Name: İn Vivo Meme İntraduktal Enjeksiyon Yoluyla Fare Meme Epitel Hücrelerine Gen İletimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Öğrenin fare meme epitel hücrelerine viral vektörlerle gen iletimi yöntemini. Bu teknik, meme kanseri modellerinde doğal tümör oluşumunu taklit ederek kontrollü gen transferi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu makale hakkındaki yararlı yorumları için Dr. Gary Chamness'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Savunma Bakanlığı (DOD) CDMRP BC191649 (YL) ve BC191646 (YL) ile Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) CA271498 (YL) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Joel M. Sederstrom'un yardımıyla SPORE P50CA186784 tarafından desteklenen Meme Merkezi Patoloji Çekirdek Tesisine ve CPRIT-RP180672, NIH CA125123 ve RR024574 tarafından desteklenen Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdeğine teşekkür eder.

Farelerin kullanıldığı tüm prosedürler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı hayvan protokolüne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada 9-12 haftalık FVB/N veya MMTV-tva dişi fareler kullanıldı. Fareler ticari olarak veya kendi kendine elde edildi (bakınız Malzeme Tablosu). Lenti-EGFP (FUCGW) ve RCAS-Erbb2 (Neu) virüsleri kullanıldı. Virüs hazırlığı ve titre tayini, daha önce yayınlanan10,12 raporlarını takiben gerçekleştirilmiştir.
1. Şırınga hazırlama
<ol><li>33 G metal göbek iğnelerini ( bakınız Malzeme Tablosu) yaklaşık 1 cm uzunluğa kadar kesin. İğneleri ve 50 μL şırıngayı otoklavlamadan sonra% 70 alkolde saklayın.</li>
	<li>Şırıngaları ve iğneleri alkolden çıkarın. Kalan alkolü şırıngadan ve iğneden dışarı itin. Şırıngayı otoklavlanmış emici bir tezgah pedi üzerinde hava kurutması için sökün.</li>
	<li>Şırıngayı kuruduktan sonra monte edin.</li>
</ol>2. Virüs hazırlığı
<ol><li>-80 ° C dondurucudan gerektiğinde bir veya birkaç viral stok tüpünü çıkarın ve virüsü buz üzerinde çözün. NOT: Enfekte edilecek hücre sayısına bağlı olarak, virüsün şu anda 1x PBS kullanılarak amaçlanan titrelere seyreltilmesi gerekebilir.</li>
	<li>Pipet ucunu bromofenol mavisi tozuna 1 cm derinliğe kadar daldırarak bromofenol mavisi ekleyin ( bkz. Ardından, ekli eser miktarda bromofenol mavisini virüs süspansiyonuna getirin. NOT: Bu çalışma için, viral stok genellikle tüp başına 200 μL'dir, bu nedenle nihai boya konsantrasyonu yaklaşık% 0.2'dir (0.2 μg / 100 μL). Bromofenol mavisi, 1250 W yüksek güçte 45 saniye boyunca mikrodalga radyasyonu ile sterilize edilmelidir (bkz. Tüm prosedürü steril bir ortamda taşıdığınızdan emin olun.</li>
	<li>Bromofenol mavisini 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek virüs çözeltisiyle karıştırın.</li>
	<li>Virüsü buzun üzerine yerleştirin ve buz kovasını vivaryuma getirin.</li>
</ol>3. Hayvan hazırlama
<ol><li>Bir dişi fareyi 2 μL / g anestezik intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi yapın (37.6 mg / mL ketamin, 1.92 mg / mL ksilazin ve 0.38 mg / mL asepromazin , bkz. Bir ayak parmağı tutamağı ile anestezi derinliğini kontrol edin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere merhem sürün. NOT: Fare, iyi bir anestezi altında ayak parmağının sıkışmasına yanıt vermemelidir. İzofluran ayrıca fareleri uyuşturmak için de kullanılabilir.</li>
	<li>Fareyi sıcak bir ped üzerinde sırtüstü pozisyona getirin ve yapışkan bant kullanarak dört uzuvun tümünü tezgaha takın.</li>
	<li>Enjekte edilecek bir meme ucunu (veya daha fazlasını) tanımlayın (bu çalışma için 4 numara tercih edilir). Bir çift makas kullanarak çevredeki saçları keserek açığa çıkarın.</li>
	<li>Meme ucunu temizlemek ve açığa çıkarmak için meme başı bölgesine üç tur halinde% 70 alkol ve iyodofor çubukları uygulayın.</li>
</ol>4. İntraduktal virüs enjeksiyonu
NOT: Meme ucu açıklığını görselleştirmeye yardımcı olmak için bir büyüteç lambası kullanılabilir.
<ol><li>Bir çift steril mikrodiseksiyon yay makası kullanarak meme ucunun distal ucunu, bir büyüteç lambasının altında küçük bir merkezi duktal açıklık görülene kadar transekte edin (bkz.</li>
	<li>Şırıngaya 10 μL virüs/bromofenol mavisi karışımı yükleyin. NOT: Bu gösterimde Lenti-EGFP (FUCGW) ve RCAS-Erbb2 (Neu) kullanılmıştır.</li>
	<li>İğneyi büyüteç lambasının yardımıyla meme ucu açıklığına dikkatlice yerleştirin. İğnenin oryantasyonu, ana kanalla hizalanmak için medialden laterale hafifçe ayarlanır.</li>
	<li>Virüsün 10 μL'sinin tamamını kanal ağacına enjekte edin. NOT: Enjeksiyon başarılı olursa, cildin altındaki kanallar maviye dönmelidir. Herhangi bir direnç veya lokalize bir renk değişiminin ortaya çıkması, enjeksiyonun başarısızlığını gösterir.</li>
	<li>Fare tamamen uyanana kadar (~ 30-60 dakika) fareyi 45 ° C'de ayarlanmış bir slayt ısıtıcısına koyun.</li>
</ol>5. Enfekte hücrelerin floresan stereomikroskop ile tespiti
<ol><li>GFP veya diğer floresan genleri taşıyan virüsün enjeksiyonundan üç ila beş gün sonra, fareyi 4 uL / g anestezik (37.6 mg / mL ketamin, 1.92 mg / mL ksilazin ve 0.38 mg / mL asepromazin) ile aşırı dozlayarak ötenazi yapın.</li>
	<li>Göğüs boşluğunu açın. Cildi ventral orta çizgi boyunca ve bir çift makas kullanarak üst ve alt ekstremiteler boyunca kesin. Cildi kaldırın ve meme bezlerini açığa çıkarın.</li>
	<li>Enjekte edilen meme bezini bir çift forseps ve makas kullanarak deriden çıkarın. Ayrıca, enjekte edilmemiş bir bezi kontrol olarak çıkarın.</li>
	<li>Meme bezlerini cam slaytlara yerleştirin ve bezleri orijinal şekillerine yayın.</li>
