Mekano-Düğüm-Gözenek Algılama: Çok Parametreli Tek Hücreli Viskoelastik Ölçümler için Hızlı, Etiketsiz Bir Platform

Burada sunulan, mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS) adı verilen elektronik tabanlı bir mikroakışkan platform kullanarak tek hücreleri mekanik olarak fenotiplemek için bir yöntemdir. Bu platform, hücrelerin hem elastik hem de viskoz biyofiziksel özelliklerini ölçerken 1-10 hücre / s'nin ılımlı verimini korur.

Tek hücrelerin mekanik fenotiplemesi için elektronik tabanlı bir mikroakışkan platform sunuyoruz. Spesifik olarak, tek hücreli elastik ve viskoz özellikleri, saniyede 10 hücreye kadar bir verimde ölçüyoruz. Yöntemimiz minimum numune hazırlama gerektirir, pahalı optik donanımın ve karmaşık görüntü analizinin yerini alan basit bir elektronik ölçüm kullanır ve tahribatsızdır, yani yaklaşımımız aşağı akış analizleriyle uyumludur.

Mekano-NPS, birincil örnekler de dahil olmak üzere birçok hücre tipine uygulanmış ve hücre altı bileşenlerin tek hücreli viskoelastisite üzerindeki etkisini ölçmüştür. Hücre davranışını anlamak, hastalığın ilerlemesini belirlemek veya ilaç yanıtını izlemek için kullanılabilir. Başlamak için, plazma ile muamele edilmiş bileşenleri plazma odasından çıkarın.

Pipet, önceden imal edilmiş elektrotlarla cam substrat üzerinde iki ila bir metanol ve deiyonize su çözeltisidir. Ardından, PDMS kalıbını, özelliği cam alt tabakanın üzerine yan yana gelecek şekilde yerleştirin. Hizalamayı ayarlamak için cihazı stereoskobun altına yerleştirin.

Cihaz imalatını tamamlamak için hizalanmış cihazı pişirin. Basınç kaynağını, PCB'yi, tezgah üstü donanımı ve veri toplama yazılımını hazırlayın. Ardından, kelepçe başlık pimlerini PCB üzerindeki deliklerle hizalayın ve kelepçe yaylı pimleri mikroakışkan cihazdaki elektrot temas pedleriyle hizalayın.

Ardından, kelepçe başlık pimlerini PCB deliklerine takın ve yaylı pimlerin elektrot temas pedleriyle aynı hizada kalmasını sağlayın. Elektronik donanımı kurun ve bağlayın. Ardından, veri toplama oturumunu başlatmak için değerleri ayarlayın ve edinme için örnekleme hızını ayarlayın.

Kültür ve hücreleri uygun hücre kültürü protokolüne göre hazırlayarak hücre hattını tercih eder. Daha sonra hücreleri, mililitre başına 100.000 ila 500.000 hücre arasında bir konsantrasyonda% 2 FBS ve 1X PBS'lik hazırlanmış bir çözelti içinde askıya alın. Deney süresince hücreleri buz üzerinde tutun.

Hücreleri mikroakışkan cihaza yüklemek için, 30 santimetrelik politetrafloroetilen boruyu bir tıraş bıçağı ile kesin. Hücre örneğini borunun ucuna bırakmak için bir şırınga kullanın ve aynı ucu cihaz girişine bağlayın. Son olarak, borunun karşı ucunu mikroakışkan basınç kontrolörüne bağlayın.

Denemeyi çalıştırmak için, basınç kontrol cihazı yazılımında istenen sabit sürüş basıncını ayarlayın ve numunenin cihazı doldurmasına izin verin. Mikroakışkan kanallarda kabarcıklar oluşursa, çıkmaz dolum kullanın. Cihaz çıkışını takın ve gaz geçirgen PDMS'den havayı dışarı çıkmaya zorlamak için girişe düşük bir basınç uygulayın.

Ardından, güç kaynağı üzerindeki voltaj düğmesini döndürerek istediğiniz voltajı ayarlayın ve açma düğmesine basarak voltajı etkinleştirin. Mevcut preamplifikatörü açın ve hassasiyeti mümkün olduğunca düşük bir değere ayarlayın. Alternatif olarak, ön amplifikatörü aşırı yüklemeden veya DAQ'nın maksimum analog giriş voltajını aşmadan kazancı mümkün olduğunca yükseğe ayarlayın.

Veri toplama komut dosyası NPS'yi başlatmak için MATLAB şerit menüsündeki yeşil Çalıştır düğmesine basın. m'ye dokunun ve verileri örneklemeye ve kaydetmeye başlayın. Denemeyi sonlandırmak için, veri toplama komut dosyasını sonlandırmak üzere canlı çizim penceresinin sol alt köşesindeki Durdur düğmesine basın.

Ardından Açma (On) düğmesine basarak güç kaynağı çıkışını devre dışı bırakın. Son olarak, basınç kontrol yazılımı içinde basınç kaynağını sıfır basınca ayarlayın. Veri analizi için, ham sinyal, gürültüyü filtrelemek ve önemli bileşenleri çıkarmak için yeterli bir sinyal-gürültü oranına sahip olmalıdır.

Kritik olarak, her düğümden gelen akım sinyali yükselişi, alt darbelerin fark sinyalinden kolayca tanımlanabileceği kadar sağlam olmalıdır. Malign MCF-7 hücreleri, malign olmayan MCF-10A hücrelerinden daha büyük bir wCDI dağılımına sahiptir, bu da malign MCF-7 hücrelerinin malign olmayan MCF-10A muadillerinden daha yumuşak olduğunu gösterir. Latrunkülin ile tedavi edilen MCF-10A ve MCF-7 hücreleri wCDI'da bir artış göstermektedir.

İki birincil hücre tipini farklılaştıran farklı bir wCDI dağılımı, LEP hücrelerinin MEP hücrelerinden daha yumuşak olduğunu gösterir. Malign olmayan MCF-10As ve tedavi edilmemiş MCF-10A ve MCF-7'ler, anında iyileşen hücrelerin daha büyük bir oranına sahiptir ve bu da malign veya latrunculin ile tedavi edilen muadillerinden daha düşük viskoziteye işaret eder. Canlı akım okuması anormal görünüyorsa, denemenizi durdurun ve mikroakışkan kanalı inceleyin.

Hava kabarcığı olmadığından ve hücrelerin girişten çıkışa serbestçe akacağı şekilde tıkanmadığından emin olun. Yöntemimiz hücrelere zarar vermediğinden, RNA-seq veya immünofloresan gibi aşağı akış analizleri yapılabilir. Bu, hücrelerin farklı mekanik fenotiplere sahip olmasının altında yatan bazı nedenleri ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir.