Name: Nanopor Teknolojisi Kullanılarak Kuduz Virüsünün Hızlı Karakterizasyonu için Tüm Genom Dizilimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Keşfedin nanopore teknolojisi kullanarak kuduz virüsü genomlarının hızlı karakterizasyonu için maliyet etkin bir yöntemi. Bu yaklaşım yerel bilim insanlarını güçlendirerek bölgesel filogenetik analizlere katkı sağlar ve kuduz kontrol stratejilerini destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Tıbbi Araştırma Konseyi [MR/R025649/1] ve Filipinler Bilim ve Teknoloji Departmanı'ndan (DOST) Newton finansmanı, Birleşik Krallık COVID-19 Araştırma ve İnovasyon Küresel çabası [MR/V035444/1], Glasgow Üniversitesi Kurumsal Stratejik Destek Fonu [204820], Tıbbi Araştırma Konseyi Yeni Araştırmacı Ödülü (KB) [MR/X002047/1] tarafından desteklenmiştir. ve Uluslararası Ortaklık Geliştirme Fonu, bir DOST British Council-Filipinler öğrenciliği (CB), Ulusal Sağlık Araştırmaları Enstitüsü [17/63/82] GemVi bursu (GJ) ve Glasgow Üniversitesi MVLS DTP (KC) [125638-06], EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] ve Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. Bu çalışmayı destekleyen meslektaşlarımıza ve işbirlikçilerimize minnettarız: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana ve Anna Czupryna.

Düşük Gelirli Ülkelerde Kuduzu Kontrol Etmek için Nano Gözenek Tabanlı Genomik Bir Yaklaşım

