Name: Çok Kuyulu Mikroelektrot Dizilerinde İnsan İn Vitro Nöral Kültürlerinin Odaklanmış Ultrason Nöromodülasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: Öğrenin, odaklanmış ultrason ile HiPSC kaynaklı nöronlarda nöromodülasyon parametrelerini belirlemeyi. Bu yöntem, Parkinson ve diğer nörolojik bozukluklar için cerrahi riskleri ortadan kaldırarak optimal uyarım koşullarını sistematik olarak analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Amir Manbachi ve Nitish Thakor, Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı, DARPA, Ödül Sözleşmesi: N660012024075'den fon desteğini kabul ediyor. Buna ek olarak, Amir Manbachi, Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından yönetilen Johns Hopkins Klinik ve Translasyonel Araştırma Enstitüsü'nün (ICTR) Klinik Araştırma Akademisyenleri Programı'ndan (KL2) fon desteğini kabul etmektedir. Nitish Thakor, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH) fon desteğini kabul ediyor: R01 HL139158-01A1 ve R01 HL071568-15.

1. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Kültür ortamını aspire edin ve gömülü MEA ile 24 oyuklu bir nöron kültürü plakasındaki tek bir kuyucuğu doldurmak için kullanın (Şekil 2A). Taga ve ark.13 tarafından yayınlanan protokolü izleyerek nöronları kültürleyin ve indükleyin.</li>
	<li>Parafilm arayüzünü, lastik bandı ve FUS konisini kauçuk membranı ile %70 etanol kullanarak 10 dakika sterilize edin ve daha sonra monte etmek üzere çeker ocak içine yerleştirin.</li>
	<li>300 mL deiyonize su ve 50 mL birleştirme jelinin gazını alın. Birleştirme ortamında kavitasyona neden olmasını önlemek için suyu ve jeli 160 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. NOT: HiPSC'lerin orijinal kaynağı GM01582 ve CIPS hücre hatlarındandır. Ortalama olarak, kuyu başına 5 x 104 motor nöron ve 2.5 x 104 astrosit yoğunluğu elde edilebilir14.</li>
</ol>2. Çevre birimlerinin bağlantısı ve kurulumu
<ol><li>FUS konisini vidalar kullanarak dönüştürücüye sabitleyin ve koniyi havalandırmalı steril bir başlıkta esnek bir kauçuk membranla kapatın. Koniyi adım 1.3'ten itibaren gazı alınmış ve deiyonize edilmiş (DG-DI) suyla doldurun ve kavitasyonu önlemek için konide kabarcık olmadığından emin olun.</li>
	<li>3D baskılı tutucuyu bir çerçeveye sabitlemek için özelleştirilmiş bir dişli çubuk kullanın (Şekil 2B). Çerçeveyi, FUS dönüştürücünün kafası uyarılacak kuyunun üzerinde olacak şekilde konumlandırın.</li>
	<li>Ortamı ve HiPSC'leri içeren 24 oyuklu MEA plakasındaki kuyu üzerinde parafilmi sabitlemek için bir lastik bant kullanın.</li>
	<li>Ultrason dönüştürücüsünün arka uç sürücü elektroniğini, bu durumda dönüştürücü güç çıkışını (TPO; Şekil 3A), 100-240 V'luk bir elektrik prizine (Şekil 3B, Bağlantı 6) ve eşleşen ağı TPO ve FUS dönüştürücüye bağlama (sırasıyla Şekil 3B, Bağlantı 1 ve Bağlantı 2). Eşleşen ağ, dönüştürücü ve TPO arasında verimli bir elektrik bağlantısı sağlar.</li>
	<li>MEA sistemini bir elektrik prizine (100-240 V) bağlayın (Şekil 3B, Bağlantı 5). MEA sistem senkronizasyon bağlantı noktasını TPO'ya bağlayın (Şekil 3B, Bağlantı 3). Bu bağlantı, MEA sistemi tarafından veri alımını FUS stimülasyonu ile senkronize edecektir.</li>
	<li>24 oyuklu MEA plakasını MEA sistemine yerleştirin ve dönüştürücü ile kuyu arasında doğrudan temas sağlamak için kapağı çıkarın. Adım 5'de açıklandığı gibi, gazdan arındırılmış kuplaj jeline yer açmak için dönüştürücüyü kuyu plakasının 10-3.2 mm yukarısına yerleştirin (Şekil 3A ve Şekil 2B).</li>
</ol>3. Stimülasyon ve nöronal sinyal alımı
<ol><li>TPO kontrol panelinde FUS parametrelerini ayarlayın (Tablo 1).</li>
	<li>Birleştirme jelini parafilmin üzerine uygulayın ve FUS dönüştürücüyü bağlantı jeline indirin, jel ile minimum hava kabarcığı ile temas sağlayın (Şekil 2A).</li>
	<li>Kullanıcı arayüzündeki Başlat düğmesine tıklayarak MEA sistem kaydını başlatın.</li>
	<li>TPO'daki sağ alt düğmeye basarak FUS sonikasyonunu başlatın (Şekil 3A, Etiket 7) ve nöronların temel duruma dönmesine izin vermek için her sonikasyon turu arasında en az 5 dakika bekleyin.</li>
	<li>FUS stimülasyon dizisini MEA kaydına hizalamak için FUS sistemi tarafından üretilen tetikleme darbesini kullanın (Şekil 3B, Bağlantı 3).</li>
</ol>4. Veri işleme ve analiz
<ol><li>Bir USB bağlantısı kullanarak verileri MEA sisteminden bilgisayara aktarın (Şekil 3B, Bağlantı 4). Deneme Kurulumu panelini tıklayarak bu işlemi başlatın. Ardından, kaydetmek istediğiniz veri türünü seçin. Bu durumda, ham sivri uçlar önerilir. Son olarak, dosyayı adlandırın ve aktarımı tamamlamak için disk sürücüsünde istediğiniz konumu seçin. NOT: Aşağıdaki adımlar, https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod'de yayınlanan Python betiği çalıştırılarak gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>16 elektrotun her birinden gelen verileri okuyun.</li>
	<li>Butterworth sırası 8 ile 5 Hz ila 3 kHz bant genişliğine sahip bir Butterworth bant geçiren filtre uygulayın. NOT: Bu değerleri optimize etmek için, belirli hücrelerin ateşleme hızını ve ilgili hücre sayısını hesaba katmak çok önemlidir. Bu 2 değeri çarparak, deneydeki hücre popülasyonunun genel ateşleme hızı tahmin edilebilir.</li>
	<li>Sinyali yumuşatmak için σ = 3 olan bir Gauss filtresi uygulayın. NOT: Aşırı yumuşatma, alımdan sonra veri bozulmasına neden olabileceğinden ve çok az yumuşatma istenmeyen gürültüye neden olacağından, parametre MEA sisteminden önerilen değerlere göre optimize edilebilir.</li>
	<li>Potansiyel ani artışları tespit etmek için Gauss ile yumuşatılmış sinyalin standart sapmasının 5 katı olarak bir eşik ayarlayın.</li>
	<li>16 kanalın tamamında 50 ms'lik bir pencerede kaydedilen ani yükselme sayısını pencerenin uzunluğuna (yani 50 ms) bölerek ateşleme hızını hesaplayın. Sinyal boyunca pencereyi bir sonraki kareye kaydırın ve ateşleme hızı hesaplamasını tekrarlayın (Ek Şekil 1).</li>
	<li>FUS ile ilişkili ateşleme hızındaki değişikliğe bağlı olarak aktarılan verilerden FUS sonikasyon süresini okuyarak sinyali analiz edin.</li>
</ol>5. Çok kuyulu MEA plaka temizleme ve yeniden kullanım
<ol><li>Deneyler tamamlandıktan sonra, elektrot yüzeyinden kaçınmaya dikkat ederek, ortamı çok kuyulu plakadaki oyuklardan dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL DG-DI su ekleyin. Aspire edin ve bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Herhangi bir hücreyi ve döküntüyü çıkarmak için, plakaya 10 mL steril DG-DI su (oyuk başına 0.3 mL) ile 1 g enzimatik deterjan Terg-A-Zyme karışımı ekleyin. Gece boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe etmeye bırakın.</li>
	<li>Ertesi gün, çözeltiyi kuyulardan çıkarın ve 1 mL steril DG-DI su ile durulayın.</li>
	<li>Çok kuyulu plakayı 5-7 dakika inkübe edin ve aspire edin. Bu adımı 5 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Kuyucuk başına 0,5 mL steril DG-DI su ekleyin. MEA plakasının temiz olduğunu doğrulamak için temizlenmiş çok kuyulu plakanın taban çizgisini kaydedin. Temizlenmiş bir plaka, düşük yoğunluk değerlerine sahip Gauss gürültü desenleri sergilemelidir.</li>
	<li>Temizlenmiş çok kuyulu plakayı tekrar kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. MEA'ların depolandığı suyu ayda en az bir kez değiştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+neuromodulation%3A+Mechanisms+and+the+potential+of+multimodal+stimulation+for+neuronal+function+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment.</a> Frontiers in Physics. 8, 150(2020).</li>
<li>Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManbachi%2C+A+%22The+Abundant+Promise+of+Ultrasound+in+Neurosurgery%3A+A+Broad+Overview+and+Thoughts+on+Ethical+Paths+to+Realizing+Its+Benefits%22">The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits</a>. , SPIE PRESS. Bellingham. Washington, USA. (2022).</li>
