Name: Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Öğrenin insan limbal niş hücrelerinin izolasyon ve tanımlama yöntemlerini, tek hücre dizileme kullanarak. Bu protokol kök hücre yetmezliği tedavisinde ve görme restorasyonunda klinik uygulamalar için önemli araçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmayla ilgili rehberlik için Wei Wang, Lingjuan Xu ve Rong Liu'ya, materyalin bir kısmını sağladıkları için Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You ve Li Guigang'a, el yazmasını yazdığı için Guanyu Su'ya, el yazmasını düzelttiği için Xiao Zhou, Yihong Xiong ve Huatao Xie'ye ve tam rehberliği için Guigang Li'ye teşekkürler. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82070936, 81470606, 81570819), Hubei Eyaleti sağlık ve aile planlaması bilimsel araştırma projesi (No. WJ2017M073), Tongji Hastanesi'nden İlk On Translasyonel Tıbbi Araştırma Projesi (No.2016ZHYX20), Wuhan Şehrindeki Genç Tıp Öncülerinin Eğitim Projesi (No.2015whzqnyxggrc10), Küresel Yetenekler İşe Alım Programı (G2022154028L), 2022'de Hubei Eyaleti Ulusal Sağlık Komisyonu projesi(WJ2021ZH0005) ve 2022'de Hubei Finans Departmanının Konu İnşaat Vakfı(42000022815T000000102)

