Name: 2-Foton Mikroskop kullanarak Fare Thymus in situ Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Keşfedin fare timus dokusunda 2-foton mikroskopi ile hücre göçünü görüntüleme yöntemini. Bu teknik, T hücre gelişimi ve seçilim mekanizmalarını in vivo çalışmak için değerli bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz, teknik yardım için Matt Paul ve Jimmy Wu teşekkür ederim.

Evlatlık Transferi Yenidoğanlarda kemik iliği 50-100ul 1:1 nihai bir donör-to-host oranı ile, yaşamın ilk 3-7 gün boyunca 2-4 kez kullanarak bir insülin enjektörü ile enjekte edilir. Sternum ve kaburga kafesinin altında bir enjeksiyon yerinde, ancak bağırsak ve mide üzerinde yöneltin. Ponksiyon diyafram dikkatli periton, yeteri kadar nüfuz iğne takın. Bazı kemik iliği enjeksiyonu sırasında kaybolan için nadir değildir. Cilt, daha sonra iğne yavaşça kaldırarak, genişletmek ve izin gibi enjekte olarak yavru kavrama gevşeme kaybını azaltmak. Thymus, diseksiyonu Orta hat üzerinden bir kesi yapmak ve göğüs kafesi ortaya çıkarmak için cildi kesmek veya yırtılma. Sternum üzerinde tutun ve periton ve diyafram kesti. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs kafesi kenarlarına kadar kesin. Timus, kalp üstünde yatıyor. Şimdiye kadar timus yapısını korumak için, timus teşrih doku çevresindeki tutun. Diseksiyonu sırasında kuruma onu tutmak için PBS ile timus durulayın. Timik kapsül yüzeyinde hafifçe uzak aşırı doku tease ve iki lob iki eşit parçaya böler. Görüntüleme için Doku Hazırlama Hayır bir kare lamel tutkal timus veteriner doku yapıştırıcısı kullanın. Pipetteman yapıştırıcı mikrolitrelik bir kısmını koymak için kullanın. Timus yaklaşık uzunluğu ve genişliği tutkal sürün. Sabit lamel karşı timus ve yerine sürükleyin. İki-Foton Görüntüleme Doku,% 95 oksijen ve% 5 karbon dioksit ile perfüze ve 37 ısındı fenol kırmızısı ° C olmadan DMEM batmış İki foton uyarma DEVRESEL_ÖDEME dedektörleri kullanarak Spectra-Fizik Maitai 900nm için ayarlanmış lazer, ve CFP, GFP, YFP ve Texas Red emisyon ışık ayrıldı, bir 495, 515, 560 dikroik aynalar ve toplanan kullanılarak elde edilmiştir.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Timus İki foton görüntüleme, yaşam, sağlam organları etkileşimleri ve timus içinde seçim olayların altında yatan göçler incelemek için bize sağlar.

2-foton mikroskop kullanarak fare thymus in situ görüntüleme

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

İki foton Mikroskobu (TPM) timus derinliklerine görüntü sağlar ve timosit gelişimi için önemli olan olayları belgelemek. Timositleri bir kalabalığın içinde bireylerin göç takip etmek, biz timositleri yüzde birinden daha az yayg ifade floresan protein transgenik bir donörden elde edilen yenidoğan kimeralar üretir. Bu kısmi hematopoetik kimeralar oluşturmak için, yenidoğan alıcılar yaş 3-7 gün arasında kemik iliği ile enjekte edilir. 4-6 hafta sonra, fare kurban ve timus dikkatle diseke ve görüntülü olacak doku mimarisi korunarak bissected. Timus TPM tarafından ex vivo görüntüleme için hazırlık lamel üzerine yapıştırılır. Görüntüleme sırasında timus,% 95 oksijen ve% 5 karbon dioksit ile perfüze ve 37 ısındı fenol kırmızısı ° C olmadan DMEM tutulur Bu yaklaşımı kullanarak, biz, farklı T hücre repertuarının üretimi için gerekli olan olayları incelemek.

Yenidoğan kimeralar üretimi yanı sıra 2-Foton Mikroskopi diseksiyonu ve ex vivo görüntüleme için timus hazırlanması için adım adım talimatlar sunuyoruz.