<li>Manbachi, A. Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner's Guide to Fundamental Physics & Medical Ultrasound Applications. Audible. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83">https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83</a> (2021).</li>
<li>Yoo, S., Mittelstein, D. R., Hurt, R. C., Lacroix, J., Shapiro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+excites+cortical+neurons+via+mechanosensitive+calcium+accumulation+and+ion+channel+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound excites cortical neurons via mechanosensitive calcium accumulation and ion channel amplification.</a> Nature Communications. 13 (1), 493(2022).</li>
<li>Szczot, M., Nickolls, A. R., Lam, R. M., Chesler, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+form+and+function+of+PIEZO2%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The form and function of PIEZO2.</a> Annual Review of Biochemistry. 90, 507-534 (2021).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+ultrasound+ring+array+transducers+for+transcranial+ultrasound+neuromodulation+of+freely-moving+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%3A+Basic%2C+Translational%2C+and+Clinical+Research+in+Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Miniature ultrasound ring array transducers for transcranial ultrasound neuromodulation of freely-moving small animals.</a> Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 12 (2), 251-255 (2019).</li>
<li>Hoffman, B. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+excites+action+potentials+in+mammalian+peripheral+neurons+in+part+through+the+mechanically+gated+ion+channel+PIEZO2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound excites action potentials in mammalian peripheral neurons in part through the mechanically gated ion channel PIEZO2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), e2115821119(2022).</li>
<li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanobiology+of+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li>
<li>Collins, M. N., Legon, W., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+thermal+effects+of+focused+ultrasound+on+an+identified%2C+single+motoneuron%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The inhibitory thermal effects of focused ultrasound on an identified, single motoneuron.</a> eNeuro. 8 (2), (2021).</li>
<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosensory+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurosensory mechanotransduction.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (1), 44-52 (2009).</li>
<li>Launay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM4+Is+a+Ca2%2B-activated+nonselective+cation+channel+mediating+cell+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRPM4 Is a Ca2+-activated nonselective cation channel mediating cell membrane depolarization.</a> Cell. 109 (3), 397-407 (2002).</li>
<li>Cain, S. M., Snutch, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+T-type+calcium+channel+isoforms+to+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Contributions of T-type calcium channel isoforms to neuronal firing.</a> Channels. 4 (6), 475-482 (2010).</li>
<li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+electrophysiological+platform+for+modeling+ALS+with+regionally-specific+human+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62726(2021).</li>
<li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multielectrode+array+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multielectrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li>
<li>Manuel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+neuromodulation+depends+on+pulse+repetition+frequency+and+can+modulate+inhibitory+effects+of+TTX%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrasound neuromodulation depends on pulse repetition frequency and can modulate inhibitory effects of TTX.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15347(2020).</li>
<li>Treeby, B. E., Cox, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((k-wave%3A+Matlab+toolbox+for+the+simulation+and+reconstruction+of+photoacoustic+wave+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">k-wave: Matlab toolbox for the simulation and reconstruction of photoacoustic wave fields.</a> J. Biomed. Opt. 15 (2), 021314(2010).</li>
<li>Akhtar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+peripheral+focused+ultrasound+neuromodulation+of+the+celiac+plexus+ameliorates+symptoms+in+a+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive peripheral focused ultrasound neuromodulation of the celiac plexus ameliorates symptoms in a rat model of inflammatory bowel disease.</a> Experimental Physiology. 106 (4), 1038-1060 (2021).</li>
<li>Smirnova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+intelligence+%28OI%29%3A+The+new+frontier+in+biocomputing+and+intelligence-in-a-dish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Science%22%5BJournal%5D)">Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and intelligence-in-a-dish.</a> Frontiers in Science. 1, 1017235(2023).</li>
<li>Saccher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+neuromodulation+on+a+multi-well+MEA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectronic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound neuromodulation on a multi-well MEA.</a> Bioelectronic Medicine. 8 (1), 2(2022).</li>
<li>Yger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spike+sorting+toolbox+for+up+to+thousands+of+electrodes+validated+with+ground+truth+recordings+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A spike sorting toolbox for up to thousands of electrodes validated with ground truth recordings in vitro and in vivo.</a> eLife. 7, e34518(2018).</li>
<li>Babakhanian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+low+intensity+focused+ultrasound+on+liposomes+containing+channel+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Effects of low intensity focused ultrasound on liposomes containing channel proteins.</a> Scientific Reports. 8, 17250(2018).</li>
<li>Liang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+an+Accurate+Benchtop+Characterization+Device%3A+An+acoustic+measurement+platform+for+localizing+and+implementing+therapeutic+ultrasound+devices+and+equipment+%28amplitude%29%5BTitle%5D)+AND+%222022+Design+of+Medical+Devices+Conference%22%5BJournal%5D)">Designing an Accurate Benchtop Characterization Device: An acoustic measurement platform for localizing and implementing therapeutic ultrasound devices and equipment (amplitude).</a> 2022 Design of Medical Devices Conference. , Minneapolis, MN, USA. (2022).</li>
<li>Ko, H., Yoon, S. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+neuromodulation+with+gamma+oscillation+as+a+new+strategy+for+Alzheimer+disease%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Yeungnam+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Optogenetic neuromodulation with gamma oscillation as a new strategy for Alzheimer disease: A narrative review.</a> Journal of Yeungnam Medical Science. 39 (4), 269-277 (2022).</li>
<li>White, M., Mackay, M., Whittaker, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+optogenetics+into+the+human+brain%3A+Opportunities+and+challenges+in+clinical+trial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Access+Journal+of+Clinical+Trials%22%5BJournal%5D)">Taking optogenetics into the human brain: Opportunities and challenges in clinical trial design.</a> Open Access Journal of Clinical Trials. 2020, 33-41 (2020).</li>
</ol>