	<li>Bezleri floresan stereomikroskop altında gözlemleyin ve görüntüleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen%2C+D-A+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research.+Eds+Margot%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Costantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+a+rabbit+beta-globin+gene+into+the+mouse+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line.</a> Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).</li>
<li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+expression+of+herpes+thymidine+kinase+in+mice+following+injection+of+a+fusion+gene+into+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs.</a> Cell. 27 (1), 223-231 (1981).</li>
<li>Du, Z., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCAS-TVA+in+the+mammary+gland%3A+an+in+vivo+oncogene+screen+and+a+high+fidelity+model+for+breast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation.</a> Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+precancerous+stem+and+non-stem+cells+evolve+into+cancers+of+distinct+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes.</a> Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+6a+marks+mammary+bipotential+progenitor+cells+that+can+give+rise+to+a+unique+tumor+model+resembling+human+normal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer.</a> Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+an+alveolar+cell+of+origin+to+the+high-grade+malignant+phenotype+of+pregnancy-associated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer.</a> Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).</li>
<li>Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+cells+with+active+Wnt+signaling+resist+ErbB2-induced+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis.</a> PLoS One. 8 (11), 78720(2013).</li>
<li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+oncogenes+into+mammary+glands+in+vivo+with+an+avian+retroviral+vector+initiates+and+promotes+carcinogenesis+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).</li>
<li>Siwko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-mediated+oncogene+introduction+into+mammary+cells+in+vivo+induces+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors.</a> Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).</li>
<li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).</li>
<li>Russell, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+the+mammary+epithelium+with+adenovirus+vectors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo.</a> Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).</li>
<li>Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated-virus-mediated+transduction+of+the+mammary+gland+enables+sustained+production+of+recombinant+proteins+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk.</a> Scientific Reports. 5, 15115(2015).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Mitani, K., Kubo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+as+an+integrating+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adenovirus as an integrating vector.</a> Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).</li>
<li>McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Bu, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+of+lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+rat+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+individual+somatic+mammary+cells+in+vivo+reveals+a+master+role+of+STAT5a+in+inducing+alveolar+fate+commitment+and+lactogenesis+even+in+the+absence+of+ovarian+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones.</a> Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+preclinical+prevention+of+increased+breast+cancer+risk+caused+by+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy.</a> eLife. 2, 00996(2013).</li>
<li>Reddy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+ATM-mediated+barrier+to+tumorigenesis+in+somatic+mammary+cells+following+ErbB2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PR+status+of+the+originating+cell+of+ER%2FPR-negative+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors.</a> Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).</li>
<li>Young, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+pro-survival+protein+BCL-2+to+prevent+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer.</a> Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).</li>
<li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+lentiviral+vector+exposures+and+prevention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+and+Environmental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krt6a-positive+mammary+epithelial+progenitors+are+not+at+increased+vulnerability+to+tumorigenesis+initiated+by+ErbB2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2.</a> PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+into+a+defined+subset+of+mammary+cells+demonstrates+that+the+initiating+oncogenic+mutation+defines+the+resulting+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype.</a> International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).</li>
<li>Hein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+epithelial+cells+within+the+mammary+gland+can+produce+basal+cells+upon+oncogenic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress.</a> Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+CRISPR-Cas9+base+editing+for+the+development+of+genetically+engineered+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer.</a> EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+invasive+lobular+breast+carcinoma+by+CRISPR%2FCas9-mediated+somatic+genome+editing+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland.</a> Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).</li>
</ol>