2-Foton Mikroskop kullanarak Fare Thymus in situ Görüntüleme

İki foton mikroskobisi (TPM), timusun derinliklerini görüntülememize ve timosit gelişimi için önemli olan olayları belgelememize olanak tanır. ...'yı takip etmek için

İki foton görüntüleme, tek bir hücrenin çevresiyle etkileşime girerken gerçekleştirdiği migrasyonu takip etmemize olanak tanıdığı için immünoloji için faydalıdır. Timik bölgedeki migrasyonu takip ederek ve iki foton mikroskobisi kullanarak, pozitif ve negatif seleksiyon mekanizmalarını karakterize edebiliriz.Merhaba, ben California Üniversitesi Berkeley'deki Dr. Ellen Roby'nin laboratuvarından Ina Lottie. Ben de yine Ellen Roby'nin laboratuvarından Paul Herzmark. Bugün size timus dokusunun in situ görüntülemesini nasıl yaptığımızı göstereceğiz ve ben de timusu görüntülemek için iki fotonlu mikroskobumuzu nasıl kullandığımızı anlatacağım.Şimdi size iki foton görüntülemeye kadar olan adımları göstereceğim. Bu süreç; kemik iliğinden hematopoetik kök hücrelerin izolasyonu, kemik iliği hücrelerinin yenidoğanlara adaptif transferi, timusun diseksiyonu ve ikiye bölünmesi ile dokunun iki foton lazer tarama mikroskopisi ile görüntüleme için hazırlanması prosedürlerini içermektedir. Hadi başlayalım.Timusu görüntüleme için hazırlamadan önce, öncelikle yenidoğan bir fareye kemik iliği hücrelerini adaptif olarak transfer etmeliyiz. Bu kemik iliği hücreleri, GFP'yi yaygın olarak eksprese eden transgenik farelerin arka bacaklarından izole edilmiştir. Bu, içinde 50 µL kemik iliği bulunan bir insülin şırıngasıdır.Enjekte edilen her yavru için bir donörden alınan kemik iliğini kullanarak, üç ila yedi günlük konakçılara iki ila dört enjeksiyon yapıyoruz. Burada beş günlük bir yavrumuz var; enjeksiyon sırasında yavrunun hareket etmesini önlemek ve deriyi gergin tutmak için deriyi geriye doğru çimdikleyin. Akciğerlerin ve göğüs kafesinin altında, ancak bağırsak ve midenin üstünde yer alan bir enjeksiyon bölgesini hedefleyin.Enjeksiyonu yaparken, cildin genişlemesine izin vermek için tutuşunuzu gevşetin. Son olarak, kemik iliği kaybını sınırlamak için şırıngayı yavaşça çıkarın. Bu farelerin dört ila altı hafta gelişmesine izin verilecek ve ardından görüntüleme için timus çıkarılabilecektir.Dört ila altı hafta sonra timus çıkarılabilir. Görüntüleme için bir set büyük pens ve makasın yanı sıra bir set küçük pens ve makas kullanacağım. Bu fare, hayvan kullanım protokolümüze uygun olarak sakrifiye edilmiş ve üzerine etanol püskürtülmüştür.Cildi sıkıştırmak için büyük pens kullanacağım ve orta hatta bir insizyon yapacağım. Şimdi, orta hattı kesmek için ya makas kullanabilirim ya da cildi peritondan ayırabilirim; göğüs boşluğunu açığa çıkarmak için cildi iğneyle sabitleyeceğim. Peritonu keserken tutunmak için sternumu kullanacağım ve diyafram aracılığıyla göğüs boşluğuna girip ardından göğüs kafesinin yanları boyunca keseceğim.Timusun tam kalbin üzerinde yer aldığını görebilirsiniz. Onları geri yerleştireceğim. İşte timus burada.Ona dokunmaktan kaçınacağım. Siz daha küçük pensi kullanın, timusun etrafındaki dokuyu tutmaya devam edin. Tamam, şimdi üzerine biraz PBS püskürteceğim ve fazla dokuların bir kısmını temizlemeye başlayacağım.Tutunmak için timusun etrafındaki dokuyu kullanacağım. Timusu temizlerken, fazla dokuyu dikkatlice keserek uzaklaştıracağım. Ayrıca, temizleme işlemi sırasında ayırmamız gereken, timusta iki lob bulunmaktadır.Ancak önce, timusun yüzeyinde bulunan tüm bu fazla kan damarlarını temizleyeceğim. Görüntüleme yapacağımız timus mimarisini bozmamak için çok dikkatli davranıyorum. Bu nedenle, yalnızca tam yüzeyde bulunan dokuları çekip alıyorum.Şimdi iki lobu nazikçe ayırmaya başlayacağım. Bunlar, birbirinden ayıracağımız ve dokuyu nazikçe keserek birbirinden koparacağımız ventral lob ve dorsal loptur. Dokunun kurumasını istemiyoruz, bu yüzden üzerine biraz PBS püskürteceğiz.