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler. Amir Manbachi, BK Medical (GE Healthcare) ve Neurosonics Medical için ders veriyor ve danışmanlık yapıyor ve patent bekleyen bir dizi FUS teknolojisinin mucidi. Betty Tyler, NIH'den araştırma fonuna sahiptir ve Hızlandırıcı Kombinasyon Terapilerinin (öz sermaye veya opsiyonlar dahil) ortak sahibidir. Ashvattha Therapeutics Inc., patentlerinden birini lisansladı ve Peabody Pharmaceuticals'ın hissedarı.

Bu makale, FUS nöromodülasyonu sırasında HiPSC'lerde nöronal aktiviteyi kaydetmek için kullanılabilecek yeni bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, farklı FUS transdüserlerine ve MEA sistemlerine genelleştirilebilir. Açıklanan protokolle gözlemlenen sonuçları çoğaltmak için araştırmacı, dönüştürücünün odak noktasının MEA kuyusunun taban alanından daha büyük olmasını sağlamalıdır. Ayrıca, farklı nöronal hücre hatları kullanılıyorsa, filtre parametrelerinin kuyu içindeki hücreler için beklenen frekans tepkisine ayarlanması gerekir. Temsili sonuçlar elde edilemiyorsa, yukarıda belirtilen parametrelerin değiştirilmesi düşünülmelidir (örneğin, patlama uzunluğu, yoğunluk, görev döngüsü, vb.).
Bu çalışma, FUS stimülasyonunu takiben ateşleme hızında bir artış göstermiş olsa da, herhangi bir sonuca varılmadan önce bu bulgunun tekrarlanabilirliğini göstermek için daha fazla veri toplanmalıdır. Bu protokol, tipik olarak doğrudan mikroelektrot akım sinyali kaydından kaynaklanan zayıflıklara sahip olan MEA sistemlerinin sınırlamalarını devralır. Nöronla doğrudan temas daha iyi hassasiyet sağlasa da, hücreyi değiştirebilir ve ölçüm doğruluğunu etkileyebilir. Ayrıca, kuyucukların küçük boyutu nedeniyle, sistemimiz nöromodülasyonda da rol oynayabilecek periferik dokuyu içermez17. Bu, bu kurulumdan çıkarılan sonuçların in vivo ortamlara uygulanabilirliğini sınırlayabilir. Daha karmaşık ağ yanıtlarını incelemek için, hassasiyetini artırmak için daha yüksek kanal yoğunluğuna sahip bir MEA sistemi tasarlanmalıdır18. Dönüştürücüyü tutmak ve doğru yerleştirmeyi sağlamak için bir 3D portal kullanmak da dahil olmak üzere, önerilen bu sistem için gelecekteki birkaç yön belirlenmiştir19. Bireysel nöronları sınıflandırmak için sivri bir sıralama algoritması20 kullanmak da dahil olmak üzere, işlem sonrası algoritma ile ilgili ek iyileştirmeler yapılabilir. Bu süreç, FUS mekanizmaları üzerine gelecekteki çalışmalarda çok birimli nöronların tepkilerini çözmek için faydalı olacaktır. En önemlisi, altta yatan mekanizmaları aydınlatmak için kimyasal, elektriksel ve optik uyaranlar gibi ek stimülasyon yöntemlerini dahil etmek esastır. Bu yöntemler, belirli iyon kanallarını15 inhibe ederek veya membran özelliklerini21 değiştirerek nöronal özellikleri ve davranışları değiştirebilir. Araştırmacılar, varsayımsal sinyal yolundaki ana faktörleri modüle ederek, kontrollü ortamlarda her bir faktörün katkılarını belirleyebilir ve nihayetinde oyundaki karmaşık etkileşimlere ışık tutabilir.
Elektriksel stimülasyon22 , klinik ve araştırma ortamlarında uzun bir başarılı uygulama geçmişine sahip, nöromodülasyon için en köklü tekniklerden biridir. Buna karşılık, FUS ve optogenetik23 , son yıllarda dikkat çeken nispeten yeni yöntemlerdir. FUS'un en büyük avantajları, invaziv olmaması ve elektriksel stimülasyon ve optogenetik dahil olmak üzere diğer tekniklerle ulaşılması zor olabilecek derinliklerde nöronları uyarma yeteneğidir. Bununla birlikte, optogenetik24 gibi, FUS'un da dalga yayılımının ve ilişkili nöronal yanıtların modellenmesiyle ilgili bazı sınırlamaları vardır. Dokunun heterojen akustik özelliklerinin karmaşıklığını in vivo olarak yakalamak zor olabilir, bu da basınç alanında ve sonuç olarak nöronal tepkilerde belirsizliklere yol açar. Bu özelliklerin doğru bir şekilde modellenmesindeki bu zorluk, tekniği belirli gerçek dünya uygulamaları için optimize ederken bir zorluk teşkil eder. İçsel karmaşıklıklar, kontrollü akustik yoğunluk koşulları altında yanıtların doğrudan incelenmesini sağladıkları için bu çalışmadaki gibi in vitro sistemlerin önemini vurgulamaktadır.
Sonuç olarak, bu sistem, FUS'un insan nöronları üzerindeki nöro-modülatör etkilerini incelemek için yüksek verimli, in vitro bir platform sağlar. Bu sistemle, kontrollü bir ortamda değişen seviyelerde ve tipte stimülasyona maruz kaldığında insan nöronlarından gelen elektriksel tepkiler ölçülerek FUS'un etki mekanizmaları araştırılabilir. Bu nedenle, sahada yaygın olarak kullanılan insan ve hayvan modellerine değerli bir tamamlayıcı araç sunar.