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Erişilebilir bir RABV, nanopor tabanlı, tüm genom dizileme iş akışı, Brunker ve ark.61 tarafından, ARTIC ağından46 kaynaklar kullanılarak geliştirilmiştir. Burada, eksiksiz örneklemeden diziye ve yorumlamaya adımlarla güncellenmiş bir iş akışı sunuyoruz. İş akışı, tüm genom dizilimi için beyin dokusu örneklerinin hazırlanmasını detaylandırır, okumaları işlemek ve konsensüs dizileri oluşturmak için bir biyoinformatik boru hattı sunar ve soy atamasını otomatikleştirmek ve filogenetik bağlamı belirlemek için kuduza özgü iki aracı vurgular. Güncellenen iş akışı ayrıca, farklı bağlamlarda (düşük kaynak ayarları dahil) uygulamaya yönelik hususlarla birlikte uygun hesaplama ve laboratuvar çalışma alanlarının kurulumu için kapsamlı talimatlar sağlar. İş akışının hem akademik hem de araştırma enstitüsü ortamlarında, genomik sürveyans kapasitesi olmayan veya sınırlı olan dört RABV endemik LMIC'de başarılı bir şekilde uygulandığını gösterdik. İş akışının, çeşitli ayarlarda uygulamaya dayanıklı olduğu ve farklı uzmanlıklara sahip kullanıcılar tarafından anlaşılabilir olduğu kanıtlanmıştır.
RABV dizileme için bu iş akışı, halka açık en kapsamlı protokoldür (örneklemden diziye ve yorumlamaya kadar olan adımları kapsar) ve hem başlatma hem de çalıştırma maliyetlerini azaltmak için özel olarak uyarlanmıştır. Nanopor teknolojisi ile kütüphane hazırlama ve dizileme için gereken zaman ve maliyet, Illumina61 gibi diğer platformlara göre büyük ölçüde azalır ve sürekli teknoloji gelişmeleri, Illumina62 ile karşılaştırılabilir olacak şekilde dizi kalitesini ve doğruluğunu iyileştirmektedir.
Bu protokol, çeşitli düşük kaynak bağlamlarında dayanıklı olacak şekilde tasarlanmıştır. Çekirdek protokolle birlikte sağlanan sorun giderme ve değişiklik kılavuzuna başvurarak, kullanıcıların iş akışını ihtiyaçlarına göre uyarlamaları desteklenir. Kullanıcı dostu biyoinformatik araçların iş akışına eklenmesi, orijinal protokolde büyük bir gelişme teşkil eder ve dizi verilerini yerel bağlamlarda yorumlamak için minimum biyoinformatik deneyimine sahip kullanıcılar tarafından uygulanabilecek hızlı ve standartlaştırılmış yöntemler sağlar. Bunu yerinde yapma kapasitesi, genellikle yoğun ve uzun vadeli bir beceri eğitimi yatırımı gerektiren belirli programlama ve filogenetik becerilere sahip olma ihtiyacı ile sınırlıdır. Bu beceri seti, dizi verilerini kapsamlı bir şekilde yorumlamak için önemli olsa da, temel uzmanlıkları ıslak laboratuvar tabanlı olabilen ve verilerini yorumlamalarına ve sahiplenmelerine olanak tanıyan yerel "sıralama şampiyonlarını" kapasitif hale getirmek için temel ve erişilebilir yorumlama araçları da aynı derecede arzu edilir.
Protokol birkaç ülkede birkaç yıldır uygulandığından, artık kapsamı iyileştirmek ve birikmiş çeşitlilikle başa çıkmak için multipleks astar şemalarının nasıl optimize edileceği konusunda rehberlik sağlayabiliriz. Ayrıca, kullanıcıların maliyet etkinliğini iyileştirmelerine yardımcı olmak veya belirli bir bölgede tedarik kolaylığı sağlamak için çaba sarf edilmiştir, bu da tipik olarak moleküler yaklaşımların sürdürülebilirliği için bir zorluktur63. Örneğin, Afrika'da (Tanzanya, Kenya ve Nijerya), adaptör ligasyon adımında, yerel tedarikçilerden daha kolay temin edilebilen ve diğer ligasyon reaktiflerine daha ucuz bir alternatif olan künt / TA ligaz ana karışımını seçtik.
Deneyimlere göre, numune başına ve çalışma başına maliyeti azaltmanın birkaç yolu vardır. Çalışma başına numune sayısını azaltmak (örneğin, 24'ten 12 örneğe düşürmek), akış hücrelerinin ömrünü birden fazla çalışmada uzatabilirken, çalışma başına numune sayısını artırmak, zamanı ve reaktifleri en üst düzeye çıkarır. Elimizde, her üç dizileme çalışmasından biri için akış hücrelerini yıkayıp yeniden kullanabildik, bu da ek 55 numunenin dizilenmesini sağladı. Akış hücresini kullanımdan hemen sonra yıkamak veya mümkün değilse, her çalıştırmadan sonra atık sıvıyı atık kanalından çıkarmak, ikinci bir çalışma için mevcut gözenek sayısını koruyor gibi görünüyordu. Bir akış hücresinde bulunan ilk gözenek sayısı dikkate alınarak, belirli bir akış hücresinde kaç numunenin çalıştırılacağını planlamak için bir çalışma da optimize edilebilir.