Her iki yazar da çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bu makalede, sporadik meme kanserini modellemek için fare meme epitel hücrelerine genleri sokmak için viral intraduktal enjeksiyon tekniği gösterilmektedir. Genellikle, en az 5 hafta veya daha büyük farelere enjekte edilir, böylece onkojenik süreç meme bezi geliştikten sonra başlar. Ayrıca, 5 haftalıktan küçük farelerin meme ucu açıklığı genellikle enjeksiyon için çok küçüktür. Öte yandan, çok yaşlı farelerin meme uçları bazen dejenere olur ve transeksiyon duktal bir açıklığı ortaya çıkaramayabilir. Bazı transgenik veya ...

Meme bezlerinin epitel hücreleri, bu bezlerin işlevinde önemli bir rol oynar ve meme kanserinin ana menşe hücresidir. Meme bezi biyolojisi ve tümörigenez çalışmaları sıklıkla bu hücrelere ilgi çekici genlerin verilmesini gerektirir. Her fare meme bezi, meme ucunun ucunda tek bir açıklığa sahip epitel hücreleri tarafından kaplanmış bir duktal ağaçtan oluşur. Bu yapı, meme epitel hücrelerini, intraduktal enjeksiyon1 yoluyla bir duktal ağacın lümenine verilebilen viral vektörlere kolayca erişilebilir hale getirir.
Meme intraduktal enjeksiyon tekniği başlangıçta keçi, tavşan ve sıçan gibi çok daha büyük hayvanlar için kullanılmıştır1. Fareler gibi çok daha küçük bir hayvan için, intraduktal enjeksiyon birçok hassas alete ve operatörlerin daha fazla uygulamasına ihtiyaç duyar. Fare intraduktal enjeksiyonu için iki yaklaşım vardır. Biri meme ucu enjeksiyonu1'dir. Bir diğeri, cerrahi maruziyetten sonra # 3 veya # 4 meme bezinin birincil kanalının doğrudan enjeksiyonudur1. Birincisi, operatör iyi eğitildikten sonra non-invaziv ve daha hızlı olduğundan, bu teknik daha yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu makalede ayrıntılı olarak açıklanacaktır.
İlgilenilen genin mikroenjeksiyon yoluyla döllenmiş yumurtalar aşamasında tanıtıldığı yaygın olarak kullanılan geleneksel transgenik fare modelleriyle karşılaştırıldığında 2,3,4, intraduktal virüs enjeksiyon yöntemiyle gen dağıtımının aşağıdakiler de dahil olmak üzere birçok avantajı vardır: (1) ilgilenilen her gen için transgenik bir fare çizgisi yapmanın zaman alıcı sürecinden kaçınır; (2) ilgili gen tarafından dayatılan meme bezlerinin normal gelişimi üzerindeki potansiyel bozulmayı önler; (3) İlgilenilen geni doğumdan sonra istenen herhangi bir zamanda tanıtır; (4) birden fazla ilgili geni kolayca birlikte tanıtabilir; (5) doğal tümörojenik süreci daha iyi taklit eder, çünkü enfekte olmuş ve dolayısıyla onkogen taşıyan hücreler normal hücrelerle çevrilidir; ve (6) TVA (tümör virüsü A, bir kuş hücre yüzey proteini ve retrovirüs RCAS vektörü için reseptör) teknolojisi5 ile kombinasyon halinde, ilgili gen, tümörigenezin hücre kökenini incelemek ve meme bezlerinde hücre soy izleme testleri yapmak için belirli bir hücre popülasyonuna sokulabilir 6,7,8, 9.