Şu an iki lobu birbirinden ayırdım. Karakteristik bir gitar şekline sahip olan dorsal lob burasıdır. Ventral lob ise tam olarak şurasıdır.Görüntüleme alanının fazla dokudan arınmış olması için bu lobların her birindeki fazla dokuları temizleyeceğim. Ancak, tutunabilmemiz için çok az miktarda doku bırakacağım. Görüntüleme sırasında aslında gerekli olmayan bu fazla dokuların üzerinden görüntüleme yapmış olacağız; bunları temizlemek görüntü kalitemizi artıracaktır.Artık görüntüleme için lamelle kapatmaya hazır, ikiye bölünmüş loblarımız var. İkiye bölünmüş timusu görüntüleme için hazırlamak amacıyla, veteriner tipi doku yapıştırıcısına ve 18 by 18 lamelle kapatma camlarına ihtiyacınız olacak. Lamelle kapatma camının üzerine bir mikrolitrenin küçük bir kısmında yapıştırıcı sürmek için pipet ucunu kullanmayı tercih ediyorum.Bu nedenle, görüntüleyeceğimiz timusun uzunluğunda yaklaşık bir damla yapıştırıcı koyacağım. Ardından bunu etrafa yaymayı tercih ediyorum. Eğer timusun genişliğindeyse, yine her iki lobu da aynı lamelle koyacağım.Şimdi buraya bir tane daha yerleştireceğim. Fazla dokudan lobu alıp lamellenin üzerine bırakacağım ve ardından yapıştırıcının olduğu bölgeye doğru sürükleyeceğim. Diğer lob için de aynısını yapacağım; elimi sabitlemek için önce lamellenin yapıştırıcı olmayan kısmına değdireceğim ve ardından diğer timus lobunu lamellenin üzerine yerleştireceğim.Her iki timik küreciği de lamelle sabitlediğimize göre, görüntüleme işlemi için örneği Paul'e devredeceğiz. Teşekkürler Ina. Şimdi bu örneği alalım ve görüntüleme için kullanacağımız DME ortamına yerleştirelim.İşte iki fotonlu mikroskop düzeneğimiz. İki fotonlu mikroskopi, timusun derinliklerine bakabilmenize ve floresan hücrelerin hareketlerini gözlemleyebilmenize olanak tanıdığı için bağışıklık hücrelerinin görüntülenmesinde oldukça etkilidir. Hücrelerin floresans yaymasını sağlamak için darbeli bir kızılötesi lazer kullanır.Home belt mikroskobumuzda, dört farklı rengi eş zamanlı olarak görüntülememize olanak tanıyan dört farklı kamera ve 20x büyütme gücüne sahip özel bir objektif lens bulunmaktadır. Bu lens, timusu içine daldırdığımız DMEM besiyerine girebilen özel bir lenstir ve hücrelerimizin çok parlak görünmesini sağlayacak olan 0,95 NA değerine sahiptir. Dokuyu sağlıklı tutmak için, DMEM besiyeri içerisinden %95 oksijen ve %5 CO2 kabarcıkları gönderiyoruz.Buradan, 37 °C'ye kadar ısıtıldığı ve timus loblarının daldırıldığı perfüzyon odasına pompalanır. Bu sistem sayesinde, timustaki hücreleri dört saatlik görüntüleme boyunca sağlıklı tutabiliriz. Böylece, iki fotonlu mikroskop için görüntüleme kurulumunun nasıl yapılacağını göstermiş oldum.Şimdi, döngü halinde oynatılan bu videodaki bazı sonuçlarımıza bakalım. Burada dört farklı renkte görüntülediğimiz timusu görebilirsiniz. Kırmızı olanlar timustaki kan damarlarıdır ve sarı olanlar, dendritik hücreye özgü bir promotör kontrolü altında sarı floresan protein eksprese eden konakçı dendritik hücreleridir.Burada gördüğünüz mavi ve yeşil timositler, Ena'nın size daha önce gösterdiği adoptif transfer tekniğini kullanarak bir neonatal kimera oluşturmak için kullandığımız iki farklı donörden alınmıştır. Yeşil hücreler, yeşil floresan protein eksprese eden timositlerdir ve mavi hücreler ise siyan floresan protein eksprese eden donörden gelen timositlerdir. Bu, size daha önce gösterdiğim döngüsel videonun aynısıdır, ancak bu videoları elde etmek için topladığımız veri setlerinin üç boyutluluğunu göstermek istiyorum.Bir düzleme odaklanıp bir görüntü alıyoruz, ardından biraz daha derine odaklanıp başka bir görüntü ve daha da derine odaklanıp bir görüntü daha alıyoruz. Bu video için yaklaşık 60 mikron derine indik ve hareketli hacmi elde etmek için bu görüntü hacmini yaklaşık her 30 saniyede bir tekrarladık. Bu video yaklaşık 20 dakikalık bir süre boyunca kaydedilmiştir.Böylece hücreleri zaman içinde üç boyutlu olarak takip edebiliriz. Size timusun iki foton mikroskopisi kullanılarak nasıl görüntülendiğini az önce gösterdik. Bu prosedürün en önemli yönleri şunlardır: birincisi, yenidoğanlara donörlerden alınan kemik iliğinin enjekte edilmesi.İkincisi, timusun yapısına zarar vermeden diseksiyonunu gerçekleştirmek. Üçüncüsü, iki fotonlu mikroskop ile görüntüleme yapmak amacıyla timusu bir lamel üzerine sıkıca sabitlemek. Timus üzerindeki görüntüleme, timositlerin gelişimi ve çeşitli bir T hücresi repertuarının oluşumu hakkındaki birçok soruyu yanıtlayabilir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