Fokuslu ultrason (FUS), milimetre altı çözünürlük 1,2,3 ile santimetre düzeyinde derinliklerde noninvaziv stimülasyon sağlayan umut verici bir nöromodülasyon yöntemidir. Bu güçlü yönlere rağmen, FUS'un klinik etkisi, kısmen etki mekanizması ile ilgili bilgi eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Sağlam bir teorik temel olmadan, araştırmacılar ve klinisyenler, tedaviyi değişen koşullar altında bireysel hastaların özel ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde uyarlamada zorluklarla karşılaşırlar. Yoo ve ark.4 tarafından önerilen önemli bir teori, mekanosensitif iyon kanallarının nöron aktivasyonundan sorumlu olduğunu öne sürmektedir. Bununla birlikte, bu teori, bu kanallardan yoksun olan insan beyni nöronlarındaki FUS aktivasyonunu açıklayamamaktadır5. Bu belirsizlik, tedavi sonuçlarını optimize etmek için FUS parametrelerinin ayarlanmasını engellediği için klinikte FUS kullanımını sınırlar.
Önceki ilgili çalışmalar, FUS'u destekleyen fizyolojik mekanizmaları araştırmak ve optimal stimülasyon parametrelerini belirlemek için bir dizi yaklaşım kullanmıştır. Bu süreçteki önemli bir adım, kalsiyum iyonu görüntüleme4, optik görüntüleme1 ve ex vivo elektrofizyolojik kayıt (örneğin, elektromiyografi6 veya deri-sinir elektrofizyolojisi7) gibi iyon kapısı izlemeyi içeren yöntemlerle elde edilebilen nöronal yanıtların geri bildirim olarak izlenmesini içerir. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu, insan olmayan nöronları veya in vivo yaklaşımları kullanır ve bu da optimal olmayan kontroller nedeniyle ek varyanslar ortaya çıkarabilir. Buna karşılık, in vitro insan kaynaklı pluripotent kök hücre (HiPSC) nöronlarındaki nöronal sinyalleri ölçmek için elektrotların kullanılması, daha hassas ölçümler ve deneysel ortam üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Bu çalışmada, Şekil 1'de gösterildiği gibi, FUS stimülasyonunu takiben HiPSC nöronlarının elektriksel tepkilerini ölçmek için mikro elektrot dizileri (MEA'lar) kullanılarak bir in vitro sistem geliştirilmiştir. Bu sistem, topluluktaki araştırmacılara, ultrason parametrelerini (örneğin, frekans, patlama uzunluğu, yoğunluk) değiştirirken nöronal tepkileri izleme yetkisi verir. Ek olarak, bu sistem, nöronların iyon kanalı işlevselliği genetik ve farmasötik olarak manipüle edilebildiğinden (örneğin, iyon kanallarını inhibe etmek için gadolinyum kullanılarak) fiziksel uyaranlara (örneğin, sıcaklık, basınç ve kavitasyon) karşı nöronal duyarlılığın yüksek düzeyde kontrol edilmesini sağlar.10,11,12. Bu moleküler düzeydeki kontrol, FUS'un nöromodülatör etkilerinin arkasındaki mekanizmaların aydınlatılmasına yardımcı olabilir.