Retrovirüs 10, lentivirüs11,12, adenovirüs 13 ve adenovirüs ilişkili virüs (AAV) 14'ten türetilen herhangi bir vektör, genetik materyallerin intraduktal dağıtımı için kullanılabilir. Retrovirüs ve lentivirüs vektörleri konakçı genomuna kalıcı olarak entegre olur; Böylece, ilgilenilen genleri meme epitel hücrelerine istikrarlı bir şekilde sokarlar. Lentivirüs, karşılaştığı herhangi bir hücrenin genomuna entegre olabilirken,15, retrovirüsün etkili genomik entegrasyonu, hedef hücrelerin çoğalmasına ihtiyaç duyar16. Adenoviral ve AAV vektörleri, enfekte olmuş hücrelerin genomuna entegre olmaz ve bu nedenle, sadece geçici olarak ilgilenilen geni eksprese eder17,18. Bu özellik, ilgili genin, flokslu bir tümör baskılayıcı genin silinmesi için Cre gibi kısa bir süre için ifade edilmesi gerektiğinde bir avantaj olabilir.
Lentivirüs, adenovirüs ve AAV, karşılaştıkları fare hücrelerini enfekte eder. Ancak luminal epitel, bazal membran tarafından stromadan daha da ayrılan altta yatan bazal tabakadan büyük ölçüde izole edildiğinden, intraduktal enjeksiyon, enfeksiyonu büyük ölçüde meme kanserinin birincil hücresi olan luminal epitel hücrelerine sınırlar. Bu luminal epitel tabakası içinde, kök hücreler, progenitör hücreler ve birkaç farklılaşmış hücre grubu dahil olmak üzere farklı hücre alt tipleri de vardır. Luminal hücre popülasyonu içindeki spesifik hücre alt kümelerini enfekte etmek için, kuş lökoz virüsü türevi RCAS vektörleri 5,10 veya psödotiplenmiş lentiviral vektörler11'in, sadece kök hücrelerde aktif olan bir promotör 6 veya belirli progenitörlerdeaktif olan bir promotör gibi hücre tipine özgü bir promotörün kontrolü altında bir tva transgeni taşıyan farelerde TVA'yı eksprese eden hücreleri seçici olarak enfekte ettiği TVA teknolojisi kullanılabilir. 7 veya alveolar hücreler8 veya Wnt yolu aktif hücreler9.
Bu protokol, bir viral vektörün intraduktal enjeksiyonu yoluyla meme epitel hücrelerine ilgili genlerin sokulması tekniğini sunar. Tanıtılan genlerin ekspresyonunun ve bunun sonucunda ortaya çıkan hiperplastik lezyonların ve tümörlerin tespiti daha sonra gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Anti-HA antikoru</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Seyreltme: 1: 1000</td></tr><tr><td>Yapay Gözyaşları</td><td>Covetrus</td><td>NDC 11695-0832-1</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma</td><td>B5525</td><td>mikrodalga radyasyonu 1250W mikrodalga fırının yüksek gücünde 45 saniye boyunca</td></tr><tr><td>FACSCantoII</td><td>BD Biosciences</td><td>V96100899</td><td></td></tr><tr><td>Floresan stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ16 FA</td><td></td></tr><tr><td>FUCGW lenti-virüs</td><td>Kendi kendine yapılan</td><td>N/A Referans</td><td># 12</td></tr><tr><td>FVB/N</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>JAX:001800</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton iğnesi</td><td>Hamilton</td><td>91033</td><td>otoklavlı</td></tr><tr><td>Hamilton şırınga</td><td>Hamilton</td><td>201000</td><td>otoklavlı</td></tr><tr><td>LED büyüteç lambası</td><td>Intertek</td><td>3165273</td><td></td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon yaylı makas</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>otoklavlanmış</td></tr><tr><td>MMTV-tva</td><td>Kendi kendine yapılan</td><td></td><td>Referansa bakın # 10</td></tr><tr><td>RCAS-Neu (HA)</td><td>Kendi kendine yapılan</td><td>N/A</td><td>Referansa bakın # 10</td></tr><tr><td>Kemirgen Komboanestezik III</td><td>Veteriner</td><td>Eczanesi Veteriner reçetesi</td><td>37.6 mg / mL ketamin, 1.92 mg / mL ksilazin ve 0.38 mg / mL asepromazin</td></tr></tbody></table>