İş akışı, ayrıntılı rehberlik ve işaretli kaynakların eklenmesiyle mümkün olduğunca kapsamlı olmayı amaçlasa da, prosedür hala karmaşıktır ve yeni bir kullanıcı için göz korkutucu olabilir. Kullanıcının, ideal olarak yerel olarak veya alternatif olarak harici işbirlikçiler aracılığıyla yüz yüze eğitim ve destek alması teşvik edilir. Örneğin Filipinler'de, ONT kullanarak SARS-CoV-2 genomik sürveyansı için bölgesel laboratuvarlarda kapasite geliştirme üzerine bir proje, sağlık hizmetleri teşhis uzmanları arasında RABV dizilimine kolayca aktarılabilen temel yetkinlikler geliştirmiştir. SPRI boncuk temizleme gibi önemli adımlarda uygulamalı eğitim olmadan ustalaşmak zor olabilir ve etkisiz temizleme akış hücresine zarar verebilir ve çalışmayı tehlikeye atabilir. Numune kontaminasyonu, amplikonlar laboratuvarda işlenirken her zaman büyük bir endişe kaynağıdır ve ortadan kaldırılması zor olabilir. Özellikle, numuneler arasındaki çapraz kontaminasyonun, çalışma sonrası biyoinformatik sırasında tespit edilmesi son derece zordur. Temiz çalışma yüzeylerinin korunması, PCR öncesi ve sonrası alanların ayrılması ve negatif kontrollerin dahil edilmesi gibi iyi laboratuvar tekniği ve uygulamaları, kalite kontrolünü sağlamak için zorunludur. Nanopor dizileme gelişmelerinin hızlı temposu, rutin RABV genomik sürveyansı için hem bir avantaj hem de dezavantajdır. Nanopor'un doğruluğunda, erişilebilirliğinde ve protokol repertuarında devam eden iyileştirmeler, uygulama kapsamını genişletir ve geliştirir. Bununla birlikte, aynı gelişmeler standart işletim prosedürlerinin ve biyoinformatik boru hatlarının sürdürülmesini zorlaştırmaktadır. Bu protokolde, eski nanopor kütüphane hazırlama kitlerinden güncel nanopor kütüphane hazırlama kitlerine geçişe yardımcı olan bir doküman sunuyoruz (Table of Materials).
LMIC'lerde sıralamanın önündeki yaygın bir engel, yalnızca maliyet değil, aynı zamanda sarf malzemelerini zamanında tedarik etme yeteneği (özellikle tedarik ekipleri ve tedarikçiler için nispeten yeni olan sıralama reaktifleri) ve hesaplama kaynakları da dahil olmak üzere erişilebilirliktir. Bu iş akışının temeli olarak taşınabilir nanopor dizileme teknolojisini kullanmak, bu erişilebilirlik sorunlarının çoğuna yardımcı olur ve protokolümüzün bir dizi ayarda kullanıldığını gösterdik, ülke içinde tam protokol ve analiz gerçekleştirdik. Kuşkusuz, ekipman tedarik etmek ve sarf malzemelerini zamanında sıralamak bir zorluk olmaya devam ediyor ve çoğu durumda Birleşik Krallık'tan reaktifleri taşımak veya göndermek zorunda kaldık. Bununla birlikte, bazı bölgelerde, satın alma süreçlerini kolaylaştıran ve patojen genomiklerinin uygulanmasını normalleştirmeye başlayan SARS-CoV-2 dizilimine (örneğin Filipinler) yapılan yatırımdan yararlanarak, reaktifler için tamamen yerel tedarik yollarına güvenebildik.
İstikrarlı bir internet bağlantısına duyulan ihtiyaç, yalnızca bir kerelik kurulumlarla en aza indirilir; örneğin, GitHub depoları, yazılım indirme ve nanopor diziliminin kendisi, çalıştırmayı başlatmak için yalnızca internet erişimi gerektirir (baştan sona değil) veya şirketin anlaşmasıyla tamamen çevrimdışı olarak gerçekleştirilebilir. Mobil veri varsa, çalışma süresi boyunca bağlantıyı kesmeden önce sıralama çalıştırmasını başlatmak için bir telefon dizüstü bilgisayarın etkin noktası olarak kullanılabilir. Örnekleri rutin olarak işlerken, veri depolama gereksinimleri hızla artabilir ve ideal olarak veriler bir sunucuda depolanır. Aksi takdirde, katı hal sürücüsü (SSD) sabit sürücülerinin kaynağı nispeten ucuzdur.
LMIC'lerde genomik sürveyansın önünde hala engeller olduğunu kabul etsek de, genomik erişilebilirlik ve uzmanlık oluşturmaya yönelik artan yatırımlar (örneğin, Afrika Patojen Genomik Girişimi [Afrika PGI])64 bu durumun iyileşeceğini göstermektedir. Genomik sürveyans, pandemiye hazırlık için kritik öneme sahiptir6 ve kapasite, RABV gibi endemik patojenlerin genomik sürveyansının rutinleştirilmesi yoluyla oluşturulabilir. SARS-CoV-2 salgını sırasında vurgulanan sıralama kapasitelerindeki küresel eşitsizlikler, bu yapısal eşitsizlikleri ele almak için katalizör değişimin itici gücü olmalıdır.
Erişilebilir biyoinformatik araçları da dahil olmak üzere RABV için bu örneklemeden diziye ve yorumlama iş akışı, 2030 yılına kadar köpek aracılı kuduzdan sıfır insan ölümü hedefini hedefleyen kontrol önlemlerine rehberlik etmek ve nihayetinde RABV varyantlarının ortadan kaldırılması için kullanılma potansiyeline sahiptir. İlgili meta verilerle birleştirildiğinde, bu protokolden üretilen genomik veriler, salgın araştırmaları sırasında ve bir ülke veya bölgede dolaşan soyların tanımlanmasında hızlı RABV karakterizasyonunu kolaylaştırır60,61,65. Boru hattımızı çoğunlukla köpek aracılı kuduzdan örnekler kullanarak gösteriyoruz; Bununla birlikte, iş akışı doğrudan yaban hayatı kuduzlarına uygulanabilir. Bu aktarılabilirlik ve düşük maliyet, hastalık yönetimini ve kontrolünü iyileştirmek için sadece kuduz için değil, aynı zamanda diğer patojenler için de rutin dizilemeyi kolayca erişilebilir hale getirmedeki zorlukları en aza indirir46,66,67.