<table><tbody><tr><td>MEA Sistemi</td><td>Axion Biyosistem A.Ş.</td><td>Maestro</td><td>Kenar Örnekleme Hızı: 11500 Hz</td></tr><tr><td>MEA Plaka</td><td>Axion Biosystem Inc.</td><td>CytoView MEA</td><td>Elektrot ve Kuyusu: 24 kuyuda 16 elektrot</td></tr><tr><td>Kuyu plakası Arayüzü</td><td>Amcor Inc.</td><td>Parafilm PM996; P7793</td><td>Kalınlık: 127 & mikro; m</td></tr><tr><td>CO2 Kültür için Tank ve Regülatör</td><td>AirGas Inc./ Harris Inc.</td><td>9296NC</td><td>Konsantrasyon: %5</td></tr> <tr><td>Kültür Ortamı</td><td>ThermoFisher Inc.</td><td>Laminin; 23017-015</td><td>Konsantrasyon: 1 & mikro; g/mL,</td></tr><tr><td>HiPSC Nöronları</td>, <td>Peprotech</td><td>, CIPS ve GM01582 Türetilmiş; 450-10</td><td>Konsantrasyon: 10 ng/mL (Bkz. Taga ve ark. [2021]13)</td></tr><tr><td>Dönüştürücü</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>CTX250; 008</td><td>Merkez Frekansı: 250 kHz</td></tr><tr><td>Eşleşen Ağ</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>CTX250; NFS102v2</td><td>Empedans: 50 ve omega;</td></tr><tr><td>Dönüştürücü Güç Çıkışı (TPO)</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>Sürüm 4.1; 020</td><td>Frekans: 250 kHz'den 2.5 MHz'e</td></tr><tr><td>kadar Membran</td><td>McMaster Inc.</td><td>Silikon Kauçuk; 5542N115</td><td>Kalınlık: 0.0127 cm</td></tr><tr><td>Kaplin Jeli</td><td>Parker Laboratuvar A.Ş.</td><td>Aquasonic 100; B08DDWG GXB</td><td>Viskozite: 130.000 &ndash; 185.000 polis</td></tr><tr><td>Prob sahibi</td><td>McMaster Inc.</td> ile bağlantı<td>Dişli Çubuk Çalmak; 90322A661</td><td>Uzunluk: 1 &ndash; 1/2" Uzun</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>ThermoFisher Inc.</td><td>Sorvall Efsanesi X1R; 75004261</td><td>Maksimum hızlanma: 10&ndash; 25.830 x g</td></tr><tr><td>Hidrofon</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>Y-104; 009</td><td>Aralık: 50 kHz&ndash; 1.9 MHz</td></tr><tr><td>Su Deposu</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>WT</td><td>Boyutu: 30 cm x 30 cm x 30 cm</td></tr><tr><td>Su Şartlandırma Ünitesi</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>WCU; SN006</td><td>Akış Hızı: 50 mL/s maksimum</td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>Rohde-Schwarz Inc.</td><td>RTC1002</td><td>Örnekleme hızı: 50 MHz'e kadar</td></tr><tr><td>Stage</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>Mikro Aşama; 2</td><td>Doğruluk: 1 & mikro; m</td></tr><tr><td>Termokromik levha</td><td>TIPTEMP Inc.</td><td>Sıvı Kristal Levha; TLCSEN337</td><td>Aralığı: 22&ndash; 24 & derece; C</td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td>Microsoft Surface</td><td>Pro</td><td>CPU i5 1035G4: 3.7 GHz</td></tr><tr><td>Veri Aktarım Yazılımı</td><td>Mathworks Inc.</td><td>MATLAB</td><td>Sürüm 2021b</td></tr><tr><td>İşleme Yazılımı</td><td>Python Yazılım Vakfı</td><td>Python</td><td>Sürüm 3.7.10</td></tr></tbody></table>

Çok kuyulu mikroelektrot dizilerinde İnsan İn vitro nöral kültürlerinin odaklanmış ultrason nöromodülasyonu

Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

Fokuslu ultrasonun (FUS) nöromodülatör etkileri hayvan modellerinde gösterilmiştir ve FUS insanlarda hareket ve psikiyatrik bozuklukları tedavi etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, FUS'un başarısına rağmen, nöronlar üzerindeki etkilerinin altında yatan mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır ve bu da FUS parametrelerini ayarlayarak tedavi optimizasyonunu zorlaştırmaktadır. Bilgideki bu boşluğu gidermek için, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (HiPSC'ler) kültürlenen nöronları kullanarak in vitro insan nöronlarını inceledik. HiPSC'lerin kullanılması, hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda insana özgü nöronal davranışların incelenmesine izin verir. Bu rapor, FUS'un HiPSC nöronları üzerindeki nöromodülatör etkilerinin izlenmesini ve ölçülmesini sağlayan yüksek verimli bir sistemin kullanılması için bir protokol sunmaktadır. Araştırmacılar, FUS parametrelerini değiştirerek ve HiPSC nöronlarını farmasötik ve genetik modifikasyonlar yoluyla manipüle ederek, nöral tepkileri değerlendirebilir ve FUS'un HiPSC nöronları üzerindeki nöro-modülatör etkilerini açıklayabilir. Bu araştırma, bir dizi nörolojik ve psikiyatrik bozukluk için güvenli ve etkili FUS tabanlı tedavilerin geliştirilmesinde önemli etkilere sahip olabilir.