İn vivo meme İntraduktal enjeksiyon yoluyla fare meme epitel hücrelerine gen İletimi

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Fare meme bezleri, epitel hücreleri tarafından kaplanmış ve her meme ucunun ucunda bir açıklığa sahip olan duktal ağaçlardan oluşur. Epitel hücreleri meme bezi fonksiyonunda önemli bir rol oynar ve çoğu meme tümörünün kökenidir. İlgilenilen genlerin fare meme epitel hücrelerine tanıtılması, epitel hücrelerinde gen fonksiyonunun değerlendirilmesinde ve fare meme tümörü modellerinin oluşturulmasında kritik bir adımdır. Bu hedef, ilgilenilen genleri fare meme duktal ağacına taşıyan viral bir vektörün intraduktal enjeksiyonu ile gerçekleştirilebilir. Enjekte edilen virüs daha sonra meme epitel hücrelerini enfekte eder ve ilgilenilen genleri getirir. Viral vektör lentiviral, retroviral, adenoviral veya adenovirüs ilişkili viral (AAV) olabilir. Bu çalışma, ilgilenilen bir genin, viral bir vektörün fare meme intraduktal enjeksiyonu yoluyla meme epitel hücrelerine nasıl verildiğini göstermektedir. GFP taşıyan bir lentivirüs, verilen bir genin stabil ekspresyonunu göstermek için kullanılır ve onkogen kaynaklı atipik hiperplastik lezyonları ve meme tümörlerini göstermek için Erbb2 (HER2 / Neu) taşıyan bir retrovirüs kullanılır.

Burada başarılı intraduktal enjeksiyon, başarılı viral enfeksiyon ve verilen genlerin meme tümörigenezi üzerindeki etkisini göstermek için temsili veriler sunulmuştur. Enjekte edilen virüs miktarı, her deneyin amacına göre uyarlanmalıdır. Meme kanalı ağacının ne kadar yaygın bir şekilde enfekte olabileceğini göstermek için, GFP gibi görüntülenebilen çok miktarda virüs taşıyan genin kullanılması gerekir. Öte yandan, doğal spontan tümörigenezi taklit etmek için, bir onkogen taşıyan az miktarda virüs kullanılmalıdır, böylec...

Bu protokol, ilgilenilen genleri meme epitel hücrelerine iletmek için meme ucu yoluyla viral vektörlerin intraduktal enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

İn Vivo Meme İntraduktal Enjeksiyon Yoluyla Fare Meme Epitel Hücrelerine Gen İletimi

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Bu yöntem, genetik materyali meme bezi epitel hücrelerine özel, geçici ve kantitatif olarak kontrol edilebilir bir şekilde iletir. Genetik materyalin meme epitel hücrelerine verilmesi özel, geçici ve kantitatif olarak kontrol edildiğinden, bu yöntemle üretilen meme modelleri doğal tümör oluşumunu daha iyi taklit eder. 33 gauge metal göbek iğnelerini yaklaşık bir santimetre uzunluğa kadar keserek ve alkolde saklayarak şırınga hazırlamaya başlayın.Şırıngaları ve iğneleri alkolden çıkarın ve kalan alkolü şırınga ve iğnelerden dışarı itin. Daha sonra hava kurutması için şırıngayı sökün. Kuruduktan sonra, şırıngayı monte edin.Viral stok tüplerini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözün. Bromofenol mavisi eklemek için, pipet ucunu bromofenol mavisi tozuna bir santimetre derinliğe batırın. Daha sonra ekli eser miktarda bromofenol mavisini virüs süspansiyonuna getirin.Virüsü buzun üzerine yerleştirmeden önce bromofenol mavisini 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek virüs çözeltisiyle karıştırın. Anestezi uygulanan dişi farenin ayak parmağını sıkıştırarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Hayvan anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere merhem sürün.Fa

in-vivo-gene-delivery-into-mouse-mammary-epithelial-cells-through

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, fare meme bezlerinin kanallarına enjeksiyon karışımı verdiğimiz bir intraduktal enjeksiyon tekniği açıklanmaktadır.

