Gerçek Zamanlı Boşluk Noktası Testi
10 Şubat 2023
Bu makalede, geleneksel boşluk noktası testine video izlemeyi dahil ederek fare işeme davranışını incelemek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, günün aydınlık ve karanlık evrelerinde işeme olayları ve fare davranışının ayrıntıları hakkında zamansal, uzamsal ve hacimsel bilgiler sağlar.
Bu raporda açıklanan yöntem, sağlık ve hastalık durumlarında gönüllü işitmenin fizyolojik ve nöro-davranışsal yönlerini anlamak için kullanılabilir. Bu teknik, günün aydınlık ve karanlık evrelerinde fare hacmi davranışını izlememize olanak tanır ve işeme olayları hakkında zamansal, uzamsal ve hacimsel bilgiler sağlar. Gerçek zamanlı bir boşluk noktası testi veya RT-VSA kayıt odası hazırlamak için, RT-VSA kayıt kafesinin altına günün saatine bağlı olarak ince veya kalın bir filtre kağıdı yerleştirin.
Filtre kağıdının üzerine, uyku alanı için plastik bir iglo; zenginleştirme amacıyla steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve iki veya üç parça fare kuru çorbası içeren 60 mm x 15 mm'lik bir plastik tabak ve bir jel paketi şeklinde 14 ila 16 gram su yerleştirin. Kayıt odası hazır olduğunda, fareyi yavaşça filtre kağıdına yerleştirin. Farenin muhafaza kafesinden kayıt kafesine transferinin minimum stresle gerçekleştiğinden emin olun.
Fare kayıt kafesinin içine girdikten sonra, kapağı yerleştirin ve pleksiglas kapak yüzeyindeki doğrudan ortam ışığı yansımalarını en aza indirmek için kapağın üst kısmını emici bir tezgah mavi pediyle örtün. Alt odadaki ultraviyole ışıkları açın. Üst ve alt kameralardan RT-VSA video kaydetmek için, birden fazla web kamerasından veya ağa bağlı kameradan aynı anda kayıt yapmak üzere yapılandırılmış video gözetim kayıt yazılımını kullanın.
Program penceresinde Cmd R tuşuna basarak kaydı başlatın. Saniyede bir kare hızında video kayıtları gerçekleştirin. Kayıtları başlattıktan hemen sonra odadan çıkın ve kapıyı yavaşça kapatın.
Tüm deney boyunca odanın sessiz kaldığından emin olun. Cmd T.Ultraviyole ışıklarını kapatın. Kaydı durdurduktan sonra, yazılım otomatik olarak her kamera için m4v formatında bir film dosyası oluşturur ve daha önce seçilen bir hedef klasörde kameranın adı altında kaydeder.
Her fotoğraf makinesinin klasöründe deneylerin tarihe göre klasörler halinde düzenlendiğini doğrulayın. Her tarih veya deneme klasöründe, bir m4v dosyası ve her film karesine karşılık gelen tek tek jpeg dosyalarının tümü olduğunu doğrulayın. Masaüstünde denemenin adı ve tarihi ile bir klasör oluşturun ve m4v dosyalarını bu klasöre aktarın.
Film klasörünü harici bir bilgisayarda analiz etmek üzere bir flash sürücüye kopyalayın. Işık fazı sırasında alt kamera veya karanlık faz sırasında üst kamera tarafından toplanan bir film dosyasını analiz için açın. Filmin kalitesini değerlendirdikten sonra, ileri sarma komutunu veya zaman çubuğu kaydırıcısını kullanarak doğru zaman penceresine geçerek denemeleri analiz edin.
Işık fazı sırasında işeme aktivitesi 11:00 ile 5:00 PM arasında ve karanlık faz sırasında gece yarısı ile 06:00 arasında kaydedilir. Hızlı ileri sarma simgesine tıklayarak filmi ileri sarma modunda oynatın veya farenin işediğine dair kanıt arayarak film arasında manuel olarak gezinin. Filtre kağıdında parlak idrar lekelerinin aniden ortaya çıkmasına veya kafesin köşelerine hareket ve fare işediğinde kısa bir hareketsizlik süresi de dahil olmak üzere davranış değişikliklerine bakın. Her boşluğun oluştuğu zamanı kaydedin.
Bir kural olarak, boşluğun zamanı, idrarın tespit edildiği ilk işarette kaydedilir. Boşluğun ölçümlerini almak için, önce idrar noktasının maksimum difüzyonunun meydana geldiği noktayı arayarak zaman içinde ileri veya geri hareket etmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Bu noktada filmi duraklatın ve ekran görüntüsündeki ilgi çekici noktayı işaretlemek için bilgisayar fare okunu analiz altındaki noktaya yerleştirin.
Filmdeki görünüm sırasını hesaba katmak için ekran görüntüsü dosyasını bağıntılı sayılar kullanarak adlandırın. Tüm boşluk noktaları analiz edildikten sonra, bir ekran görüntüsü yakalayarak ve filtre kağıdının kenarlığını tanımlayarak filtre kağıdının toplam alanını ölçün. İdrar lekelerinin her birinin yüzde alanını hesaplayın.