Özetle, HiPSC'lerden kültürlenen nöronları kullanarak in vitro FUS nöromodülasyon monitörizasyonunu sağlayan bir protokol sunuyoruz. HiPSC ile indüklenen nöronları uyarmak ve analiz için karşılık gelen elektriksel tepkileri kaydetmek için genel sistem platformu Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu çalışma, Şekil 2'de gösterildiği gibi, nöronların FUS stimülasyonuna ve bir MEA sistemindeki elektriksel tepkilerin kaydedilmesine odaklanmaktadır. FUS ve MEA sistemlerinin çevresel bileşenleri ve bağlantıları Şekil 3'te gösterilmektedir.
Odak noktasının karakterizasyonu, kuyu tabanının FUS odak noktası tarafından tamamen kaplandığından emin olmak için nöronal deneylerden önce gerçekleştirilir. FUS sistemini değerlendirmek için Şekil 4'te gösterildiği gibi termokromik levhalar üzerindeki odak noktasının görselleştirilmesi yapılmalıdır. Odak noktası karakterizasyonunu takiben, filtreleme, eşikleme ve ateşleme hızının hesaplanması dahil olmak üzere işlem sonrası adımlar gerçekleştirilmelidir ve bunlar Şekil 5 ve Şekil 6'da özetlenmiştir. Bu adımlar, çevreden gelen gürültüyü filtreleyerek yararlı sinyaller almak ve böylece FUS'un neden olduğu nöronal aktivite değişiklikleri hakkında fikir edinmek için gereklidir. Şekil 6A-B'deki Raster grafikleri, her kanalda tespit edilen ani artışları göstermektedir. Kuyu tabanının tamamı FUS dönüştürücünün odak noktası içinde olduğundan, FUS'un tüm elektrotlardaki ateşleme hızını değiştirmesi beklenir. Ateşleme hızındaki bu değişiklik, Şekil 6C'de gösterilen ateşleme hızı grafiğinde görselleştirilir ve bu, seçilen stimülasyon parametrelerinin nöronal ateşleme hızında bir artışa neden olduğunu gösterir. Spesifik olarak, FUS öncesi (yani taban çizgisi) ateşleme hızı 140 Hz ± 116.7 Hz iken, FUS sonrası ateşleme hızı sürekli dalga FUS ile 786 Hz ± 419.4 Hz idi. Ek olarak, Şekil 6C, FUS parametrelerinin değiştirilmesinin (örneğin, sürekli dalga yerine darbeli dalga FUS kullanılması) ateşleme hızındaki değişimin büyüklüğünü nasıl değiştirebileceğini ve nöronların başlangıç durumlarına dönmeden önceki süreyi nasıl değiştirebileceğini göstermektedir. Düşük yoğunluklu odaklanmış ultrason (LIFU), özellikle termal lezyon elde etmeyi amaçlayan yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason ile karşılaştırıldığında, kültürlerin önemli ölçüde ısınmasına neden olmaz. Klinik olarak etkili sıcaklık değişiminin olmaması, teorik hesaplamalar ve simülasyonlarla desteklenmektedir (Ek Şekil 2). Tablo 1'de listelenen deneysel FUS parametrelerinin aşırı durumlarında bile, sıcaklıkta yaklaşık 0.04 °C'lik minimum bir artış gözlemlenebilir.
Bir ateşleme hızı grafiğinin kullanılması, FUS'un nöromodülatör etkilerinin ölçülmesini sağlar ve uyarıcı ve inhibitör yanıtlar arasında ayrım yapmak için kullanılabilir. Çok kuyulu MEA plakasının önemli bir avantajı, değişen nöronal durumları ve stimülasyon parametrelerini yüksek verimli bir şekilde incelemek için birden çok kez yeniden kullanılabilmesidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig01.jpg"> Şekil 1: Bir kuyucuktaki nöronların odaklanmış ultrason (FUS) nöromodülasyonu ve bir mikroelektrot dizisi kullanılarak nöronal aktivitelerinin ölçümü için in vitro platforma genel bakış. Her elektrot (kırmızı, yeşil ve mavi çizgiler) tek bir kuyucuk içindeki bir nöron popülasyonundan kayıt yapar. Ham nöronal elektriksel kayıtları, nöronal ateşleme modellerinin tespitine dönüştürmek için bir işleme hattı uygulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig02.jpg"> Şekil 2: Çok kuyulu mikroelektrot dizisi (MEA) ile FUS nöromodülasyonu. (A) Çok kuyulu MEA ile FUS nöromodülasyonu için kurulumun şeması. FUS dönüştürücü tarafından üretilen akustik dalgalar, gazı alınmış su ile doldurulmuş bir FUS konisi boyunca yayılır ve ultrason jeli kullanılarak birleştirilir. Parafilm, kontaminasyonu önlemek için bir lastik bant kullanılarak kuyuya sabitlenir. MEA plakası, nöronlardan MEA sistemine elektriksel kayıtlar gönderir. (B) MEA sisteminde bulunan çok kuyulu plaka üzerindeki FUS dönüştürücüsünün bir fotoğrafı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig03.jpg"> Şekil 3: In vitro platform kurulumu. (A) In vitro platform kurulumunun ön tarafı. Dönüştürücü güç çıkışı (TPO; solda) FUS parametrelerini programlamak için kullanılır. MEA sistemi (sağda), FUS dönüştürücü tarafından nöromodüle edilen kuyu plakasındaki nöronlardan gelen elektriksel aktiviteyi kaydeder. (B) Eşleşen ağdan (1) TPO'ya ve (2) dönüştürücüye bağlantılar ile in vitro platform kurulumunun arkası. (3) MEA sisteminden TPO'ya bağlantı, veri alımını senkronize eder. (4) Veri aktarımı için MEA sisteminden bilgisayara bağlantı. (5) MEA sistemine güç bağlantısı. (6) FUS sistemine güç bağlantısı. (7) Sonikasyon düğmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig04v2.jpg"> Şekil 4: FUS dönüştürücünün karakterizasyonu. (A) AMPLITUDE sistemi15 tarafından ölçülen Tablo 1'de ayrıntıları verilen FUS parametrelerini kullanarak odak noktasının basınç haritası. (B) Şekil 3'te gösterilen deney düzeneğini kullanarak bir kuyunun dibine yerleştirilen bir termokromik tabakanın sonikasyon öncesi ve sonrası. Termokromik tabaka, sıcaklık değişikliklerine yanıt olarak renk değiştirir, bu da nöronların bulunduğu yerde başarılı bir stimülasyonun görsel olarak doğrulanmasını sağlar. 30 W /cm2'lik maksimum uzamsal tepe darbe ortalama yoğunluğu (ISPPA) ve 3 dakikalık sürekli sonikasyon, böyle bir odak noktasının daha iyi görselleştirilmesi için yerel sıcaklığı büyük ölçüde değiştirecek şekilde ayarlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig04largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig05.jpg"> Şekil 5: İşlem hattı. Adım 1: Ham elektrik kayıtları N = 16 kanaldan yakalanır. Gelecekteki adımlar, kanal 16'yı (kırmızı ile özetlenmiştir) kullanarak işlemi gösterir. Adım 2: Her kanal için bir Butterworth bant geçiren filtre (5 Hz ila 3 kHz bant geçirgen) ve ardından bir Gauss filtresi (σ = 3) uygulanır. Bir eşik, sonikasyonun başlangıcında ortalanmış 2 saniyelik bir pencere içinde sinyalin standart sapmasının beş katı olarak ayarlanır. Adım 3: Eşiğin üstündeki veya altındaki sinyaller ani artışlar olarak nitelendirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig06.jpg"> Şekil 6: Raster ve ateşleme hızı grafikleri. (A) Sonikasyon süresinin bir fonksiyonu olarak her kanalda tespit edilen sivri uçların raster grafiği. FUS stimülasyonunun zamanı kırmızı bir çizgi kullanılarak açıklanır. (B) Karşılaştırma için sürekli FUS ile farklı FUS ayarları altında nöronların raster grafiği. (C) Ateşleme hızı, 50 ms'lik bir sürgülü pencere kullanılarak hesaplanmıştır. FUS nöromodülasyonları öncesi ve sonrası ortalama ateşleme hızları sırasıyla 140 Hz ve 786 Hz idi. Darbeli FUS ile ortalama ateşleme hızları 230 Hz ve 540 Hz idi. Bu değişken FUS stimülasyonu seti tarafından daha kısa bir aktivasyon ve daha az hız değişikliğinin indüklendiği gözlendi. Ateşleme hızını hesaplama işlemi Ek Şekil 1'de detaylandırılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parametre</td>
			<td>Değer</td>
		</tr><tr><td>Maksimum güç/kanal</td>
			<td>1.200 W</td>
		</tr><tr><td>Pgerçek</td>
			<td>0.749 W/kanal.</td>
		</tr><tr><td>BenSPPA</td>
			<td>10,79 G/cm2</td>
		</tr><tr><td>BenSPTA</td>
			<td>0,05 W/cm2</td>
		</tr><tr><td>Seri Çekim Uzunluğu</td>
			<td>0,100 ms</td>
		</tr><tr><td>Frekans</td>
			<td>250,00 kHz</td>
		</tr><tr><td>Odak</td>
			<td>39.800 Avro</td>
		</tr><tr><td>Dönem</td>
			<td>20.000 ms</td>
		</tr><tr><td>Zamanlayıcı</td>
			<td>60.000 Saniye</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Şekil 4'te sunulan çalışma için TPO'da ayarlanan odaklanmış ultrason (FUS) parametreleri.
Ek Şekil 1: Raster grafiğinden ateşleme hızına kadar işleme. Adım 1: Belirli bir kayan penceredeki sayım sayısını elde etmek için tüm kanallar arasındaki sivri uçları sayın. Not: Burada, daha iyi gösterim için daha büyük bir sürgülü pencere (0,1 s'ye ayarlanmış) seçilmiştir. Adım 2: Pencere uzunluğu başına ani artışları saniyedeki ani artışlara dönüştürün (örneğin, burada, hertz [Hz]'ye dönüştürmek için sayıları 10 ile çarpın ve ardından kilohertz [kHz] cinsinden değeri elde etmek için 1.000'e bölün). Adım 3: Sonuç olarak elde edilen ateşleme hızı eğrisi. Örneklenmiş verilerle birlikte açık kaynaklı bir araç seti GitHub'da (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod) mevcuttur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig1.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: K-dalgası simülasyon sonucu LIFU16'nın sıcaklık profili. Şekil 4'te gösterilen akustik yoğunluk haritasına dayanarak, K-dalgası simülasyon sonucu, Tablo 0.04'de listelenen deneysel FUS parametrelerinin aşırı durumunu kullanarak odak bölgesinin merkez bölgesinde (yarıçap: 2 mm) maksimum 1 °C'lik bir sıcaklık artışı önermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig2.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, odaklanmış ultrasonun insan kaynaklı pluripotent kök hücre (HiPSC) nöronları üzerindeki nöromodülatör etkilerinin izlenmesini ve ölçülmesini sağlayan yüksek verimli bir sistem kullanmak için bir protokol sunuyoruz.