İntraduktal Enjeksiyon: Fare Meme Bezinin Kanallarına Enjeksiyon Karışımının Verilmesi

Fare meme bezi sulu reaktiflerin non-invazif intraduktal teslimat için bir protokol tarif edilmektedir. Bu yöntem, özellikle meme kanalları hedef meme bezlerinin meme lokalize enjeksiyon yararlanır. Bu teknik, siRNA, kemoterapötik maddeler ve küçük moleküller de dahil olmak üzere çeşitli bileşikler için uyarlanabilir.

Fare meme bezi Lokalize İlaç Teslim Intradüktal Enjeksiyon

Klinik açıdan uygun bir metastatik meme kanseri duktal meme sistemi sonuçları içine adenovirüs-Cre ile gizli mutasyonlar aktivasyonu. YFP bir promoter dahil edilmesi uzak metastatik tümör hücrelerinin izleme sağlar. Bu model, latent metastazı, anti-tümör bağışıklık ve meme kanseri tedavisi için yeni immünoterapiler tasarımı için incelemek için yararlı olan.

Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Kanser tümörü çevreleyen dokunun hem de yerel pro- ve anti-inflamatuar aracılar tarafından etkilenir kompleks bir hastalıktır. Bu nedenle, daha çok deri altı modellere göre ortotrop enjeksiyon modelleri, bir şekilde daha iyi taklit eden insan patoloji kanser ilerlemesinin incelemek için yararlı olabilir.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Burada, reaktiflerin intraduktal enjeksiyon yoluyla tavşan meme bezine lokalize olarak verilmesi için bir teknik açıklıyoruz. Ek olarak, kontrast maddelerin yüksek çözünürlüklü ultrason görüntülemesi ile görselleştirme ve teslimatın onaylanması için bir protokol açıklıyoruz.

Rabbit Meme Bezi için İntraduktal Teslimat

Burada, biz meme kanseri hücrelerinin basit, daha az invaziv ve ele kolay bir şekilde meme yağ yastığı içine implant için bir protokol mevcut ve bu fare orthotopic meme kanseri model uygun meme yağ yastığı yapısına sahip çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir kanser.

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

Bu protokol amacı yeni bir meme kanseri modelleme yaklaşımı CRE-ifade adenovirüsü fare meme bezleri içine intraduktal enjeksiyon dayalı açıklamak için. Bu yaklaşım, Onkojenik olayların hem hücre tipi hem de Organ spesifik manipülasyon geçici olarak kontrollü bir şekilde sağlar.

CRE-ifade Adenovirus fare mammary bezi içine bir Intraductal enjeksiyon yoluyla meme kanseri modelleme

İn vivo görüntüleme ve meme kanserini önleme için fare meme düktal ağacına etanol bazlı ablatif bir çözüm için reaktiflerin intradüktal enjeksiyon yöntemi açıklanmıştır. Doğrudan meme ucu açıklığına enjeksiyon, meme epitel hücrelerinin minimum kollateral doku hasarı ile hedeflenmesini sağlar.

Fare Modellerinde Meme Kanserinin Önlenmesi ve Lokal Tedavisi için Etanol Bazlı Ablatif Çözümün İntradüktal Doğumu ve Röntgen Görselleştirmesi

Mevcut protokol, lazer taramalı konfokal ve multifoton mikroskobu ile emziren fare meme bezinin intravital görüntülenmesi için kolay bir tekniği tanımlamaktadır.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

Öğrenin fare meme epitel hücrelerine viral vektörlerle gen iletimi yöntemini. Bu teknik, meme kanseri modellerinde doğal tümör oluşumunu taklit ederek kontrollü gen transferi sağlar.

İn Vivo Meme İntraduktal Enjeksiyon Yoluyla Fare Meme Epitel Hücrelerine Gen İletimi

Daha fazla video keşfet