Kuduz virüsü (RABV), Rhabdoviridae familyasından memelilerde ölümcül bir nörolojik hastalığa neden olan bir lyssavirüstür1. Kuduz aşılama ile %100 önlenebilir olmasına rağmen, endemik ülkelerde önemli bir halk sağlığı ve ekonomik sorun olmaya devam etmektedir. Her yıl meydana geldiği tahmin edilen 60.000 insan kuduz ölümünün% 95'inden fazlası, köpeklerin birincil rezervuar olduğu Afrika ve Asya'dadır2. Buna karşılık, köpek aşılaması, Batı Avrupa, Kuzey Amerika ve Latin Amerika'nın çoğunda köpek aracılı kuduzun ortadan kaldırılmasına yol açmıştır. Bu bölgelerde, kuduz rezervuarları artık yarasalar, rakunlar, kokarcalar ve yabani köpekgiller gibi vahşi yaşamla sınırlıdır3. Latin Amerika'da, yaygın vampir yarasa, gece kanla besleme sırasında yarasalardan hem insanlara hem de çiftlik hayvanlarına düzenli yayılma nedeniyle sorunlu bir kuduz kaynağıdır4. Kuduzun yıllık küresel ekonomik etkisinin 8,6 milyar dolar olduğu tahmin edilmektedir ve hayvan kayıpları %6'dır5.
Viral patojenlerden elde edilen dizi verileri, enfeksiyonların zamanlaması ve kaynağına ilişkin meta verilerle birleştirildiğinde sağlam epidemiyolojik içgörüler sağlayabilir6. RABV için, salgınlarınkökenini araştırmak için sıralama kullanılmıştır 7,8, yaban hayatı veya evcil köpeklerlekonakçı ilişkilerini belirlemek 8,9,10,11,12 ve insan vakalarının kaynaklarını izlemek13,14. Filogenetik analiz kullanılarak yapılan salgın araştırmaları, kuduzun Endonezya'nın daha önce kuduzsuz olan Bali eyaletinde, yakındaki endemik bölgelerden Kalimantan veya Sulawesi15'ten tek bir girişle ortaya çıktığını göstermiştir. Bu arada, Filipinler'de, Romblon Eyaleti, Tablas Adası'ndaki bir salgının ana Luzon16 adasından tanıtıldığı kanıtlandı. Viral genomik veriler, kontrol önlemlerini coğrafi olarak hedeflemek için gerekli olan patojen bulaşma dinamiklerini daha iyi anlamak için de kullanılmıştır. Örneğin, RABV'nin genomik karakterizasyonu, 17,18,19 sınıflarının coğrafi kümelenmesini, soyların20,21,22 birlikte dolaşımını, insan aracılı viral hareketi 17,23,24 ve metapopülasyon dinamiklerini 25,26 göstermektedir.
Hastalık izleme, SARS-CoV-2 pandemisine yanıt olarak dizileme kapasitesindeki küresel artışla geliştirilen genomik sürveyansın önemli bir işlevidir. Genomik sürveyans, endişe verici SARS-COV-2 varyantlarının gerçek zamanlı izlenmesinidesteklemiştir 27,28 ve ilgili karşı önlemler6. Nanopor teknolojisi gibi erişilebilir dizileme teknolojisindeki gelişmeler, hem insan 29,30,31,32 hem de hayvan 33,34,35 patojenlerinin hızlı dizilimi için geliştirilmiş ve daha uygun fiyatlı protokollere yol açmıştır. Bununla birlikte, kuduz endemik birçok ülkede, SARS-CoV-2 dizileme kapasitesindeki küresel eşitsizliklerin gösterdiği gibi, patojen genomik sürveyansının operasyonel hale getirilmesinin önünde hala engeller vardır36. Laboratuvar altyapısındaki, tedarik zincirlerindeki ve teknik bilgideki sınırlamalar, genomik sürveyansın kurulmasını ve rutinleştirilmesini zorlaştırmaktadır. Bu yazıda, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda RABV sürveyansı için optimize edilmiş, hızlı ve uygun fiyatlı bir tüm genom dizileme iş akışının nasıl uygulanabileceğini gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>Marka adı<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequencing software (MinKnow)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>https://community.nanoporetech.com/downloads</td><td></td></tr><tr><td>Biyoinformatik araç seti (Guppy)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici (miniPCR&ticaret; mini16 termal döngüleyici)</td><td>Cambio</td><td>MP-QP-1016-01</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör (Precellys Evolution Touch Homojenizatör)</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ02520-300</td><td></td></tr><tr><td>Soğuk Raflar (0,2-0,5 mL) (PCR Şeffaf kapaklı mini soğutucu)</td><td>MARKA&nbsp;</td><td>781260</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Sabit F1000L, 1000 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10030</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Sabit F100L, 100 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10024</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Sabit F10L, 10 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10020</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Sabit F1L, 1 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10025</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Sabit F20L, 20 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10021</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Sabit F250L, 250 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10026</td><td></td></tr><tr><td>Florometre (Kübit&nbsp; 4 Florometre)&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Dizüstü Bilgisayar&nbsp; (~2 GB sürücü alanı, minimum 512 GB depolama alanı, msi yükleyici [GPU])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj (Soğutmalı santrifüj)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific 75004081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı (Temel vorteks karıştırıcı)&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>88882011</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik raf (DynaMag -2 Mıknatıs)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama cihazı (MinION)</td><td>Oxford Nanopore Teknolojileri</td><td>MinION Mk1B</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>RNA Ekstraksiyonu&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyon kiti (Qiagen RNEasy Mini Kiti 250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>RNA stabilize edici reaktifler&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(RNA sonra)&nbsp; </td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>(DNA/RNA Kalkanı)</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-50</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>PCR</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su (Nükleaz İçermeyen Su [değil&nbsp; DEPC ile tedavi edilmiş])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>İlk iplikçik cDNA sentezi için ana karışım (LunaScript RT SuperMix Kit)</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010S</td><td></td></tr><tr><td>DNA amplifikasyon ana karışımı (Q5&reg; Sıcak Başlangıç Yüksek Sadakatli 2X Master Mix [NEB])</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Astar (Şema) (Özel DNA oligoları)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI Boncuk Temizleme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI boncuklar (Aline Biosciences PCR Temiz DX )</td><td>Cambio</td><td>AL-AC1003-50</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Saf Mutlak, %>99,8 (GC) [Riedel-De Haen]</td><td>Merck</td><td>818760</td><td></td></tr><tr><td>Kısa Parça tamponu (SFB genişletme paketi)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-SFB001</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>DNA Miktar