Çok Kuyulu Mikroelektrot Dizilerinde İnsan İn Vitro Nöral Kültürlerinin Odaklanmış Ultrason Nöromodülasyonu

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and ...

Odaklanmış ultrason nöromodülasyonu. Bu heyecan verici alan, devam eden çalışmaların bir konusudur Odaklanmış ultrason alanında, belirli bir uygulama için en uygun stimülasyon parametreleri genellikle bilinmemektedir. Bu çalışma, nöronlar üzerinde ampirik in vitro testler yoluyla bu parametrelerin sistematik olarak belirlenmesini amaçlamaktadır.Bu yöntem, araştırmacının genetik ve farmasötik olarak değiştirilmiş nöronların yanıtlarını analiz etmesini sağlayarak ses nöromodülasyonunun odağının altında yatan nöronal mekanizmayı araştırabilir. Gömülü mikro elektrot dizileri veya MEA'ya sahip 24 oyuklu bir nöron kültürü plakasında tek bir kuyuyu doldurmak için kültür ortamını aspire etmeye başlamak. 300 mililitre gazdan arındırılmış ve deiyonize su hazırladıktan sonra, odaklanmış ultrason veya FUS dönüştürücü konisine dikkatlice doldurun.Özelleştirilmiş bir dişli çubuk kullanarak, 3D baskılı tutucuyu bir çerçeveye sabitleyin. Çerçeveyi, FUS dönüştürücünün kafası uyarılacak kuyunun üzerinde olacak şekilde konumlandırın. Ortamı ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri veya HIPSC'leri içeren 24 oyuklu MEA plakası üzerindeki kuyu üzerinde paraformu sabitlemek için bir lastik bant kullanın.Dönüştürücü güç çıkışında veya TPO kontrol panelinde FUS parametrelerini ayarlayın. Ekranda çeşitli parametrelerin değerleri belirtilir. Daha sonra, kuyu üzerindeki paraformun üzerine birleştirme jeli uygulayın ve FUS dönüştürücüsünü, jel ile minimum hava kabarcığı ile temas etmesini sağlayacak şekilde bağlantı jeline indirin.TPO'daki sağ alt düğmeye basarak FUS sonikasyonunu başlatın ve nöronların temel duruma dönmesine izin vermek için her sonikasyon turu arasında en az beş dakika bekleyin. Bağlantı uygunsa, FUS sistemi tarafından üretilen tetikleme darbesi, FUS stimülasyon dizisini MEA kaydıyla otomatik olarak hizalayacaktır. FUS ile ilişkili ateşleme hızındaki değişikliğe bağlı olarak transfer verileriyle FUS sonikasyon süresini okuyarak sinyali analiz edin.FUS odak noktası, hem termo kromatik levhalar üzerinde hem de su hidrofon taraması yoluyla görselleştirilerek karakterize edildi. Filtreleme, eşikleme ve ateşleme hızının hesaplanması dahil olmak üzere işlem sonrası adımlar, FUS'un neden olduğu nöronal aktivite değişikliklerini ortaya çıkarmak için ortamdan gelen gürültüyü filtreledi. Raster grafikleri, her kanalda tespit edilen ani artışları gösterdi.Ateşleme hızı grafiği, seçilen stimülasyon parametrelerinin nöronal ateşleme hızını arttırdığını gösterdi. FUS öncesi ateşleme hızı 140 hertz iken, FUS sonrası ateşleme hızı sürekli dalga FUS ile 786 hertz idi. FUS sonikasyon modunun değiştirilmesi, nöronların başlangıç durumlarına dönmeden önceki süreyi de değiştirdi.Dönüştürücüyü paraform arayüzüne yerleştirirken kabarcık oluşumunu dikkatlice en aza indirmek çok önemlidir. Diğer bir husus, dönüştürücüye iletilen elektrik gücüdür. Güç, bir etkiyi indükleyecek kadar yüksek olmalı, ancak dönüştürücü veya hücre hasarına neden olmayacak kadar düşük olmalıdır.Bu teknik, Parkinson hastalığını ve diğer nörolojik bozuklukları tedavi etmek için optimal stimülasyon parametresini tanımlayabilir ve geri dönüşü olmayan hasar, uzun iyileşme ve rehabilitasyon süresi dahil olmak üzere invaziv cerrahi ile ilişkili riski ortadan kaldırabilir. Klinik deneyler de dahil olmak üzere gelecekteki çalışmalarda güvenliği sağlamak için mekanizmasını ortaya çıkarmak ve klinik öncesi optimizasyonu kontrol etmek için daha fazla çaba sarf edilmesi gerekmektedir.

focused-ultrasound-neuromodulation-human-vitro-neural-cultures-multi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol kurmak, bakımını, kayıt ve elektriksel uyarıcı ÇÇA üzerindeki kültürleri için gerekli bilgileri sağlar.

