2-Foton Mikroskop kullanarak Fare Thymus in situ Görüntüleme

İki foton görüntüleme, tek bir hücrenin çevresiyle etkileşime girerken gerçekleştirdiği migrasyonu takip etmemize olanak tanıdığı için immünoloji için faydalıdır. Timik bölgedeki migrasyonu takip ederek ve iki foton mikroskobisi kullanarak, pozitif ve negatif seleksiyon mekanizmalarını karakterize edebiliriz.

Merhaba, ben California Üniversitesi Berkeley'deki Dr. Ellen Roby'nin laboratuvarından Ina Lottie. Ben de yine Ellen Roby'nin laboratuvarından Paul Herzmark. Bugün size timus dokusunun in situ görüntülemesini nasıl yaptığımızı göstereceğiz ve ben de timusu görüntülemek için iki fotonlu mikroskobumuzu nasıl kullandığımızı anlatacağım.

Şimdi size iki foton görüntülemeye kadar olan adımları göstereceğim. Bu süreç; kemik iliğinden hematopoetik kök hücrelerin izolasyonu, kemik iliği hücrelerinin yenidoğanlara adaptif transferi, timusun diseksiyonu ve ikiye bölünmesi ile dokunun iki foton lazer tarama mikroskopisi ile görüntüleme için hazırlanması prosedürlerini içermektedir. Hadi başlayalım.

Timusu görüntüleme için hazırlamadan önce, öncelikle yenidoğan bir fareye kemik iliği hücrelerini adaptif olarak transfer etmeliyiz. Bu kemik iliği hücreleri, GFP'yi yaygın olarak eksprese eden transgenik farelerin arka bacaklarından izole edilmiştir. Bu, içinde 50 µL kemik iliği bulunan bir insülin şırıngasıdır.

Enjekte edilen her yavru için bir donörden alınan kemik iliğini kullanarak, üç ila yedi günlük konakçılara iki ila dört enjeksiyon yapıyoruz. Burada beş günlük bir yavrumuz var; enjeksiyon sırasında yavrunun hareket etmesini önlemek ve deriyi gergin tutmak için deriyi geriye doğru çimdikleyin. Akciğerlerin ve göğüs kafesinin altında, ancak bağırsak ve midenin üstünde yer alan bir enjeksiyon bölgesini hedefleyin.

Enjeksiyonu yaparken, cildin genişlemesine izin vermek için tutuşunuzu gevşetin. Son olarak, kemik iliği kaybını sınırlamak için şırıngayı yavaşça çıkarın. Bu farelerin dört ila altı hafta gelişmesine izin verilecek ve ardından görüntüleme için timus çıkarılabilecektir.

Dört ila altı hafta sonra timus çıkarılabilir. Görüntüleme için bir set büyük pens ve makasın yanı sıra bir set küçük pens ve makas kullanacağım. Bu fare, hayvan kullanım protokolümüze uygun olarak sakrifiye edilmiş ve üzerine etanol püskürtülmüştür.

Cildi sıkıştırmak için büyük pens kullanacağım ve orta hatta bir insizyon yapacağım. Şimdi, orta hattı kesmek için ya makas kullanabilirim ya da cildi peritondan ayırabilirim; göğüs boşluğunu açığa çıkarmak için cildi iğneyle sabitleyeceğim. Peritonu keserken tutunmak için sternumu kullanacağım ve diyafram aracılığıyla göğüs boşluğuna girip ardından göğüs kafesinin yanları boyunca keseceğim.

Timusun tam kalbin üzerinde yer aldığını görebilirsiniz. Onları geri yerleştireceğim. İşte timus burada.

Ona dokunmaktan kaçınacağım. Siz daha küçük pensi kullanın, timusun etrafındaki dokuyu tutmaya devam edin. Tamam, şimdi üzerine biraz PBS püskürteceğim ve fazla dokuların bir kısmını temizlemeye başlayacağım.

Tutunmak için timusun etrafındaki dokuyu kullanacağım. Timusu temizlerken, fazla dokuyu dikkatlice keserek uzaklaştıracağım. Ayrıca, temizleme işlemi sırasında ayırmamız gereken, timusta iki lob bulunmaktadır.

Ancak önce, timusun yüzeyinde bulunan tüm bu fazla kan damarlarını temizleyeceğim. Görüntüleme yapacağımız timus mimarisini bozmamak için çok dikkatli davranıyorum. Bu nedenle, yalnızca tam yüzeyde bulunan dokuları çekip alıyorum.

Şimdi iki lobu nazikçe ayırmaya başlayacağım. Bunlar, birbirinden ayıracağımız ve dokuyu nazikçe keserek birbirinden koparacağımız ventral lob ve dorsal loptur. Dokunun kurumasını istemiyoruz, bu yüzden üzerine biraz PBS püskürteceğiz.

Şu an iki lobu birbirinden ayırdım. Karakteristik bir gitar şekline sahip olan dorsal lob burasıdır. Ventral lob ise tam olarak şurasıdır.

Görüntüleme alanının fazla dokudan arınmış olması için bu lobların her birindeki fazla dokuları temizleyeceğim. Ancak, tutunabilmemiz için çok az miktarda doku bırakacağım. Görüntüleme sırasında aslında gerekli olmayan bu fazla dokuların üzerinden görüntüleme yapmış olacağız; bunları temizlemek görüntü kalitemizi artıracaktır.