Tayini</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA miktar tayin kiti (Qubit&reg; dsDNA HS Test Kiti)</td><td>Thermofisher scientific / Fisher scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>DNA miktar tayin test tüpleri (Kübit ve ticaret; Tahlil Tüpleri)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>End Hazırlık ve barkodlama (Qubit & trade; Tahlil Tüpleri)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>Barkodlama kiti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Kimya 9&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>(Yerel Barkodlama Genişletme 1-12)</td><td></td><td>EXP-NBD104&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(Yerel Barkodlama Genişletme 13-24)&nbsp; </td><td></td><td>EXP-NBD114&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(Yerel Barkodlama Genişletme 96)</td><td></td><td>EXP-NBD196</td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Kimya 14</td><td></td></tr><tr><td>(uyumlu değil)&nbsp; </td><td></td><td>(uyumlu değil)&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>(Yerel Barkodlama Kiti 24 V14)</td><td></td><td>SQK-NBD114.24</td><td></td></tr><tr><td>(Yerel Barkodlama Kiti 96 V14)</td><td></td><td>SQK-NBD114.96</td><td></td></tr><tr><td>Ligasyon mastermix (Künt/TA Ligase Master Mix)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>Adaptör Ligasyonu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptör ligasyon ana karışımı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(NEBNext&nbsp; Hızlı Ligasyon Modülü)</td><td>New England Biolabs</td><td>E6056S&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(NEBNext Ultra II Ligasyon Modülü)&nbsp; </td><td>New England Biolabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>(Künt / TA Ligase Master Karışımı)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>Adaptör karışımı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Kimya 9 EXP-AMII001</td><td></td></tr><tr><td>(Adaptör Karışımı II [AMII])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Kimya 14 EXP-NBA114</td><td></td></tr><tr><td>(Yerel adaptör [NA])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Sıralama&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Flowcell hazırlama kiti</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Kimya 9 EXP-FLP002</td><td></td></tr><tr><td>(Gömme Tampon [FB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Flush Tether [FT])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Kimya 14 EXP-FLP004</td><td></td></tr><tr><td>(Akış Hücresi Yıkama [FCF])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Akış Hücresi Bağlantısı [FCT])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligasyon Sıralama Kiti&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 9 SQK-LSK109</td><td></td></tr><tr><td>Adaptör Karışımı (Adaptör Karışımı [AMX])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligasyon Tamponu (Ligasyon tamponu [LNB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kısa Parça Tamponu (Kısa Parça tamponu [SFB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Tamponu (Sıralama Tamponu [SQB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elüsyon Tamponu (Elüsyon tamponu [EB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Yükleme (Boncuk Yükleme [LB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Tether (Sıralama Bağı [SQT])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Kimya 14 SQK-LSK114</td><td></td></tr><tr><td>Adaptör Karışımı (Ligasyon Adaptörü [LA])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligasyon Tamponu (Ligasyon tamponu [LNB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kısa Parça Tamponu (Kısa Parça tamponu [SFB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Tamponu (Sıralama Tamponu [SB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elüsyon Tamponu (Elüsyon tamponu [EB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Yükleme (Boncuk Yükleme [LIB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Tether (Akış Hücresi Bağlantısı [FCT])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kitaplık çözümü (Kitaplık çözümü [LIS])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yıkama tamponu (Akış Hücresi Yıkaması [FCF])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akış Hücresi&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 9 FLO-MIN106D</td><td></td></tr><tr><td>(Flow Cell&nbsp; [R9.4.1])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Kimya 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Kimya 14 FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>(Akış Hücresi&nbsp; [R10.4.1])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell yıkama&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowcell yıkama kiti (Akış hücresi yıkama kiti)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Tüketilebilir[nbsp; < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Yüzey dekontaminantı ve nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(DNA Uzak Yüzey Dekontaminant, Sıkma Şişesi [Moleküler Biyo])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>7010PK</td><td></td></tr><<tr><td>em>(RNase Away Yüzey Dekontaminant, Şişe [Moleküler Biyo])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>7002PK</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8 Tüplü Şerit 0.2ml, bireysel kapak (PCR 8 Tüplü Şerit 0.2ml, Ayrı Takılı Düz Kapaklı, Steril, DNAse/RNAse, Pirojensiz, Doğal [Greiner])</td><td>Greiner</td><td>608281</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tüpü 0.2ml (PCR Tüpü 0.2ml, Doğal [Kubbeli Kapak] 500'lerde Torbalı, Steril Olmayan [Greiner])</td><td>Greiner</td><td>671201</td><td></td></tr><tr><td>1000 ve mikro; L Filtre Uçları (500) (Yığılmış 1000 ve mikro; L Filtre Uçları [500])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific 11977724</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100&mikro; L Filtre Uçları (1000)</td> <td>Thermofisher scientific / Fisher scientific</td><td>11947724</td><td></td></tr><tr><td>10 & mikro; L Filtre Uçları (1000) (Yığılmış 100 ve mikro; L Filtre Uçları [1000])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>11907724</td><td></td></tr><tr><td>Takviyeli tüpler ve nbsp; tüpler (2ml)&nbsp; vidalı kapaklar ve o-ringler ile (Fisherbrand & trade; &nbsp; Dökme tüpler)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>15545809</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü (1.5ml) (1.5 ml Eppendorf Tüpleri [500])</td><td>Eppendorf</td><td>1229888</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tüpleri&nbsp; (1.5ml) (DNA LoBind Tüpleri)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>10051232</td><td></td></tr><tr><td>Cryobabies etiketleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eldivenler (S/M/L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nanopor teknolojisi kullanılarak kuduz virüsünün hızlı karakterizasyonu için tüm genom dizilimi