50 ila 60 yaşları arasındaki donörlerden alınan limbus dokusu, Tongji Hastanesi (Wuhan, Çin) Kızıl Haç Göz Bankası'ndan elde edildi. Protokol, Tongji Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü.
1. İzolasyon
<ol><li>Orta süreli kornea depolama ortamından limbus dokusu elde edin ve ultra temiz bir tezgah üzerinde aseptik koşullar altında çalıştırın.</li>
	<li>Steril bir cerrahi yuvarlak bıçak kullanarak korneanın etrafındaki iris ve endotelyumu kazıyın ve çıkarın.</li>
	<li>Kornea ve skleranın her iki tarafında 1 mm kalacak şekilde cerrahi bir bıçakla limbus dokusunu eşit büyüklükte on iki parçaya kesin.</li>
	<li>Limbus dokularını 3,5 cm'lik bir kültür plakasına aktarın, tüm dokuları sindirim için daldırmak için 1 mL kollajenaz A (DF-12 ortamında 2 mg / mL) ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 37 ° C'lik hücre inkübatörüne koyun, limbal dokuları 18 saat boyunca sindirin. NOT: Takip işlemleri genellikle ikinci gün yapılır.</li>
	<li>%5 bazal membran matrisi (Matrigel) kaplı 6 oyuklu kültür plakası hazırlayın.<ol><li>Kuyu dibinde% 5 bazal membran matrisini (MESCM [Tablo 1] içinde çözülmüş) kaplayın.</li>
		<li>Sterilize edilmiş bir torbada 200 μL ve 1 mL uç, bir adet 15 mL santrifüj tüp ve bir adet 6 oyuklu plaka hazırlayın.</li>
		<li>Sterilize edilmiş torbayı (uçlar ve santrifüj tüp dahil) ve yeni bir 6 oyuklu plakayı -20 °C veya -80 °C ortamında 20 dakika bekletin. Bazal membran matrisini buzdolabında 4 °C'de çözdürün.</li>
		<li>Önceden soğutulmuş uçları, santrifüj boruyu ve 6 oyuklu plakayı -20 °C veya -80 °C ortamından çıkarın ve ardından ultra temiz tezgahta aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin.</li>
		<li>200 μL'lik bir uç kullanarak 50 μL %5 bazal membran matrisini 1 mL MESCM'ye aktarın ve nazikçe ve eşit şekilde karıştırın.</li>
		<li>Önceden soğutulmuş 1 mL ucu kullanarak %5 bazal membran matrisini (MESCM içinde çözülmüş) 6 oyuklu bir kültür plakasının bir kuyucuğuna aktarın.</li>
		<li>6 oyuklu plakayı hafifçe ve yatay olarak çalkalayın, 6 oyuklu kültür plakasını 37 °C hücre inkübatörüne yaklaşık 1 saat koyun ve ardından bir sonraki adımı gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>18 saatlik sindirimden sonra, kollajenaz A-sindirilmiş limbal dokuyu çıkarın, sadece bazı görünür küçük kümeler ve sindirilmemiş skleral dokular kalacaktır. NOT: Yüksek büyütmeli mikroskopi, yoğun bir şekilde paketlenmiş birçok hücreden (LNC'ler dahil) oluşan bir kümeyi ortaya çıkarır.</li>
	<li>Kümeleri stereomikroskop altında sindirilmemiş skleral dokulardan ayırmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanın.</li>
	<li>Kümeleri 3,5 cm'lik kültür plakasına aktarın ve %0,25 TE'ye daldırın ve ardından plakayı 15 dakika boyunca hücre inkübatörüne yerleştirin.</li>
	<li>Hücre sindirimini durdurmak için %10 nakavt serumu ile 1 mL MESCM ekleyin ve 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak kümeleri tek tek hücrelere yeniden süspanse etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre çökelmesini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve ardından hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL MESCM ekleyin.</li>
	<li>1 mL pipet ucu kullanarak alt hücre çökelmesi MESCM'de eşit şekilde süspanse edilene kadar 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücre sayımı için 20 μL hücre süspansiyonu alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 1 mL pipet ucuna sahip %5 bazal membran matris kaplı 6 oyuklu plakaya aktarın ve MESCM hacmini 2,5 mL'ye yükseltin.</li>
	<li>Hücreleri eşit olarak dağıtmak için 6 oyuklu plakayı yatay olarak hafifçe sallayın.</li>
	<li>Hücreleri görüntülendikten ve kaydedildikten sonra kültür inkübatörüne aktarın. Hücreleri günlük olarak gözlemleyin ve fotoğraflayın ve ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.</li>
</ol>2. LNC'nin Tanımlanması
<ol><li>İmmünofloresan boyama<ol><li>37 ° C hücre inkübatörde 5 dakika boyunca 1 mL% 0.25 TE kullanarak LNC'leri plakanın altından sindirin.</li>