in-situ-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İki foton görüntüleme ve bir bağışıklık yanıtı 1 sırasında bazal koşullar altında lenf nodu içinde lenfosit motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkardı. Burada, T hücreleri, lenf düğümleri izolasyon ve görüntüleme motilite CD4 + T hücreleri eksplante lenf nodu evlatlık transferi göstermektedir.

Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme

Biz sürekli fare mikroglia görselleştirme ve dolaşımdaki monositler için bir yöntem...

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Biz roman laboratuar araçları ve timus intravital görüntü elde etmek için protokoller geliştirdik. Bizim tekniği T hücre gelişimi oluşur timus içinde "nişler" belirlenmesinde yardımcı olacaktır.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Lazer fare gözün ön odasında timik implantlar mikroskobu tarama timositleri boyuna intravital gerçek zamanlı izleme göstermek için protokol hedefidir. Kornea saydamlığını ve vaskülarizasyon greft sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kaydetmek için izin verir.

Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

Morfolojik değişiklikler, aktivasyon sonrasında bağışıklık duyarlı fibroblast hücrelerinde ortaya çıkar ve hücresel işe alma değişiklikleri teşvik. Genetik olarak tasarlanan fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)-CRE ile birlikte 2-foton görüntülemenin kullanılması; tdtomato floxed-dur-floxed (TB/TB) fare hattı ve yeşil floresan etiketlenmiş lipopolisakkarid-fitc, biz dermal fibroblastlar ve morfolojik değişiklikler içinde lipopolisakkarid son derece spesifik alımı göstermek olabilir vivo.

İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

Bu protokol, açık cerrahi riskini önlemek ve kör perkütan enjeksiyonların doğruluğunu artırmak için farelerde intratimik enjeksiyon için oluşturulan girişimsel bir radyoloji prosedürünü tanımlamaktadır.

Farelerde İntratimik Enjeksiyon için Minimal İnvaziv, Doğru ve Etkili Bir Teknik

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Bu protokol, floresan polistiren mikrosferler kullanılarak in vivo iki foton mikroskopi görüntüleme için optimize edilmiş kronik kraniyal pencere ve mikrovasküler embolizm fare fare modeli için adım adım yaklaşımın ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Floresan Polistiren Mikrosferleri Kullanarak In Vivo İki Foton Mikroskopi İçin Mikrovasküler Embolizm Fare Modeli

Bu çalışma, farelerin ön pençe derisindeki düşük eşikli mekanoreseptör (LTMR) akson terminallerinin görselleştirilmesi için in vivo iki fotonlu görüntüleme yaklaşımını sunmaktadır. Bireysel aksonların tekrarlanan, yüksek çözünürlüklü görüntülemesi kullanılarak, bu yöntem gelişim sırasında ve yetişkinlerde deri duyusal devresinin yapısı ve işlevini incelemek için yeni bir platform sağlar.

Fare Derisindeki Dokunma Duyusal Akson Morfolojisinin İntravital İki Fotonlu Görüntülemesi

Keşfedin fare timus dokusunda 2-foton mikroskopi ile hücre göçünü görüntüleme yöntemini. Bu teknik, T hücre gelişimi ve seçilim mekanizmalarını in vivo çalışmak için değerli bir protokol sunar.

2-Foton Mikroskop kullanarak Fare Thymus in situ Görüntüleme

Daha fazla video keşfet