olarak tehlikeli atıkları silin. Hayvanın iyileşmesine izin vermek için, izofluran akışını durdurun. Hayvanın kafesine geri dönmeden önce, özellikle de hayvanlar grup halinde barındırılıyorsa, iyileşmesine ve tamamen hareketli olmasına izin verin.Transgen ekspresyonunun etkilerini, mRNA in situ hibridizasyon, Western lekesi veya immünofloresan gibi yöntemleri kullanarak tedaviden 12 ila 72 saat sonra analiz edin. Ürotelyal lizatların Batı leke analizi, transdüe edilmiş mesanelerin ürotelyumunda V5 etiketli insan büyüme hormonu ekspresyonunu ortaya çıkardı, ancak transdüne edilmemiş olanlarda değil. İfade ayrıca, insan büyüme hormonunu veya V5 epitop etiketini tanıyan antikorlar kullanılarak immünofloresan ile doğrulandı.Western blot analizi, adenovirüs ile transdübe edilen sıçanlarda Claudin-2 ekspresyonunu doğruladı, ancak kontrollü bir GFP kodlayan virüs ile dönüştürülenlerde değil. İmmünofloresan analizi, virüs kodlayan Claudin-2 cDNA ile dönüştürülen ürotelyal şemsiye hücrelerinde eksojen Claudin-2 ekspresyonunu daha da doğruladı. İmmünofloresan ve tüm monte edilmiş veya kesitli urothelyumun konfokal mikroskopisi ile Sıkı Bağlantı Proteini 1'de eksojen Claudin-2'nin saptanması, hücre sitoplazmasında Sıkı Kavşak ve hücre içi Claudin-2 birikimlerinin varlığını ortaya koymuştur.Görüntü alanı, transdüe edilmiş şemsiye hücrelerinin sayısını saymanın% 95'e yaklaşan bir verimlilik ortaya koyduğunu ve mesane duvarının tamamında sadece ürotelyumun dönüştürüldüğünü ve aşılanan adenovirüs tarafından başka hiçbir dokunun hedeflenmediğini göstermektedir. Kateterizasyon, protokolün amaçlandığı gibi çalışması için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, araştırmacıların normal ürotelyal biyolojiyi incelemelerine ve ayrıca protein aşırı ekspresyonunun veya az ekspresyonunun hastalığa yol açtığı koşulları anlamalarına olanak tanır.

expression-transgenes-native-bladder-urothelium-using-adenovirus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Fare mesane duvar enjeksiyon orthotopically mesane kök hücre ve kanser biyolojisi incelemek için yararlı bir yaklaşımdır. Bu hassas mikrocerrahi yöntemi dikkatli tekniği ve uygulamaları ile hakim olabilir.

Fare mesane Duvar Enjeksiyon

Ultrason ve bioluminescent görüntüleme ile intravezikal teslim Sarna ve izleme tümör büyümesinin antitümör etkileri değerlendirmek için ortotopik mesane tümörü modeli oluşturmak.

Bir Ortotopik Mesane Tümörü Model ve intravezikal Sarna Tedavisinin Değerlendirilmesi

Bu video, üretral kateterizasyon ve elektroporasyon tekniklerinin bir kombinasyonu kullanılarak DNA plazmidinin fare mesanesinin ürotelyumuna verilmesini göstermektedir. Açıklanan prosedür, fare mesane kanseri modellerinin oluşturulmasına izin verir.

DNA Plazmitlerinin Fare Mesanesinin Urothelium'una Verilmesi: Genetik Olarak Tasarlanmış Modeller Oluşturmak için DNA Plazmitlerini Murin Mesanesinin Ürotelyal Hücrelerine Verimli Bir Şekilde Vermek İçin Elektroporasyon Tabanlı Bir Prosedür

Kaynaklı organ içine kanser hücrelerinin implantasyonu yeni tedaviler değerlendirmek için yararlı bir ön-klinik modeli olarak hizmet edebilir. MB49 mesane karsinom hücreleri intravezikal Damla damla akıtma sonrası mesane içinde yetiştirilebilir. Bu protokol, tümör implantasyonu ve adenoviral teslimat amacıyla fare mesane kateterizasyon gösterir.

Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli

Bir N-bütil-N-(4-hidroksibutil) nitrozamin bağımlı mesane kanseri modelinde insan müsin 1 (MUC1), test amacıyla MUC1 yönlendirilmiş immünoterapi için transgenik farenin olarak geliştirilmiştir. Bir MUC1 hedefli bir peptid aşının sonra, MUC1 bir sitotoksik T-lenfosit yanıt sitokin seviyeleri ve T-hücresi spesifik aktivitesi ölçülerek teyit edilmiştir.

Bağışıklık Sağlam İnsan MUC1 Transgenik Farelerde İnvaziv Geçici Hücre Mesane Karsinomu indüksiyon: immünoterapi Kalkınma İçin Bir Model

Bu iletişim kuralı virüs teslim edilmek üzere fare prostat yeni kurulan bir yöntem açıklanır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, gen overexpression veya Cre recombinase teslim kullanarak, teknik gen ifadesinin orthotopic değişiklik sağlar ve prostat kanseri için bir roman fare modeli uygular.

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

Biz'DNA plazmid dır fare mesane vivo içinde İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon ürotelyal hücre içine bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Kesesi hastalıkları otokton fare modelleri oluşturmak için hızlı ve kolay bir yol sunar.

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Bu protokol, kanserojen kaynaklı murin mesane kanserinden elde edilen mesane tümörü organoidlerinin üç boyutlu in vitro kültürünü oluşturmak için ayrıntılı deneysel adımlar sağlar. Paslanma, genetik mühendislik ve tümör organoidlerinin ortotopik transplantasyonlarını içeren kültür yöntemleri tanımlanmıştır.

Fare Mesane Tümörü Organoidlerinin Kültürü, Manipülasyonu ve Ortotopik Transplantasyonu

Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bu protokol, floresan Ca2+ sensörü GCaMP5G kullanılarak doğal ürotelyal hücrelerde mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının işlevini değerlendirmek için bir metodolojiyi açıklamaktadır.

Eski Vivo Ürotelyal Hücrelerde Mekanik Olarak Aktive Edilmiş Ca2+ Geçicilerinin Analizi

Öğrenin, rekombinant adenovirüs kullanarak doğal mesane urothelyumunda cDNA ve siRNA ekspresyonu için yüksek verimli transdüksiyon yöntemini. Bu teknik, %95'e varan verimlilikle gen fonksiyonlarını in vivo çalışmalar için kolaylaştırır.

Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu

Daha fazla video keşfet