Kalibrasyon eğrilerini ve grafik yazılımındaki interpolat işlevini kullanarak yüzde alanının değerlerini her boşluk noktası için idrar hacmine dönüştürün. Dişi ve erkek Piezo1, 2, nakavt ve kontrol farelerinin işeme davranışı, günün karanlık ve aydınlık fazında kaydedildi. Aktif olmayan ışık fazları sırasında, dişi veya erkek nakavt fareler için analiz edilen herhangi bir parametrede kontrole kıyasla anlamlı bir fark gözlenmemiştir.
Bununla birlikte, aktif karanlık fazda, dişi ve erkek nakavt fareleri, küçük boşluk noktalarının sayısında ve toplam hacminde önemli bir artış ile karakterize edilen, değişmiş işeme fenotipi göstermiştir. Dişi veya erkek nakavt farelerde birincil boşluk lekeleri veya PVS sayısı, PVS başına ortalama hacim veya toplam PVS hacminde kontrol farelerine kıyasla anlamlı bir fark yoktu. Dişi farelerin işeme davranışı bazal koşullar altında ve siklofosfamid tedavisini takiben test edildi.
Bazal koşullarla karşılaştırıldığında, siklofosfamid tedavisinden sonra boşluk başına idrar salınım miktarı daha küçüktür ve miksiyon olayları çok daha sıktır. Tahlil tekrarlanabilirliği için kilit bir husus, hayvanları mümkün olduğunca nazikçe manipüle etmek ve tüm test süresi boyunca minimum stres altında tutmaktır. Bu noninvaziv bir tahlil olduğundan, daha sonra sırasıyla mesane ve eksternal üretra sfinkter fonksiyonlarını değerlendirmek için sitometri ve elektromiyografi dahil olmak üzere ek prosedürler gerçekleştirilebilir.
Bu tekniğin uygulanması, araştırmacıların sağlık ve hastalık durumlarında işeme davranışına belirli yolların katkısını tanımlamasına izin verecektir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, geleneksel boşaltma noktası analizinde video izlemeyi birleştirerek fare boşaltma davranışını inceleyen yeni bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşım, boşaltma olayları ve günün aydınlık ve karanlık evrelerinde fare davranışının detayları hakkında zamansal, uzamsal ve hacimsel bilgiler sunmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal Biyoloji
- Fizyoloji
Arka Plan
- Miktürisyonu anlamak, mesane fonksiyonlarını incelemek için önemlidir.
- Müshil davranışları araştırmak için fare modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır.
- Geleneksel yöntemler, detaylı davranış bilgilerini içermeyebilir.
- Video izleme, boşaltma analizlerinde veri toplamayı artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Fare için gerçek zamanlı boşaltma noktası analizi (RT-VSA) geliştirmek.
- Boşaltma davranışı hakkında kapsamlı veriler toplamak.
- Aydınlık ve karanlık evrelerde davranış farklılıklarını analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Filtre kağıdı ile bir kayıt odası hazırlama.
- Fare için çevresel zenginleştirme ekleme.
- Boşaltma olaylarını video teknolojisi kullanarak izleme.
- Farklı ışık koşullarında fare davranışının değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- RT-VSA'nın boşaltmayı izlemek için başarılı bir şekilde uygulanması.
- Boşaltma olayları hakkında detaylı zamansal ve uzamsal verilerin toplanması.
- Aydınlık ve karanlık evreler arasındaki fare davranış değişimlerindeki içgörüler.
- Üriner bozukluklarda çalışmalarda potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- RT-VSA yöntemi, miktürisyonu anlamayı geliştirir.
- Video izleme, zengin davranışsal veriler sağlar.
- Bu yaklaşım, çeşitli sağlık ve hastalık çalışmalarına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The Real-Time Void Spot Assay (RT-VSA) enables high-resolution, quantitative assessment of voluntary voiding behavior in mouse models, providing temporal, spatial, and volumetric data critical for mechanistic de-risking in early discovery. This capability supports target validation and pathway interrogation for bladder and neurobehavioral research, reducing ambiguity in preclinical model selection. RT-VSA enhances predictive confidence for portfolio decisions involving urinary physiology and disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of physiological and neurobehavioral pathways underlying micturition.
- Supports functional target validation by quantifying voiding frequency and volume in genetically modified models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing phenotypic changes across light and dark phases.
- Improves predictive confidence for advancing disease-relevant targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible measurement of voiding events for downstream pharmacological screening.
- Generates quantitative outputs (void frequency, volume, pattern) suitable for assay development.
- Enables reliable comparison of compound or genetic interventions in preclinical models.
- Supports scalability and platform reuse across multiple studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical voiding phenotypes with translational biomarkers of urinary function.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling noninvasive, longitudinal assessment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust behavioral endpoints.
- Facilitates integration with downstream analyses such as cytometry and electromyography.
Pipeline & Workflow Integration
RT-VSA fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and phenotypic screening in mouse models of urinary function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of micturition pathways and biological de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative voiding data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides temporal and volumetric measurements to compare experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Bridges preclinical findings to disease-relevant endpoints and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, noninvasive platform adaptable to diverse genetic and pharmacological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping with reproducible, scalable protocols.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of urinary and neurobehavioral targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral phenotyping and quantitative image analysis.
- Needs video monitoring infrastructure and analytical software for data extraction.
- Demands cross-team standardization to ensure reproducibility and data integrity.
- Adaptable to various mouse models and experimental conditions with minimal invasiveness.
- Dependent on careful animal handling to minimize stress and maximize assay reliability.