Artık görüntüleme için lamelle kapatmaya hazır, ikiye bölünmüş loblarımız var. İkiye bölünmüş timusu görüntüleme için hazırlamak amacıyla, veteriner tipi doku yapıştırıcısına ve 18 by 18 lamelle kapatma camlarına ihtiyacınız olacak. Lamelle kapatma camının üzerine bir mikrolitrenin küçük bir kısmında yapıştırıcı sürmek için pipet ucunu kullanmayı tercih ediyorum.

Bu nedenle, görüntüleyeceğimiz timusun uzunluğunda yaklaşık bir damla yapıştırıcı koyacağım. Ardından bunu etrafa yaymayı tercih ediyorum. Eğer timusun genişliğindeyse, yine her iki lobu da aynı lamelle koyacağım.

Şimdi buraya bir tane daha yerleştireceğim. Fazla dokudan lobu alıp lamellenin üzerine bırakacağım ve ardından yapıştırıcının olduğu bölgeye doğru sürükleyeceğim. Diğer lob için de aynısını yapacağım; elimi sabitlemek için önce lamellenin yapıştırıcı olmayan kısmına değdireceğim ve ardından diğer timus lobunu lamellenin üzerine yerleştireceğim.

Her iki timik küreciği de lamelle sabitlediğimize göre, görüntüleme işlemi için örneği Paul'e devredeceğiz. Teşekkürler Ina. Şimdi bu örneği alalım ve görüntüleme için kullanacağımız DME ortamına yerleştirelim.

İşte iki fotonlu mikroskop düzeneğimiz. İki fotonlu mikroskopi, timusun derinliklerine bakabilmenize ve floresan hücrelerin hareketlerini gözlemleyebilmenize olanak tanıdığı için bağışıklık hücrelerinin görüntülenmesinde oldukça etkilidir. Hücrelerin floresans yaymasını sağlamak için darbeli bir kızılötesi lazer kullanır.

Home belt mikroskobumuzda, dört farklı rengi eş zamanlı olarak görüntülememize olanak tanıyan dört farklı kamera ve 20x büyütme gücüne sahip özel bir objektif lens bulunmaktadır. Bu lens, timusu içine daldırdığımız DMEM besiyerine girebilen özel bir lenstir ve hücrelerimizin çok parlak görünmesini sağlayacak olan 0,95 NA değerine sahiptir. Dokuyu sağlıklı tutmak için, DMEM besiyeri içerisinden %95 oksijen ve %5 CO2 kabarcıkları gönderiyoruz.

Buradan, 37 °C'ye kadar ısıtıldığı ve timus loblarının daldırıldığı perfüzyon odasına pompalanır. Bu sistem sayesinde, timustaki hücreleri dört saatlik görüntüleme boyunca sağlıklı tutabiliriz. Böylece, iki fotonlu mikroskop için görüntüleme kurulumunun nasıl yapılacağını göstermiş oldum.

Şimdi, döngü halinde oynatılan bu videodaki bazı sonuçlarımıza bakalım. Burada dört farklı renkte görüntülediğimiz timusu görebilirsiniz. Kırmızı olanlar timustaki kan damarlarıdır ve sarı olanlar, dendritik hücreye özgü bir promotör kontrolü altında sarı floresan protein eksprese eden konakçı dendritik hücreleridir.

Burada gördüğünüz mavi ve yeşil timositler, Ena'nın size daha önce gösterdiği adoptif transfer tekniğini kullanarak bir neonatal kimera oluşturmak için kullandığımız iki farklı donörden alınmıştır. Yeşil hücreler, yeşil floresan protein eksprese eden timositlerdir ve mavi hücreler ise siyan floresan protein eksprese eden donörden gelen timositlerdir. Bu, size daha önce gösterdiğim döngüsel videonun aynısıdır, ancak bu videoları elde etmek için topladığımız veri setlerinin üç boyutluluğunu göstermek istiyorum.

Bir düzleme odaklanıp bir görüntü alıyoruz, ardından biraz daha derine odaklanıp başka bir görüntü ve daha da derine odaklanıp bir görüntü daha alıyoruz. Bu video için yaklaşık 60 mikron derine indik ve hareketli hacmi elde etmek için bu görüntü hacmini yaklaşık her 30 saniyede bir tekrarladık. Bu video yaklaşık 20 dakikalık bir süre boyunca kaydedilmiştir.

Böylece hücreleri zaman içinde üç boyutlu olarak takip edebiliriz. Size timusun iki foton mikroskopisi kullanılarak nasıl görüntülendiğini az önce gösterdik. Bu prosedürün en önemli yönleri şunlardır: birincisi, yenidoğanlara donörlerden alınan kemik iliğinin enjekte edilmesi.

İkincisi, timusun yapısına zarar vermeden diseksiyonunu gerçekleştirmek. Üçüncüsü, iki fotonlu mikroskop ile görüntüleme yapmak amacıyla timusu bir lamel üzerine sıkıca sabitlemek. Timus üzerindeki görüntüleme, timositlerin gelişimi ve çeşitli bir T hücresi repertuarının oluşumu hakkındaki birçok soruyu yanıtlayabilir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.