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

Genomik veriler, bulaşıcı hastalıkların bulaşmasını ve coğrafi yayılımını izlemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, genomik sürveyans için gereken dizileme kapasitesi, köpek aracılı kuduzun ve/veya vampir yarasalar gibi vahşi yaşam yoluyla bulaşan kuduzun önemli halk sağlığı ve ekonomik kaygılar oluşturduğu birçok düşük ve orta gelirli ülkede (LMIC'ler) sınırlı kalmaktadır. Burada, nanopor teknolojisini kullanarak numuneden diziye ve yorumlamaya hızlı ve uygun maliyetli bir iş akışı sunuyoruz. Numune toplama ve kuduz teşhisi için protokoller kısaca açıklanır, ardından multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için primer tasarımı ve optimizasyonu, modifiye edilmiş, düşük maliyetli bir dizileme kütüphanesi hazırlığı, canlı ve çevrimdışı baz çağrısı ile dizileme, genetik soy ataması ve filogenetik analiz dahil olmak üzere optimize edilmiş tüm genom dizileme iş akışının ayrıntıları gelir. İş akışının uygulanması gösterilir ve boru hattı doğrulaması, primer optimizasyonu, negatif kontrollerin dahil edilmesi ve bölgesel ve küresel filogenilerde sınıflandırma ve yerleştirme için halka açık verilerin ve genomik araçların (GLUE, MADDOG) kullanımı gibi yerel dağıtım için kritik adımlar vurgulanır. İş akışının geri dönüş süresi 2-3 gündür ve maliyet, 96 örnek çalıştırma için örnek başına 25 ABD Doları ile 12 örnek çalıştırma için örnek başına 80 ABD Doları arasında değişir. LMIC'lerde kuduz virüsü genomik sürveyansının kurulmasının uygulanabilir olduğu ve 2030 yılına kadar köpek aracılı insan kuduz ölümlerinin küresel hedefine doğru ilerlemeyi destekleyebileceği ve ayrıca yaban hayatı kuduzunun yayılmasının daha iyi izlenmesini destekleyebileceği sonucuna vardık. Ayrıca platform, diğer patojenler için uyarlanabilir ve salgın ve pandemi hazırlığına katkıda bulunan çok yönlü bir genomik kapasite oluşturmaya yardımcı olur.