		<li>1 mL MESCM (nakavt serumu içeren) ekleyerek sindirimi sonlandırın, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin.</li>
		<li>Süspansiyondaki hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL MESCM ekleyin. 4 slayt (20 μL/slayt) için 80 μL hücre süspansiyonu (slayt başına 4 × 103 hücre) hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre hücreleri mikroskop slaytlarına yerleştirmek için santrifüj sistemi kullanın.</li>
		<li>Yaklaşık 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit kullanarak hücreleri (3. adımda slaytlara yapıştırılmış) sabitleyin ve ardından 15 dakika boyunca PBS'de% 0.2 Triton X-100 ile slaytlardaki hücreleri geçirgen hale getirin.</li>
		<li>Hücreleri primer antikorlarla (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) ile inkübe etmeden önce% 2 sığır serum albümini (BSA) ile 1 saat bloke edin. İnkübasyondan sonra, slaytları PBST (PBS +% 0.1 Tween 20) ile yıkayarak (5 dakika / yıkama, 3x) bağlanmamış primer antikorları çıkarın.</li>
		<li>Karşılık gelen ikincil antikorları (eşek anti-fare IgG ikincil antikoru TRITC [1:1000], eşek anti-tavşan IgG FITC [1:500], eşek anti-fare IgG 488 [1:300], eşek anti-tavşan IgG 594 [1:400]) uygun IgG spesifik olmayan IgG antikorları ile 1 saat inkübe edin. PBST (5 dk / yıkama, 3x) kullanarak bağlanmamış ikincil antikoru çıkarın.</li>
		<li>Çekirdekleri 5 μg / mL DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol) ile boyayın ve slaytları kapatın.</li>
		<li>Floresan mikroskobu kullanarak floresan görüntüleme yapın (Büyütme: 400x; Maruz kalma süresi: 50 ms).</li>
	</ol></li>
	<li>Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)<ol><li>Üreticinin talimatlarına göre toplam RNA'yı çıkarmak için RNA İzolasyon Kitini alın.</li>
		<li>1-2 μg toplam RNA'yı cDNA'ya tersine çevirmek için yüksek kapasiteli bir cDNA Transkripsiyon Kiti kullanın.</li>
		<li>cDNA (100 ng), TaqMan Gen Ekspresyon Test Karışımı (1 μL), evrensel PCR Master Mix (10 μL) ve ddH 2 O (20 μL'ye kadar) içeren 20 μL'lik bir çözeltide ters transkripsiyon (42 °C,2dk; 50 °C, 85 dk) ve qPCR (95 °C, 5 dk; 95 °C, 10 s, 40 döngü) gerçekleştirin.</li>
		<li>Göreceli gen ekspresyonunu incelemek için karşılaştırmalı BT tekniğini (ΔΔCT)4,9 kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. LNC'nin Karakterizasyonu
<ol><li>Hücre sayımı (hemositometre)<ol><li>LNC'leri 37 °C hücre inkübatörde 5 dakika boyunca% 0.25 TE kullanarak plakanın altından sindirin.</li>
		<li>1 mL MESCM (nakavt serumu içeren) ekleyerek sindirimi sonlandırın, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin.</li>
		<li>Hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL MESCM ekleyin, ardından 0.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 μL hücre süspansiyonu alın. Eşit hacimde% 0.4 Tripan mavisi boyama çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Hemositometrenin sayım alanına 10 μL lekeli hücre süspansiyonu yerleştirin ve sayım için bir lamel ile örtün. NOT: Ortadaki beş kare alandaki hücre sayısı "A" olarak tanımlanır; 1 mL'deki hücre sayısı 5A × 104 × 2 olarak hesaplanır.</li>
	</ol></li>
	<li>LNC ve BMMSC belirteçlerinin akım sitometrisi ile incelenmesi15<ol><li>Akış sitometrisi 15 (2-4 × 106 olay/örnek, örneklerin her birinden 2.000 hücre elde edildi, aynı anda kapılı toplam 550.000 hücre) kullanarak LNC'lerde ve BMMSC'lerde SCF, CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonunu tespit edin).</li>
		<li>Hücreleri 20-30 ° C'de 15 dakika boyunca bir bloke edici tamponda (PBS'de% 3 BSA ve% 0.05 Tween-20) önceden etiketlenmiş antikorlar (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] ve CD105 [1:50]) kullanarak toplayın ve boyayın.</li>
		<li>Bir akış sitometresi kullanarak floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) analizi gerçekleştirin. Bu çalışmada FACS Diva yazılımı ve FlowJo yazılımı kullanılmıştır. Her örnek için 10.000 olay kaydedin ve canlı hücreleri geçit ve analiz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

İnsan Limbal Niş Hücrelerini İzole Etmek, Kültürlemek ve Tanımlamak için Bir Protokol

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
<li>Pineda, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPineda%2C+R+%22World+Corneal+Blindness.+Foundations+of+Corneal+Disease%22">World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease</a>. , Springer, Cham. 299-305 (2020).</li>
<li>Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li>
<li>Resnikoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year 2002.</a> Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+bio-engineered+tissue+employing+3D+nanofiber-aerogel+scaffold+to+facilitate+LSCs+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration.</a> Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).</li>
<li>Aghamirsalim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+hydrogels+for+ocular+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">3D printed hydrogels for ocular wound healing.</a> Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).</li>
<li>Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+the+corneal+epithelium+using+limbal+stem+cells+or+alternative+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).</li>
<li>Rohaina, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+limbal+stem+cell+deficient+corneal+surface+with+induced+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+on+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane.</a> Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).</li>
<li>O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosa+tissue+equivalents+for+the+treatment+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency.</a> Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).</li>
<li>Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells.</a> Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).</li>
<li>Zeppieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+corneal+wound+healing+after+laser-induced+corneal+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice.</a> Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).</li>
<li>Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+cues+modulate+the+neurogenic+potential+of+bone+marrow+and+dental+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells.</a> Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+generation+of+multiple+ocular-like+cell+lineages+and+fabrication+of+functional+corneal+epithelial+cell+sheets+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells.</a> Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+are+a+potent+resource+of+adult+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin ilgili herhangi bir finansal açıklaması yoktur.

Kornea şeffaflığı tipik olarak, normal görme keskinliği için çok önemli olan kornea stromasındaki küçük liflerin (25-30 nm çapında) düzenli olarak düzenlenmesi ve dağıtılmasıyla sağlanır16. Dünyada 36 milyonu kör olmak üzere 253 milyon görme engelliinsan var 17. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), kornea körlüğünü insan görme duyusuna yönelik en ciddi tehlikelerden biri olarak kabul etmektedir ve dünya çapındaki tüm körlüklerin %5,1'ini oluşturmaktadır16. Nor...

Limbal kök hücre eksikliği (LSCD)1 olarak da adlandırılan kornea epitelyal kök hücre eksikliği (CESD) ve kornea epitel rejenerasyonu (CES) insidansı, kornea enfeksiyonu ve yaralanması nedeniyle giderek daha acil hale gelmektedir. Uygun şekilde tedavi edilmezse, CESD kornea nakli gerektiren körlüğe yol açabilir. Sonuç olarak, CES rejenerasyonu daha önemli hale geliyor. CES işlevi için gerekli desteği sağlayan limbal niş hücreler (LNC'ler) adı verilen bir grup destekleyici hücre vardır. Limbal stromal kök hücreler ilk olarak Polisetty ve ark.2 tarafından izole edilmiş ve Xie ve ark.3 tarafından limbal epitel, subjacent ve limbusun stromasında lokalize olan LNC'ler olarak tanımlanmıştır. LNC'ler, kornea kenarının anahtar destekleyici kök hücresidir ve kemik iliği kaynaklı MSC'nin (BMMSC'ler) işlevi ile kornea epitel hücrelerine ve kornea stromal hücrelerine vb. dönüşmeye teşvik edilebilir.3,4,5,6,7. Önceki çalışmalar, LNC'lerin kök hücre özelliklerinin, klinikte zaten yaygın olarak kullanılan BMMSC8'den daha ilkel olduğunu göstermiştir. LNC'ler, özellikle CESD tedavisi için MSC'den sonra bir sonraki uygun seçenek haline gelebilir. CES için önemli destekleyici hücreler olan LNC'ler aynı zamanda limbusun "niş" yapısından türetilen kök hücrelerdir. LNC'ler, olgun kornea epitel hücrelerinin (MCEC) CES9'a farklılaşmasında önemli bir rol oynayabilir. Bununla birlikte, LNC'ler ile ilgili çalışmalar hala nispeten yetersizdir ve LNC'lerin terminolojisi, izolasyonu, saflaştırılması, tanımlanması ve özellikleri konusunda bir fikir birliği yoktur. Bazı araştırmacılar LNC'leri limbal biyopsiden türetilmiş stromal kök hücreler10, limbal mezenkimal kök hücreler11, limbal fibroblast kök hücreler12 ve limbal mezenkimal stromal hücreler13 olarak adlandırmışlardır. LNC'lerin büyüme özellikleri ayrıntılı olarak tanımlanmadığından, umut verici bilimsel ve klinik uygulamaları nedeniyle ve gelecekte en önemli klinik araçlardan biri olabileceğinden, LNC'lerin izolasyonu, saflaştırılması, tanımlanması ve özelliklerini özetlemek gerekir.
Daha önceki bir çalışmayagöre 14, LNC'ler esas olarak limbal epitelin subjacent ve limbusun stromasında bulunur. Bu protokol, limbus dokusunun kollajenaz A kullanılarak işlenmesini, LEPC ve LNC'lerden oluşan bir küme elde edilmesini ve %0.25 tripsin-EDTA (TE) ile tek hücrelere sindirilmesini içerir. LNC'ler daha sonra saflaştırılmak üzere modifiye edilmiş bir embriyonik kök hücre ortamında (MESCM) seçici olarak kültürlendi. Bu yazıda bildirilen protokol basittir ve büyük miktarlarda insan LNC'lerinin elde edilmesinde yüksek verimliliğe sahiptir.
LNC izolasyonu, kültürü ve tanımlanmasının ayrıntılı prosedürü, LNC çalışmasıyla ilgilenen bilim adamları için videoya kaydedildi ve gerektiğinde rahatlıkla tekrarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>4 ', 6-Diamidino-2-fenilindol</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>5 & mu; g/mL</td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Sigma</td><td>V900919</td><td>1.25 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>Anti-CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>MERCK</td><td>A1933-CD105</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech</td><td>67075-1-IG</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>ab114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Proteintech</td><td>66766-1-IG</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Hücre İnkübatörü</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90 (HT)</td></tr> <tr><td>Santrifüj sistemi</td><td>StatSpin&nbsp;</td><td>StatSpin CytoFuge</td><td></td> 12-Kollajenaz</tr> <tr><td>A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM700-Kültür</td><td></td></tr> <tr><td>plakası</td><td>virya</td><td>3500356</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>%90</td></tr> <tr><td>Eşek anti-Fare IgG (H+L) İkincil Antikor</td><td>ThermoFisher</td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan IgG (H+L) İkincil Antikor</td><td>ThermoFisher</td><td>31568</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>FACS Diva yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td>Ağaç Yıldız</td><td></td></tr> <tr><td>Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>olympus</td><td>cx31&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>50 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr><tr><td>Yüksek kapasiteli cDNA Transkripsiyon Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Ters faz kontrast mikroskobu</td><td>&nbsp; UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insülin, transferrin, sodyum selenit)</td> <td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 & mu; g/mL insülin, 5 & mu; g/mL transferrin, 5 ng/mL sodyum selenit</td></tr><tr><td>ESC'ler/iPSC'ler için KnockOut SR Serum Değişimi</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>%10</td></tr> <tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>356234-Pan-CK</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>%4.00</td></tr> <tr><td>Paraformaldehit</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>%4</td></tr><tr><td>PDGFR ve beta;</td><td>Abclonal</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR cihazı</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>Birinci Adım</td><td></td></tr> <tr><td>Artı-Rekombinant İnsan FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekominant İnsan Lösemi İnhibitör Faktörü(Lif)</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini RNA İzolasyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Keşfi. V8</td><td></td></tr><tr><td>Steril cerrahi yuvarlak bıçak</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>boyut 10</td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyon Testi Karışım</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4448489</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>%0.20</td></tr> <tr><td>Tripan mavisi</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>%0.40</td></tr> <tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>%0.25</td></tr> <tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>P9416-Ultra</td><td></td></tr> <tr><td>Temiz Tezgah</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr><tr><td>Evrensel PCR Master Mix</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

limbal niş hücrelerin İzolasyonu ve tanımlanması

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Burada limbal niş hücrelerin (LNC'ler) izolasyonu ve tanımlanması için standart bir prosedür sunuyoruz. LNC'lerin izolasyonu için göz bankasından elde edilen limbus dokusu kullanıldı. Doku, aseptik koşullar altında 12 parçaya bölündü ve LNC'ler ve limbal epitelyal progenitör hücreler ile hücre kümeleri elde etmek için kollajenaz A kullanılarak hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de 18 saat sindirildi. Hücre kümeleri, tek hücreler elde etmek için% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak 37 ° C'de 15 dakika boyunca sindirildi ve daha sonra% 5 Matrigel ile kaplanmış plastik bir yüzey üzerinde modifiye embriyonik kök hücre ortamında (MESCM) kültürlendi. Hücreler %70 birleşme üzerine geçirildi ve LNC'ler immünofloresan, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) ve akış sitometrisi kullanılarak tanımlandı. Birincil LNC'ler izole edildi ve 12 defadan fazla geçti. LNC'lerin P4'ten P6'ya proliferasyon aktivitesi en yüksekti. LNC'ler, BMMSC'lerden (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR ve PDGFRβ) daha yüksek kök hücre belirteçleri ifade etti. Ayrıca, sonuçlar, P4 LNC'lerin VIM, CD90, CD105 ve PDGFRβ'yi tekdüze olarak eksprese ettiğini, ancak LNC'lerin tanımlanması için bir belirteç olarak kullanılabilecek Pan-CK'yi eksprese etmediğini gösterdi. Akış sitometrik analizi, LNC'lerin yaklaşık %95, %97, %92 ve %11'inin sırasıyla CD73, CD90, CD105 ve SCF eksprese ettiğini, BMMSC'lerde ise %68, %99, %20 ve %3 olduğunu gösterdi. LNC izolasyonu ve tanımlanması için standart süreç, LNC'lerin yaygın kullanımı için güvenilir bir laboratuvar temeli sağlayabilir.

LNC'nin Büyümesi LNC'ler, yukarıda tarif edildiği gibi, korneoskleral kenar dokusunun kollajenaz A (2 mg/mL) sindirim yöntemine göre başarılı bir şekilde izole edildi (Şekil 1). Daha önce bildirilen bir çalışma3 ile tutarlı olarak, kollajenaz A sindiriminden sonra, mikroskop altında tırtıl benzeri kümeler görüntülendi (Şekil 2). İğsi hücrelerinin oranı, hücre geçişi ile kademeli olarak artmıştır. Mil şeklindeki hücrele...

Burada, insan limbal niş hücrelerini izole etmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Çalışmalarımız, limbal kök hücre eksikliğini tedavi etmek ve hastanın görüşünü geri kazandırmak için limbal nişin yeniden yapılandırılmasına odaklanmaktadır. Limbal niş hücrelerin, limbal kök hücrelerin işlevini destekleyen anahtar hücreler olup olmadığını ve eğer öyleyse nasıl çalıştığını cevaplamaya çalışıyoruz. Son çalışmalar, kemik iliğinden mezenkimal kök hücrelerin subkonjonktival transplantasyonunun, alkali yanıklı gözlerin limbal kök hücre eksikliğini önlediğini bildirmiştir.Şu anda araştırmamızı ilerletmek için kullanılan teknolojilerden biri, limbal niş hücre karakterizasyonu için tek bir hücre düzeyinde anahtar sinyal yolu aktivitelerini analiz edebilen tek hücre dizilimidir. LNC gelecekte önemli bir klinik araç olma potansiyeline sahip olmasına rağmen, büyüme özellikleri çok ayrıntılı olarak araştırılmamıştır. Umut verici bilimsel ve klinik uygulamaları göz önüne alındığında, LNC'nin izolasyonu, saflaştırılması, tanımlanması ve özelliklerini özetlemek gerekir.

isolation-and-identification-of-limbal-niche-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz hücre davranışlarını incelemek için hangi electrospun zarlar içinde mikrocepler imalatı için bir teknik rapor. Özellikle, PLGA (poli (laktid-ko-glikolid)) microfeatures ile donatılmış kornea biyomalzeme cihazların üretimi için microstereolithography ve üretebilmektedir bir kombinasyonunu tarif eder.

Microstereolithography ve ELEKTROÜRETİM kombinasyonu Kornea Yenilenme Nişli ile donatılmış Membranlarını Üretiliyor

Bu makalede, R26R-Confetti fareleri kullanarak çok renkli bir soy izleme deneyi tasarlama ve gerçekleştirme ilkelerini açıklıyoruz. İlgilenilen diğer dokular için modifiye edilebilen kornea epitel hücrelerinin izlenmesi için özel bir protokol sunuyoruz.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

İnsan diyabetik organ kültürü yapılmış kornealarda adenoviral gen tedavisinin bir örneği, bu kornealarda gecikmiş yara iyileşmesinin normalleşmesine ve belirgin şekilde azalmış epitelyal kök hücre belirteç ekspresyonuna yönelik olarak sunulmuştur. Ayrıca, kök hücre ile zenginleştirilmiş limbal epitel kültürlerinde bu sürecin optimizasyonunu da açıklar.

Diyabetik Keratopatide için adenoviral Gen Tedavisi: İnsan Organ-kültürlü kornealar ve Limbal Epitel Hücreleri Yara İyileşmesi Üzerine Etkileri ve Hücre Marker İfade Kök

aşağıdaki makale etkin bir limbal kök hücre yetmezliği (LSCD) sürdürülebilir bir fare modeli oluşturmak için kolay, tekrarlanabilir teknik sağlar. Bu hayvan modeli test ve limbal kök hücre hastalıkları için tedavi etkinliğini karşılaştıran yararlıdır.

Basit mekanik Prosedür Mouse Limbal Kök Hücre Eksikliği oluşturma

Maruz kalan normal oküler yüzey kornea ve konjonktivadan oluşur. Konjunktiva içerisinde epitel hücreleri, goblet hücreleri ve immün hücreler bulunur. Burada, non-invaziv bir izlenim sitolojisi yöntemi, konjonktivadaki bağışıklık hücrelerini analiz etmek için bir impresyon sitolojisi cihazı ve akış sitometrisi kullanılarak tarif edilmiştir.

Conjunktiva&#39;dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı kornea limbal epitel kök hücre xeno - ve besleyici boş hücre kültür koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerden ayırt için basit iki adımlı bir yöntem sağlar. Burada sunulan hücre kültür yöntemleri klinik kalite hücre kornea hücre terapisi kullanmak için uygun maliyet-etkin, büyük ölçekli üretim sağlar.

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

Burada sunulan, mikrobiyolojik tabanlı yöntemler ve MALDI-TOF kütle spektrometresi ile daha sonra tanımlanması ile benzersiz bir göz çubuğu ve kültür tabanlı zenginleştirme adımı kullanılarak aerobik ve öğretim üyesi anaerobik fare konjonktival commensal bakterilerin izolasyonu ve amplifikasyonu için bir protokoldür.

Farelerde Konjonktival Kommenal İzolasyon ve Tanımlama

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, bir fare modelinde doğru ve tekrarlanabilir bir kornea ve limbal alkali hasarını indüklemek için bir yöntemi açıklar. Protokol, oldukça kavisli fare korneası ve limbusunda eşit olarak dağılmış bir yaralanmaya izin verdiği için avantajlıdır.

Bir fare modelinde punch-trephine tekniği kullanılarak kornea ve limbal alkali yaralanma indüksiyonu

Kornea sütürleri ile birlikte kornea epitel küretajı yoluyla şiddetli kornea iltihabının bir sıçan modeli geliştirdik. Çalışma, enflamatuar koşullar altında kornea iltihabı paternlerini, epitel proliferasyonunu ve limbal kök hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirdi.

Kornea Sütürleri ile Kombine Kornea Epitel Küretajına Dayalı Sıçanlarda Şiddetli Kornea İnflamasyonu Modelinin Oluşturulması

Burada, kollajenaz A ve tripsin ile ardışık sindirim yoluyla tüm fare kornealarından yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, yüksek RNA bütünlüğüne sahip geçerli tek hücreler sağlar ve bu da onları tek hücreli RNA dizileme ve akış sitometriy gibi sonraki uygulamalarla uyumlu kılar.

Fare Kornealarından Tek Hücreli Süspansiyonun Hasat İçin Bir Protokol

Öğrenin insan limbal niş hücrelerinin izolasyon ve tanımlama yöntemlerini, tek hücre dizileme kullanarak. Bu protokol kök hücre yetmezliği tedavisinde ve görme restorasyonunda klinik uygulamalar için önemli araçlar sunar.

Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Daha fazla video keşfet