Nasıl Kültür, Kayıt ve mikro-elektrot Diziler Sinir Ağları Teşvik (ÇÇA)

Video, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilen nöronların elektrofizyolojik aktivitesini kaydetmek için bir mikroelektrot dizisinin (MEA) nasıl kullanılacağını gösterir. Bir nöron-astrosit ko-kültürü içeren çok kuyulu bir MEA'dan elde edilen elektrofizyolojik aktivite, ağdaki birden fazla nörondan gelen aksiyon potansiyellerini tespit etmek için kaydedilir ve hiPSC'lerin nöronlara başarılı bir şekilde farklılaştığını doğrular.

Mikro-elektrot dizileri kullanılarak nöronal ağların elektrofizyolojik aktivitesinin ölçülmesi

Bu video, 3B kokültür kürelerinde sinaptik fizyolojiyi ölçmek için çoklu elektrot dizisinin (MEA) kullanılması prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, 3B küreler içindeki sinir ağı dinamiklerini ve sinaptik ağ patlama aktivitesini anlamayı sağlar.

3D Kokültür Kürelerinde Sinaptik Fizyolojiyi Ölçmek için Çoklu Elektrot Dizilerinin Kullanılması

Bu video, çok kuyulu bir mikroelektrot dizisinde veya odaklanmış bir ultrason dönüştürücü kullanarak MEA sisteminde kültürlenmiş insan iPSC'den türetilmiş nöronlarda nöral aktivitenin modülasyonunu indükleme yöntemini gösterir.

Bir Mikroelektrot Dizi Sistemi Kullanılarak Ultrason Kaynaklı Nöromodülasyon

Bu çalışmada, 3 boyutlu nöronal kültürlerin düzlemsel Mikro-Elektrot Dizilerine (MEA'lar) bağlandığı yeni bir deneysel model presented. 3D ağlar, nöronların üzerinde büyüdüğü ve birbirine bağlı 3B yapılar oluşturduğu cam mikro boncuklardan oluşan bir iskelede nöronların tohumlanmasıyla inşa edilir.

Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deneysel Model

4 aminopyridine uyarılan epileptiform aktivite kayıt ve elektrik modülasyon elektrot dizileri kullanma kemirgen beyin dilimler halinde gerçekleştirme göstermektedir. Özel kayıt odası doku canlılığı uzun süreli deneysel oturumları boyunca korur. Elektrot eşleme yaşamak ve uyarıcı çiftlerinin seçimi özel bir grafik kullanıcı arabirimi tarafından yapılmaktadır.

Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Bu iletişim kuralı mikrosıvısal aygıtlarla çalışmak için nöronal kültürler iletimde Aksiyon potansiyeli vitro elektrot dizilerin nasıl göstermek amaçlamaktadır. Veri analizi, yani algılama ve karakterizasyonu Aksiyon potansiyelleri, yayma, gerçekleştirilen yeni bir kullanarak gelişmiş, henüz Kullanıcı dostu ve serbestçe kullanılabilir, hesaplama aracı.

Nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma çalışmak için elektrot dizileri ile ara yüz kullanımını Havacilik

Burada, özellikle hipokampal, koku soğanı devreleri ve insan nöronal ağlarında, büyük ölçekli nöronal toplulukların hesaplama dinamiklerini araştırmak için HD-MEA'yı kullanıyoruz. Hesaplama araçlarıyla birlikte uzay-zamansal aktiviteyi yakalamak, nöronal topluluk karmaşıklığı hakkında içgörüler sağlar. Yöntem, beyin fonksiyonlarının anlaşılmasını geliştirir, potansiyel olarak biyobelirteçleri ve nörolojik bozukluklar için tedavileri tanımlar.

CMOS Entegre Yüksek Yoğunluklu Mikroelektrot Dizisi Üzerinde Multimodal Büyük Ölçekli Nöronal Topluluk Dinamiğinin Kaydedilmesi ve Analizi

Protokol, serbest hareket eden farelerde eşzamanlı odaklanmış ultrason nöromodülasyonu ve fiber fotometri kaydının tüm operasyonel iş akışı için dönüştürücü üretimini, parametre raporlamasını, cerrahi prosedürü ve sinyal kaydını içerir.

Serbest hareket eden farede eş zamanlı odaklanmış ultrason nöromodülasyonu ve fiber fotometri kaydı

Bu protokol, in vitro epilepsiyi modellemek için dorsal-ventral kaynaşmış asembloidleri çoklu elektrot dizileri üzerinde stabil bir şekilde plakalamayı amaçlamaktadır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

Burada, sıçanlarda ve farelerde yüksek yoğunluklu mikro-elektrokortikografi (μEcoG) kaydı için cerrahi, implantasyon ve kayıt yöntemleri dahil olmak üzere iki protokol sunuyoruz. μECoG kayıtları, sıçan işitsel korteksinde laminer politrod kaydı veya fare somatosensoriyel korteksindeki nöral aktivitenin optogenetik manipülasyonu ile kombinasyon halinde gerçekleştirilir.

Kemirgenlerde Laminer Politrodlar ve Optogenetiğin Mikro Elektrokortikografi ile Entegre Edilmesi ile Kortikal İşlemenin Çok Ölçekli Araştırılması

Öğrenin, odaklanmış ultrason ile HiPSC kaynaklı nöronlarda nöromodülasyon parametrelerini belirlemeyi. Bu yöntem, Parkinson ve diğer nörolojik bozukluklar için cerrahi riskleri ortadan kaldırarak optimal uyarım koşullarını sistematik olarak analiz eder.

Çok Kuyulu Mikroelektrot Dizilerinde İnsan İn Vitro Nöral Kültürlerinin Odaklanmış Ultrason Nöromodülasyonu

Daha fazla video keşfet