Bu protokolde açıklanan RABV için numuneden diziye ve yorumlama iş akışı, Tanzanya, Kenya, Nijerya ve Filipinler gibi endemik ülkelerde farklı laboratuvar koşullarında başarıyla kullanılmıştır (Şekil 4). Protokol farklı numune türleri ve koşulları üzerinde kullanıldı (Tablo 6): taze ve donmuş beyin dokusu, uzun süre soğuk zincir altında taşınan beyin dokusundan cDNA ve RNA ekstraktları ve beyin dokusu yaymalarına sahip FTA kartları.
RAMPART (Şekil 5) kullanılarak canlı temel arama, neredeyse gerçek zamanlı okuma oluşturma ve örnek başına kapsama yüzdesini gösterir. Bu, özellikle çalıştırmanın ne zaman durdurulacağına ve akış hücresinin yeniden kullanım için ne zaman kaydedileceğine karar vermede kullanışlıdır. Çalışma süresinde değişiklik gözlemlendi, bazıları 2 saatte tamamlandı, diğerleri ise yeterli kapsama derinliğine (x100) ulaşılması 12 saatten fazla sürebilir. Amplifikasyonun zayıf olduğu bölgeleri de görebiliriz; örneğin, Şekil 6 , kapsama profillerinin çok düşük amplifikasyona sahip bazı amplikonları gösterdiği ve potansiyel olarak sorunlu primerleri gösteren bir dizileme çalışmasının anlık görüntüsünü göstermektedir. Bu zayıf amplifiye edici bölgeleri daha kapsamlı bir şekilde araştırarak, tek tek primerleri yeniden tasarlamamızı ve geliştirmemizi sağlayacak primer uyumsuzluklarını belirleyebildik. Bazı primer şemaları diğerlerinden daha fazla uyumsuzluk göstermiştir. Bu, Doğu Afrika programı çok daha geniş bir çeşitliliği yakalamayı amaçladığından, hedeflenen çeşitliliğe uygun olarak Filipinler'e kıyasla Doğu Afrika primer şemasında gözlemlenmektedir.
Elde edilen RABV dizilerini derlemek ve yorumlamak için RABV genom veri yönetimi için genel amaçlı bir kaynak olan RABV-GLUE42 ve bir soy sınıflandırma ve isimlendirme sistemi olan MADDOG60 kullanıldı. Tablo 7 , RABV-GLUE kullanılarak atanan her ülkede dolaşan majör ve minör dalları göstermektedir. Ayrıca, MADDOG atamasını takiben yerel soyların daha yüksek çözünürlüklü bir sınıflandırması da gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig01.jpg"> Şekil 1: RABV için örnekten diziye ve yorumlamaya iş akışı. (A) numune hazırlama, (B) PCR ve kütüphane hazırlama ve (C) analiz ve yorumlamaya kadar dizileme ve biyoinformatik için özet adımlar gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig02.jpg"> Şekil 2: Astar şeması. A (kırmızı) ve B (yeşil) olmak üzere iki ayrı havuza atanan ileri ve geri primer çiftleri (yarım oklar) için 'indeks referans genomu' (koyu mor) boyunca tavlama konumları. Primer çiftleri, indeks referans genomu boyunca 'scheme_name_X_DIRECTION' formatında sırayla numaralandırılan 400 bp örtüşen amplikon (mavi) üretir, burada 'X', primer tarafından üretilen amplikona atıfta bulunan bir sayıdır ve 'DIRECTION', sırasıyla ileri veya geri olanı tanımlayan 'SOL' veya 'SAĞ'dır. 'X'in tek veya çift değerleri havuzu belirler (sırasıyla A veya B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig04.jpg"> Şekil 3: Nanopor akış hücresi48. Mavi etiketler, hazırlama çözeltisinin eklendiği hazırlama portunu kaplayan hazırlama portu kapağı, numunenin damla damla eklendiği numune portunu kaplayan SpotON numune portu kapağı, atık portları 1 ve 2 ve akış hücresi kimliği dahil olmak üzere akış hücresinin farklı parçalarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig03.jpg"> Şekil 4: 2021 ve 2022'de optimize edilmiş iş akışı kullanılarak RABV sıralamasının gerçekleştirildiği konumu gösteren harita. Kabarcık boyutu ve rengi, daha küçük ve daha koyu daha az, daha büyük ve daha açık olanın daha fazla olduğu konum başına dizi sayısına karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig05v2.jpg"> Şekil 5: Web tarayıcısında RAMPART görselleştirmesinin ekran görüntüsü. Barkod adları, biyoinformatik düzeneğe göre örnek adlarla değiştirilir. En üstteki üç panel, tüm çalışma için özet grafikleri gösterir: indeks referans genomundaki nükleotid konumu başına her barkod için eşlenen okumaların kapsama derinliği (sol üstte, barkodla renklendirilmiş), zaman içinde tüm barkodlardan toplanan eşlenmiş okumalar (üst orta) ve barkod başına eşlenmiş okumalar (sağ üst, barkodla renklendirilmiş). Alt paneller, barkod başına çizim satırlarını gösterir. Soldan sağa: indeks referans genomunda nükleotid pozisyonu başına eşlenmiş okumaların kapsama derinliği (solda), haritalanmış okumaların uzunluk dağılımı (ortada) ve zaman içinde 10x, 100x ve 1.000x eşlenmiş okuma kapsamı elde eden indeks referans genomundaki nükleotid konumlarının oranı (sağda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig05largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig06v2.jpg"> Şekil 6: Protokol kullanılarak dizilenen Filipinler'den bir kuduz virüsü örneği için genom boyunca bir örnek okuma kapsamı. Genomdaki her nükleotid pozisyonundaki okuma kapsamı, kütüphaneyi oluşturmak için kullanılan üst üste binen amplikonların (1-41) pozisyonunun yanı sıra gösterilir. Kapsama derinliğindeki sivri uçlar, amplikon örtüşme alanlarına karşılık gelir. Düşük kapsama derinliğine sahip amplikonlar, amplikon örtüşme alanlarına karşılık gelir. Düşük kapsama derinliğine sahip amplikonlar, optimizasyon gerektirebilecek sorunlu bölgeleri gösteren kırmızı renkle vurgulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig06largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: cDNA hazırlığı için ana karışım ve termal döngüleyici koşulları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 2: Multipleks PCR için ana karışım ve termal döngüleyici koşulları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%202.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 3: Son hazırlık reaksiyonu için ana karışım ve termal döngüleyici koşulları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%203.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 4: Barkodlama için ana karışım ve termal döngüleyici koşulları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%204.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 5: Dizileme için adaptör ligasyon ana karışımı ve son kitaplık seyreltmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table-5_revised.zip" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 6: Üretilen kuduz virüsü tüm genom dizilerinin sayısı ve örneklemden diziye yorumlama iş akışı kullanılarak farklı ülkelerde kullanılan örneklerin türü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%206.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 7: İş akışı kullanılarak oluşturulan diziler için RABV-GLUE'dan büyük ve küçük sınıf atamaları ve MADDOG'dan köken atamaları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%207.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Primer şema tasarımı ve optimizasyonu ve amplikon okuma derinliği analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: Hesaplamalı kurulum <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: RABV WGS protokol çalışma sayfası <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%203-%20Worksheet.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, nanopor teknolojisini kullanarak kuduz virüsü (RABV) genomlarını karakterize etmek için hızlı ve uygun maliyetli bir iş akışı sunuyoruz. İş akışı, kuduz kontrol önlemlerine rehberlik etmek için dolaşımdaki RABV soyları ve bunların bölgesel filogeniler içindeki yerleşimleri hakkında bilgi sağlayarak yerel düzeyde genomik bilgili sürveyansı desteklemeyi amaçlamaktadır.

Nanopor Teknolojisi Kullanılarak Kuduz Virüsünün Hızlı Karakterizasyonu için Tüm Genom Dizilimi

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic ...

