Name: Tümör Mikroçevresinin Mekansal İmmün Hücre Manzarasının Multipleks İmmünohistokimyasal Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Öğrenin, tümör mikroçevresindeki immün hücrelerin mekansal dağılımını multipleks immünohistokimya ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, kanser tedavilerine yönelik stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PhenoImager HT, Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi ve Radboud Mikroskopi Teknoloji Merkezi tarafından sağlanan fonlarla satın alındı. CF, Hollanda Kanser Derneği hibesi (10673) ve ERC Adv hibesi ARTimmune (834618) tarafından finansal olarak desteklenmektedir. JT, bir NWO Vidi hibesi (VI.Vidi.192.084) tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Yazarlar, multipleks IHC verilerini depolamak için iş akışları oluşturmadaki yardımları için Eric van Dinther ve Ankur Ankan'a teşekkür eder ve ROI çizimi için QuPath'te multipleks IHC verilerinin nasıl uygulanacağına ilişkin talimatlar için Bengt Phung'a teşekkür eder.

Tümör Bağışıklık Manzarasının Haritalanması: Derinlemesine Bir Multipleks IHC Analiz Protokolü

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
<li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

TME'nin mekansal analizi, immün hücre bölmesi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve özellikle immüno-onkoloji alanında yeni prognostik ve prediktif biyobelirteçleri keşfetmek için aranan bir tekniktir16. Bu amaçla, 100-1.000 hedefe kadar tahminlerle proteinlerin, mRNA transkriptlerinin veya ikisinin bir kombinasyonunun tespitini içeren birçok farklı teknik geliştirilmektedir. Bununla birlikte, daha yüksek çoğullama, daha az yüksek verimli deneyler, daha yüksek deneysel maliyetler ve teknik zorluklar pahasına gelir ve çoğu zaman TME'nin yalnızca küçük bir kısmı analiz edilebilir. Burada anlattığımız TSA tabanlı yöntemi kullanan multipleks IHC, aynı anda altı farklı belirteç + DAPI'yi tespit eder, gerçekleştirmesi nispeten daha ucuzdur ve tüm doku kesitleri 20 dakikadan kısa sürede tam olarak analiz edilmeye hazır olarak görüntülenir. Bu teknik, boyama prosedürünün otomasyonu ile daha az karmaşık hale geldi. İki ekstra filtrenin eklenmesini içeren multispektral mikroskoptaki iyileştirmeler, spektral karıştırma ve tarama sürelerini büyük ölçüde iyileştirdi. Aynı anda sekiz farklı işaretleyici + DAPI'yi tespit etmek mümkündür. Bununla birlikte, çoğullamayı daha fazla işaretleyici ile genişleterek, spektral karıştırmanın çözülmesi daha zor hale geldikçe ve tüm slaytlar için tarama süreleri önemli ölçüde arttıkça yukarıda belirtilen faydalar ortadan kalkar. Tanı ortamında uygulamayı daha kolay kolaylaştırmak için multipleks IHC'yi farklı kurumlar arasında standartlaştırmak için çabalar sarf edilmektedir. Multipleks IHC'nin bu standardizasyonu için, kullanıcılara altı farklı işaretleyici + DAPI ile daha erişilebilir protokole uymalarını tavsiye ediyoruz. Bununla birlikte, yine de oldukça fazla teknik bilgi birikimi gereklidir ve aşağı akış analizi zor olabilir, bunun için bu protokolde açıklanan metodolojileri geliştirdik.
Standardizasyon, multipleks IHC panel geliştirme ile başlar. Belirli protein hedeflerini tespit eden primer antikorların seçiminin önemi17'den önce vurgulanmıştır. Multipleks IHC panellerimiz çoğunlukla, teşhis departmanımızda IHC için de kullanılan ve doğrulanan primer antikor klonları ile geliştirilmiştir. Bununla birlikte, dendritik hücre multipleks IHC paneli durumunda, çoğu antikor tanı ortamında kullanılmamıştır (van der Hoorn ve diğerleri, gönderimdeki el yazması). Özgüllüğü sağlamak ve parti farklılıklarını en aza indirmek için, poliklonal antikorlar yerine monoklonal antikorları kullanmayı seçtik ve ayrıca transfekte hücre hatları ve birincil hücreler kullanarak çoğu antikoru doğruladık. Yıllar boyunca, Vectra 3 sistemi kullanılarak yapılan çok sayıda çalışmada multipleks IHC panellerin farklı versiyonları kullanılmıştır 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Bu multipleks IHC panellerini PhenoImager HT sistemine en iyi şekilde uygulamak için, birincil antikor ve florofor kombinasyonlarında bazı ayarlamalar yapılması gerekiyordu. Tüm doku bölümlerinin daha iyi spektral karıştırma ve daha hızlı tarama sürelerinden yararlanmak için, en yeni Opal480 ve Opal780 floroforlarının uygulanması ve yedi renkli multipleks IHC panellerinde Opal540 ve Opal650 floroforların kullanılmasından kaçınılması gereklidir. Tarama süreleri, doku bölümünün boyutuna bağlı olarak ~ 3-10 kat daha hızlıdır. Multipleks IHC panel ayarlarının gerçekleştirilmesi oldukça kolaydı, ancak bazı hususların akılda tutulması gerekiyor. Opal480'in floresan spektrumu, otofloresan spektrumu ile çok örtüşür ve bu nedenle eritrositlerin ve diğer otofloresan yapıların spektral olarak karıştırılmasına müdahale eder. Opal480 ile eşleştirilmiş primer antikorun artan konsantrasyonunun kullanılması çoğu durumda bu sorunu çözmüştür. PhenoImager HT üzerinde tescilli Örnek AF filtresinin uygulanması, Opal480 ve otofloresansın karıştırılmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, Opal480 ile birlikte kullanıldığında net bir sinyal veren bir birincil antikor kullanmak en iyisidir, böylece sinyali otofloresandan daha yüksek olur.
Bu multipleks IHC panelleri kurulmuş olsa da, partiden partiye varyasyon dikkate alınması gereken bir şeydir. Tam multipleks IHC deneyine başlamadan önce monopleks IHC kontrolleri yaparak, bazen primer antikorların deneyden deneye daha güçlü veya daha zayıf performans gösterdiğini gözlemledik. Bunun nedenleri pipetleme hataları, yetersiz reaktif saklama koşulları ve raf ömrü olabilir. Bunu, deneyimlerimize dayanarak birincil antikor solüsyonunu ayarlayarak çözdük. Yukarıda belirtilen ayarlamaların hiçbirinin yapılması gerekmese bile, her multipleks IHC toplu deneyinde, monopleks IHC lekeli kontrol slaytlarına dayalı olarak maruz kalma sürelerinin ayarlanması önemlidir.
Araştırmamız başlangıçta farklı karsinom ve melanom tiplerine odaklandığından, multipleks IHC panellerinin minimal ayarlamalarla tümör tipleri arasında değiştirilebilir olması gerekiyordu. Bu nedenle, optimizasyon sürecine her zaman birden fazla (tümör) doku tipini dahil ettik ve immün hücre belirteçleri için primer antikorlar için seyreltmelerin farklı tümör tipleri arasında benzer tutulabileceğini gözlemledik. Bununla birlikte, karsinomlar ve melanom arasındaki tümör dokusu tespiti, farklı tümör belirteçlerine ihtiyaç duyar. Buna göre, tümör markörü her zaman her bir multipleks IHC panelinin sonunda çalışacak şekilde optimize edilmiştir ve şu anda her zaman Opal780 ile birlikte kullanılmaktadır, bu da tesadüfen bir multipleks IHC boyama prosedüründe son floroforda olması gerekir. Sonuç olarak multipleks IHC'nin sonunda tümör markörünü kullanarak, bu multipleks IHC panelleri, glioblastoma (yani GFAP) ve Hodgkin lenfoma (yani CD30) gibi diğer tümör tipleri ile kolayca değiştirilebilir. Anjiyosarkom için, sadece iki optimizasyon deneyi ile tümör belirteci olarak eritroblast transformasyonuna özgü ilişkili gen (ERG) ile bu lenfosit multipleks IHC panelini kullandık25. Optimizasyon, ERG primer antikorunun titrasyonunu ve sonunda ERG ile multipleks IHC panelinin test edilmesini içeriyordu.
Bu multipleks IHC panellerinde yapılan diğer ayarlamalar, belirli bir bağışıklık hücresi belirtecinin başka bir bağışıklık veya fonksiyonel belirteç ile değiştirilmesiyle de yapılabilir. Her değişiklik optimizasyon gerektirir. Optimizasyon protokolü daha önce açıklandığı gibi takip edilebilir17. Önerilen multipleks IHC panellerinde yapılan bazı değişiklikler, oluşturduğumuz ImmuNet algoritmalarına müdahale edecektir. Yeterli veri üretilmeli ve bu değişiklikleri algoritmaya uygulamak için zaman harcanmalıdır (her yeni belirteç ve/veya hücre fenotipi için en az 750 ek açıklama ve önceden eğitilmiş belirteçlerin doğrulanması için 150 ek açıklama). Burada sunulan paneller fonksiyonel belirteçler içermemektedir, ancak PD-1 ve PD-L1 gibi immün kontrol noktası belirteçlerinin çoğullama IHC panellerine uygulanması laboratuvarımızda yapılmaktadır. Bununla birlikte, negatif ve pozitif sinyallerde daha az ikili olan belirteçlerin analizinin daha zor olduğu kanıtlanmıştır ve grubumuzda aktif bir araştırma alanıdır.
Multipleks IHC ile eş zamanlı olarak değerlendirilebilen belirteç sayısı diğer yeni tekniklere göre sınırlıdır. Bu, bir FFPE bloğunun ardışık dilimleri üzerindeki farklı panelleri analiz ederek aşılabilirken, bu dilimleri uzamsal olarak karşılaştırmak zor olacaktır. Yönlendirme ve katlanmış artefaktlar, slayt hazırlığından sonra büyük olasılıkla aynı değildir. Bununla birlikte, multipleks IHC oldukça erişilebilirdir, bu da onu daha fazla kurum ve araştırmacı için çekici bir araç haline getirir ve bu nedenle, bir teşhis ortamında gelecekteki uygulamalar için daha uygundur. Çoklu tümör tipleri ve aşağı akış analiz boru hatları için multipleks IHC immün hücre panellerinin standardizasyonu ile, hastalar ve tümör tipleri arasındaki TME farklılıkları hakkında daha fazla bilgi edinilebilir. Bu, örneğin, TME'nin spesifik tedavilere antitümör yanıtındaki rolü hakkında daha fazla bilgi edinilmesine yol açabilir. Bu, tedaviye yanıt ve beklenen sağkalım gibi faktörleri tahmin etmek için yeni biyobelirteçlere bile yol açabilir. Genel olarak, bu, multipleks IHC'nin kişiselleştirilmiş bir tıp yaklaşımında klinik karar vermeye yardımcı olacak klinik bir araç haline gelmesini sağlayabilir. Kuşkusuz, analiz prosedürünün daha fazla adımı, günlük bir teşhis ortamında kullanım için uygun olması için muhtemelen otomatikleştirilmeli ve standartlaştırılmalıdır, bu nedenle henüz çoğunlukla fütüristik bir bakış açısıdır.
Tek bir numune slaytı üzerinde birden fazla işaretleyicinin analizi, teknik zorluklarına rağmen çok güçlü bir araç olabilir. Standartlaştırılmış deneysel protokoller ve sağlam bir analiz yöntemiyle, burada ImmuNet kullanarak tanımladığımız gibi, çoklu belirteçlerin nicelleştirilmesi onu klasik IHC'den daha bilgilendirici hale getirirken, multipleks IHC, yeni yüksek pleks deneysel yöntemlere kıyasla nispeten yüksek verim sağlar.

Bağışıklık hücreleri, virüsler ve bakteriler gibi patojenlere karşı korunmada çok önemli bir rol oynar, aynı zamanda kanserli hücrelere karşıda önemlidir 1. Bu nedenle, tümör mikroçevresi (TME) içindeki bağışıklık sistemi, prognostik ve prediktif biyobelirteçleri keşfetmek için çok şey vaat etmektedir2. İmmün hücre infiltratları, çeşitli kanser türlerinde prognoz ile ilişkilendirilmiştir, ancak bu henüz klinik bakımda uygulanmamıştır 3,4. Çoğu tümör tipinde, yüksek sayıda sitotoksik T hücresi ve T yardımcı 1 hücresi ve/veya düşük sayıda düzenleyici T hücresi iyi prognozlarla bağlantılıdır. Kolorektal kanserin TNM evrelemesine "İmmünoskor" adı verilen bir hastalığın dahil edilmesi ve TNM-I evrelemesinin 5,6 haline getirilmesi için çabalar devam etmektedir. İmmünoskor, iki farklı tümör bölgesindeki toplam T hücresi (CD3 ile tespit edilir) ve sitotoksik T hücresi (CD8 ile tespit edilir) sayısından türetilir: tümör çekirdeğine karşı tümörlerin invaziv sınırına (IM). İmmünoskor'un ayrıca melanom, akciğer kanseri ve meme kanserigibi diğer kanser türlerinde de prognostik değere sahip olduğu öne sürülmüştür 6,7,8,9. Ayrıca, immün hücre infiltratları, kontrol noktası blokajı immünoterapisine10 verilen yanıtla da ilişkili olabilir. Bununla birlikte, bu prediktif biyobelirteçler, klinik uygulamada rutin olarak uygulanmadan önce prospektif çalışmalarda doğrulanmalıdır. Ayrıca, anlamlı bir tahmin için tek bir biyobelirteçin yetersiz kalacağı da öne sürülmüştür11. Bu nedenle, farklı biyobelirteçleri birleştirerek bir hasta örneğinin tam bir haritasını oluşturmak, "kanser immünogramı" olarak adlandırılan bir durumda daha kapsamlı bir öngörücü biyobelirteç olarak önerilmiştir12.
TME içindeki bağışıklık hücrelerini incelemek için kullanılan yöntemler arasında, en eski ve en iyi bilinen teknik, başta kanser olmak üzere çeşitli hastalıklarda tanı testleri için rutin olarak kullanılan immünohistokimyadır (IHC)13. Bu teknik, uzun bir süre boyunca bir veya sadece birkaç belirteçin14 kullanımı ile sınırlıydı ve bu nedenle, araştırma ortamlarında akış sitometrisi ve gen ekspresyon profili oluşturma (GEP) gibi diğer tekniklerle rekabet etmedi. Bununla birlikte, rutin teşhis ve araştırmalarda tipik olarak kullanılan formalinle sabitlenmiş ve parafine gömülü (FFPE) tümör dokuları, akış sitometrisi ve GEP için (optimal olarak) uygun değildir. Ayrıca, GEP ve akış sitometrisi, hücre fenotipi ve işlevi hakkında çok fazla bilgi sağlasa da, mekansal bilgi eksikliği önemli bir dezavantajdır. Bu nedenle, bir tümörün bağışıklık hücresi ile infiltre edilen ve bağışıklık hücresi tarafından dışlanan bölgelerindeki farklılıklar gibi bir numune içindeki heterojenlik tespit edilemeyebilir15. FFPE dokularının multipleks analizi için, multipleks IHC, görüntüleme kütle sitometrisi ve bir doku kesiti16 içinde aynı anda birden fazla belirteci tespit etmek için kullanılabilen indEXing ile CO-Algılama (CODEX) gibi yeni platformlar geliştirilmiştir. TME'deki bağışıklık hücreleri, immünoterapi için en iyi biyobelirteçleri bulmak için geniş çapta incelenmektedir. Bununla birlikte, multipleks teknikler ve otomatik görüntü analizi kendi başlarına engeller ortaya çıkarmaktadır.
Laboratuvarımız, Opal/Tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) yöntemini kullanarak multipleks IHC boyama konusunda geniş deneyime sahiptir ve bunu bir IHC platformunda otomatikleştirmiştir (Malzeme Tablosuna bakınız)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. Lenfositlerin, miyeloid hücrelerin ve dendritik hücrelerin (DC'ler) farklı alt kümelerinin tespiti için bağışıklık hücresi panellerini optimize ettik. Lenfositler veya karmaşık hücre morfolojileri (yani miyeloid hücreler ve DC'ler) için yoğun bağışıklık hücresi alanları içeren dokuların analiz edilmesi özellikle zordur ve mevcut bağışıklık hücrelerinin sayısını fazla veya küçümseme riski vardır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, ImmuNet analiz yazılımı32 numaralı grubumuz tarafından geliştirildi ve bu makine öğrenimi hattı, bu farklı türdeki bağışıklık hücrelerinin tespit kalitesini büyük ölçüde artırdı. FFPE materyalinin elde edilmesinden, farklı doku bölmelerindeki bağışıklık hücresi yoğunluklarının ve bağışıklık hücresi tipleri arasındaki mesafelerin analizine kadar ayrıntılı bir protokol burada açıklanmaktadır.
Bu protokol, 2022'de dijital patoloji görüntüleyicinin uygulanmasından bu yana Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi'nde multipleks IHC panellerinin nasıl gerçekleştirildiğini özetlemektedir. Tarif edilen multipleks IHC panelleri, tümör belirteci olarak bir pan-sitokeratin antikoru kullanılarak farklı karsinomlar (örneğin, akciğer, prostat, kolorektal, mesane, meme) veya tümör belirteçleri olarak melanosit ile ilişkili antikorların kullanılmasıyla melanom için kullanılabilir. Bu multipleks IHC protokolleri, primer antikor konsantrasyonu, florofor kombinasyonları ve boyama prosedürünün sırası açısından dikkatlice optimize edilmiştir. Biz ve diğerleri, multipleks IHC panel optimizasyonunu daha önce 17,33,34,35 olarak tanımladık. Multipleks IHC panelleri uyarlanabilir, ancak açıklanan analiz boru hatlarının değerlendirilmesi ve potansiyel olarak buna göre ayarlanması veya yeniden eğitilmesi gerekir. Açıklanan yedi renkli multipleks IHC protokolleri, Opal floroforlar Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanır, böylece görüntüleyicide kolay karıştırma ve hızlı tarama "Multispektral Tek Dokunuşla İmmünofloresan" (MOTiF) ile sağlanır. Dokuz renkli boyama ve tarama bu protokolde açıklanmamıştır, çünkü bu, deney düzeneğinin daha da ince ayarını ve sıvı kristal ayarlanabilir filtreyi kullanan görüntüleyicide başka bir tarama modunu gerektirir.

<table><tbody><tr><td>anti-CD14</td><td>Hücre Markası&nbsp;</td><td>114R-16</td><td>bölüm 3, klon EPR3653</td></tr><tr><td>anti-CD163</td><td>Hücre Markası&nbsp;</td><td>163M-15</td><td>bölüm 3, klon MRQ-26</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>bölüm 3, klon EPR5906</td></tr><tr><td>anti-CD1c (BDCA1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA505411</td><td>bölüm 3, klon OTI2F4</td></tr><tr><td>anti-CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>bölüm 3, klon L26</td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>bölüm 3, klon sp7</td></tr><tr><td>anti-CD303/ Enzo</td><td>Lifesciences/Axxora aracılığıyla</td> BDCA2 Dendritics <td>DDX0043</td><td>bölüm 3, klon 124B3.13</td></tr><tr><td>anti-CD56</td><td>Hücre Markası&nbsp;</td><td>156R-94</td><td>bölüm 3, klon MRQ-42</td></tr><tr><td>anti-CD66b</td><td>BD Biosciences</td><td>555723</td><td>bölüm 3, klon G10F5</td></tr><tr><td>anti-CD68</td><td>Dako Agilent</td><td>M087601</td><td>bölüm 3, klon PG-M1</td></tr><tr><td>anti-CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>bölüm 3, klon C8/144B</td></tr><tr><td>anti-Foxp3</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-4777</td><td>bölüm 3, klon 236A/E7</td></tr><tr><td>anti-Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>bölüm 3, klon HMB45</td></tr><tr><td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>bölüm 3, klon CR3/43</td></tr><tr><td>anti-MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>bölüm 3, klon A103</td></tr><tr><td>anti-pan sitokeratin</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>bölüm 3, klon AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>anti-SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>bölüm 3, klon EP268</td></tr><tr><td>anti-Tirozinaz</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>bölüm 3, Biok</td></tr><tr><td>&eacute aracılığıyla</td> T311<td>anti-XCR1</td> Hücre Sinyalleme Teknolojilerini klonlayın;<td>44665S</td><td>bölüm 3, klon D2F8T</td></tr><tr><td>antikor seyreltici</td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU&nbsp; ARD1001EA</td><td>bölüm 3, Opal 7 Renkli Otomasyon IHC Kiti 50 slayttan (isteğe bağlı olarak %10 BSA'lı TBST ile de değiştirilebilir)</td></tr><tr><td>Bond Aspirasyon Probu</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Bond Aspirasyon Probu Temizleme</td><td>Leica Biosciences</td><td>CS9100</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Bond Dewax Çözeltisi</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9222</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Bond Objectglas etiket + baskı tiftiği</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Bond Araştırma Tespit Sistemi 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Bond RX otomatik boyama makinesi&nbsp;</td><td>Leica Biosciences-bölüm</td><td></td> <td>3, otomatik platform</td></tr><tr><td>Bond TM Epitop Alma 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Bond TM Epitop Alma 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Bond TM Yıkama Solüsyonu 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>BOND Evrensel Örtücü</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Bond(TM) Titrasyon Kiti</td><td>Leica Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Lamel 24 x 32 mm #1 (0.13-0.16 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>bölüm 2</td></tr><tr><td>lamel 24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>bölüm 2</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>bölüm 3, monopleks slaytların resmi analiz için değil, hızlı bir şekilde kontrol edilmesi gerektiğinde, daha iyi sonuçlar için DAPI ayrı ayrı boyanır</td></tr><tr><td>Eosine</td><td></td><td></td><td>bölüm 2, ev yapımı</td></tr><tr><td>Etanol %99,5</td> <td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>bölüm 2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>bölüm 3&nbsp;</td></tr><tr><td>hematoksilin-bölüm</td><td></td><td></td> <td>2, ev yapımı</td></tr><tr><td>ImmuNet-immün</td><td></td><td></td> <td>hücre tespiti ve fenotipleme boru hattı</td></tr><tr><td>inForm yazılımı 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences-bölüm</td><td></td> <td>4 ve 6</td></tr><tr><td>OPAL 480 reaktif paketi</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>OPAL 520 reaktif paketi</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1487001KT</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>OPAL 570 reaktif paketi</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1488001KT</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>OPAL 620 reaktif paketi</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>OPAL 690 reaktif paketi</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>OPAL 780 reaktif paketi</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1501001KT</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>Opal 7 Renkli Otomasyon IHC Kiti 50 slayt</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>bölüm 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences-bölüm</td><td></td> <td>5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td>CLS143455</td><td>bölüm 4, slayt görüntüleyici ve görüntüleme yazılımı ile dijital patoloji görüntüleyici (eski adıyla Vectra Polaris)</td></tr><tr><td>Quick-D montaj ortamı</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>bölüm 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>tüm slayt görüntü analizi yazılım platformu</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slayt kutuları</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>bölüm 1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific aracılığıyla VWR</td><td>631-9483</td><td>bölüm 1</td></tr><tr><td>Vectra Polaris yazılımı 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences-bölüm</td><td></td> <td>4</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>Bölüm 2</td></tr></tbody></table>

tümör mikroçevresinin mekansal İmmün hücre manzarasının multipleks İmmünohistokimyasal analizi

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

Tümör mikroçevresinin bağışıklık hücresi manzarası, potansiyel olarak prognostik ve öngörücü biyobelirteçlerin keşfi için bilgi içerir. Multipleks immünohistokimya, mekansal bilgilerini korurken tümör dokularındaki farklı bağışıklık hücresi türlerini görselleştirmek ve tanımlamak için değerli bir araçtır. Burada, doku kesitlerindeki lenfosit, miyeloid ve dendritik hücre popülasyonlarını analiz etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü bölümlerin kesilmesinden, otomatik bir platformda otomatik multipleks boyama prosedürlerine, slaytların multispektral görüntüleme mikroskobunda taranmasına ve şirket içinde geliştirilen bir makine öğrenimi algoritması olan ImmuNet kullanılarak görüntülerin analizine kadar. Bu protokoller, numunenin farklı bölmelerindeki (tümör ve invaziv sınır) bağışıklık hücrelerini analiz etmek ve en yakın komşu analizini uygulamak için tümör belirteçlerini basitçe değiştirerek çeşitli tümör örneklerine uygulanabilir. Bu analiz tümör örnekleriyle sınırlı değildir, aynı zamanda diğer (olmayan) patojenik dokulara da uygulanabilir. Son birkaç yılda ekipman ve iş akışında yapılan iyileştirmeler, üretim sürelerini önemli ölçüde kısalttı ve bu da bu prosedürün teşhis ortamında gelecekteki uygulamasını kolaylaştırdı.

Bu protokol, multipleks immünohistokimya kullanılarak tümör mikroçevresinin immün hücre karakterizasyonunun nasıl yapıldığını ayrıntılı olarak açıklar.