Araştırmamız, düşük ve orta gelirli ülkelerde patojen sürveyansını geliştirmek için gelişmiş genomik kullanıyor. Bu da yerel araştırmacıları kim, ne, nerede, neden ve ne zaman olmak üzere beş büyük soruyu yanıtlamaları için güçlendirmemize yardımcı oluyor. Ve bu, sahadaki pratik çözümler hakkında bilgi verebilir.Sıralamayı merkezden uzaklaştırmak için nanopor teknolojisini kullanıyoruz. Kullanım kolaylığı, taşınabilirliği ve diğer platformlara göre daha ucuz maliyetleri, onu düşük kaynak ayarları için ideal hale getirir. Ve numune kaynağında hızlı bir şekilde dizileme yeteneği, hayvan-insan çevre arayüzünde gözetim yapabileceğimiz anlamına gelir.Farklı kalitedeki örneklerden tüm genomları elde etmede zorluklarla karşılaşıyoruz. Genellikle, uzak bölgelerden gelen gönderiler kötü depolama koşullarında taşınır. Ayrıca, verilerin yorumlanmasında faydalı olabilecek biyoinformatik araçlar konusunda sınırlı uzmanlığa sahibiz.Yani bu aletler MADDOG ve drug-V GLUE gibi olurdu. Bu, kontrolü başlatmaya yardımcı olmak için verileri evrensel bir şekilde yorumlamada kullanılabilir. Protokolün hızlı diziler veya kuduzun tüm genomik dizilimleri için nasıl optimize edilebileceğini göstermeye çalışıyoruz ve kuduzun gerçekte nasıl dolaştığı, ne dolaştığı ve ne zaman dolaştığı hakkında farklı soruları cevaplamak için düşük gelirli ülkelerde kuduzun dizilimi için nasıl uyarlanabileceğini ve kullanılabileceğini görmeye çalışıyoruz.Ve bu bilgiler kuduz eliminasyon stratejileri için gereklidir. Viral genomik sürveyans artık daha erişilebilir. Bununla birlikte, yerel kontrol çabaları için veri analizi ve yorumlama rehberliği daha sınırlıdır.Protokolümüz, yerel bilim insanlarını ön saflarda gözetim yetenekleriyle güçlendiren uçtan uca bir boru hattı sunar. Viral genomların ve bu verileri yorumlama yöntemlerinin daha fazla kullanılabilirliği, araştırmacıların epidemiyolojik içgörüyü hükümet bakanlıkları veya hastalık kontrol programları için eyleme geçirilebilir bilgilere dönüştürmesine ve karar verme sürecine rehberlik etmesine olanak tanır.

whole-genome-sequencing-for-rapid-characterization-rabies-virus-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Nanopore sıralamasını uzak konumlarda ve kaynak kötü ayarlarında maliyet-etkili sıralamaya izin veren bir yeni teknoloji. Burada, mRNAs 'ın bu şartlar ile uyumlu olan tüm kandan sıralanması için bir protokol sunuyoruz.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Bir Pan-Lyssavirus iç içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu özellikle tüm bilinen lyssaviruses algılamak için geliştirilmiştir. Farklı hayvan türlerinin kuduz beyin örneklerini kullanarak doğrulama Bu yöntemin altın standart floresan antikor testi için bir duyarlılık ve özgüllük eşdeğer olduğunu gösterdi ve rutin kuduz tanısı için kullanılabilir.

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

DsDNA enterkalasyon boya kullanarak bu gerçek zamanlı RT-PCR Lissavirüse enfeksiyonları teşhis etmek için uygundur. Yöntem, kuduz şüpheli ante-mortem veya post-mortem örneklerinden çıkarılan RNA ile başlar, ana karışım hazırlama, RNA ilavesi, gerçek zamanlı makinenin kurulumu ve sonuçların doğru yorumlanması hakkında ayrıntı.

Pan-Lyssavirus gerçek zamanlı RT-PCR Rabies tanı için

Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromattografik tanı testi (RIDT) ile alan koşullarında hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tam bir protokol salıyoruz. Ayrıca moleküler analiz ve viral genotipleme için cihazı kullanarak daha fazla uygulama açıklar.

Field Postmortem Kuduz Hızlı İmmünromatografik Tanı Testi Kaynak Sınırlı Ayarlar için Diğer Moleküler Uygulamalar ile

Daha önce bir nanopore sıralama platformu üzerinde amplicon tabanlı tüm genom Usutu virüsü (USUV) sıralama için bir protokol doğruladı. Burada, daha ayrıntılı olarak kullanılan yöntemleri açıklar ve nanopore R10 akış hücresinin hata oranını belirleriz.

Tüm Genom Nanopore Sıralama doğrulama, Örnek olarak Usutu Virüs kullanarak

Bu video için hibridizasyon protokol arşiv formalin sabit malzeme de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan izole edilebilen DNA sadece 25-100 ng kullanarak tüm insan genom taramaları tüm genom döşeme yol Array CGH, teknik bir gösteri.

Tüm Genom Dizisi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon Teknik gösteri

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm...

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Bölüm 3 floresan boyalar amino alil kaplin hem ev sahibi hem viral örnekleri amplifiye RNA etiketleme süreci anlatılmaktadır. 3 Bölüm...

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

Yetişkin zebrafish iç kulak duyu epitel yetişkin omurgalıların saç hücre yenilenmesini mekanizmaları anlamak için iyi bir model sistem. Bu protokol, hücresel ve hücre içi düzeyde yenileyici olaylar çalışmak için doku örnekleri elde edebilirsiniz epitel ince diseksiyon, göstermektedir.

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Keşfedin nanopore teknolojisi kullanarak kuduz virüsü genomlarının hızlı karakterizasyonu için maliyet etkin bir yöntemi. Bu yaklaşım yerel bilim insanlarını güçlendirerek bölgesel filogenetik analizlere katkı sağlar ve kuduz kontrol stratejilerini destekler.

Nanopor Teknolojisi Kullanılarak Kuduz Virüsünün Hızlı Karakterizasyonu için Tüm Genom Dizilimi

Daha fazla video keşfet