Tümör Mikroçevresinin Mekansal İmmün Hücre Manzarasının Multipleks İmmünohistokimyasal Analizi

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Amacımız, tümör mikroçevreleri içindeki bağışıklık hücrelerinin miktarını, türünü ve yerini belirlemektir. İmmünokimya alanında, son yıllarda teknolojide büyük ilerlemeler olmuştur. Multipleks immünokimya teknolojisindeki ilerleme, daha fazla markörün güvenilir bir şekilde çalışılmasına olanak tanır.Mevcut deneysel zorluklar, multipleks immünokimya yöntemleri kullanılarak üstesinden gelinen tümör örneklerinde spesifik immün hücre tiplerini görselleştirmektir. Bununla birlikte, bu görüntülerin doğru bir şekilde otomatik olarak analiz edilmesi, üzerinde çalıştığımız bir zorluktur. Primer ve metastatik tümörler arasındaki bağışıklık hücresi manzarası arasındaki farklar, bu farklılıkları hangi tümörün içsel özelliklerinin yönlendirdiği ve bu farklılıkların bağışıklık sistemini hedef alan tedaviler için ne anlama geldiği gibi sorular üretir.Keşif çalışmalarımızın yanı sıra, tümörün bağışıklık hücresi manzarasının farklı anti-kanser tedavilerinden nasıl etkilendiği ve bağışıklık hücresi manzarasının tedavinin sonucunu tahmin edip edemeyeceği gibi klinik olarak ilgili sorulara da odaklanacağız.

multiplex-immunohistochemical-analysis-spatial-immune-cell-landscape

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, tümör  dokusunda sızan T hücrelerinin farklı alt popülasyonlarını analiz etmek için yerinde floresan multispektral görüntüleme tekniğini göstermektedir. Bir renal hücreli karsinom doku kriyoseksiyonu, spesifik inhibitör reseptörleri eksprese eden ve immünoterapiye dirençli bir fenotip sergileyen CD8 + T hücrelerini etiketlemek için antikorlarla tedavi edilir. Etiketli bölüm, farklı CD8 + T hücresi alt popülasyonlarını tanımlamak için multispektral bir mikroskop kullanılarak...

İmmünoterapiye Dirençli T Hücresi Alt Popülasyonlarını Analiz Etmek için Çoğullanmış İmmünofloresan Görüntüleme

Tümör microenvironment eğitim klinik yanıt immünoterapi prognostik veya akýllý biyolojik tespit edebilir. Burada sunulan, bir yöntem situ Floresans spektral analiz ve CD8 otomatik olarak çeşitli altgrupları saymak için görüntüleme üzerinde dayanır+ T hücreleri. Bu tekrarlanabilir ve güvenilir teknik büyük kohort analizi için uygundur.

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri

Burada, formalin-sabit parafin gömülü tümör doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerini görselleştirmek, ölçmek ve haritalamak için basit ve erişilebilir bir strateji tanımlıyoruz. Bu metodoloji, mevcut görüntüleme ve dijital analiz tekniklerini görüntüleme testlerinin çoklama yeteneğini ve multiparametre analizini genişletmek amacıyla birleştirir.

Tümör Mikroortamında Bağışıklık Hücre Popülasyonlarının Görselleştirilmesi, Ölçülmesi ve Haritalanması

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Bu makalede, manuel tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) multipleks immünofloresan (mIF) protokolü ile birlikte görüntü analizi ve uzamsal analiz anlatılmaktadır. Bu protokol, laboratuvarda bulunan slayt tarayıcısına bağlı olarak slayt başına iki ila altı antijenin boyanması için formalin sabit parafin gömülü (FFPE) bölümlerle birlikte kullanılabilir.

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

Multipleks siklik immünohistokimya, tekrarlanan antijen-antikor inkübasyonu, görüntü taraması ve görüntü hizalama ve entegrasyonu kullanılarak aynı anda birden fazla belirtecin in situ tespitine izin verir. Burada, akciğer kanseri ve eşleştirilmiş beyin metastazı örneklerinde bu teknoloji ile immün hücre substratlarının tanımlanması için çalışma protokolünü sunuyoruz.

Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

Fizyolojik açıdan önemli tümör microenvironment meme kanserinin fare modellerinde parametrelerinde değerlendirilmesi için düşük-alan (L-band, 1.2 GHz) elektron paramagnetic rezonans çözünür nitroxyl ve trityl sonda kullanarak gösterilmiştir.

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

Öğrenin, tümör mikroçevresindeki immün hücrelerin mekansal dağılımını multipleks immünohistokimya ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, kanser tedavilerine yönelik stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

Tümör Mikroçevresinin Mekansal İmmün Hücre Manzarasının Multipleks İmmünohistokimyasal Analizi

Daha fazla video keşfet