Name: Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Pluripotentliğe Yeniden Programlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Keşfedin, pankreatik duktal adenokarsinom hücrelerini iPS hücrelerine yeniden programlama protokolünü. Bu yöntem, kanser ilerlemesini ve hastalık heterojenliğini incelemek için kararlı hücre hatları oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S ve J.K, Cancer Research UK ve OHSU'ya finansman için teşekkür eder (CRUK-OHSU Proje Ödülü C65925/A26986). ve Tic. A.Ş., MRC kariyer geliştirme ödülü (MR/N024028/1) ile desteklenmektedir. A.A. Kral Abdülaziz Bilim ve Teknoloji Şehri'nden doktora bursu (Burs ref. 1078107040) ile finanse edilmektedir. J.K, MRF Yeni Araştırmacı Hibesi (GCNCR1042A) ve Knight CEDAR hibesi (68182-933-000, 68182-939-000) tarafından finanse edilmektedir. pSIN4-EF1a-O2S ve pSIN4-CMV-K2M yeniden programlama vektörünü sağladığı için Prof Keisuke Kaji'ye teşekkür ederiz. Açık erişim amacıyla, yazar, bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale sürümüne bir Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır.

PDAC ve Pankreas Hücrelerinin İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelere Yeniden Programlanması

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Kanserin ilerlemesini incelemek için iPSC yeniden programlamasının kullanımını kolaylaştırmak için, pankreas kanseri hücrelerini yeniden programlamak için sağlam bir protokol oluşturulmuştur. Kanser hücrelerini pluripotentliğe yeniden programlamanın şimdiye kadar çok zor olduğu kanıtlanmıştır, çünkü sadece birkaç çalışma kanser hücrelerinden iPSC'leri başarıyla üretmiştir 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 <sup class...

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAK) en ölümcül malignitelerden biridir ve hastalığın asemptomatik olması nedeniyle erken tanı zor olmaya devam etmektedir. PDAC hastalarının çoğu, çok sınırlı tedavi seçeneklerinin mevcut olduğu ileri metastatik evrede teşhis edilir 1,2. Bunun başlıca nedeni, kan dolaşımına salınan proteinler olarak kolayca tespit edilebilenler gibi daha önceki aşamalar için güvenilir biyobelirteçlerin olmamasıdır.
PDAC, ilerlemesi sırasında çok erken yayılabilir ve PDAC pankreasta lokalize olduğunda erken kanser tespiti ile daha iyi bir prognoz ilişkilendirilmiştir3. Bununla birlikte, PDAC hastalarının onda birinden daha azına cerrahi rezeksiyona izin veren olumlu bir prognoz teşhisi konmaktadır. Bununla birlikte, rezektabl tümörleri olan birkaç kişi de 12 ay içinde tümör nüksüne eğilimlidir4.
Son elli yılda, cerrahi tekniklerde, hasta bakımında ve tedavi yöntemlerinde dikkate değer gelişmeler kaydedilmiştir 5,6. Bununla birlikte, cerrahi olarak rezeke edilen PDAC hastalarında 5 yıllık sağkalım oranı ancak %17'ye yükselmiştir. Bununla birlikte, bu, neredeyse hiç değişmeden kalan (%0,9) rezeke edilmemiş hastalardan daha iyidir4,7. Kemoterapi diğer tek alternatif PDAC tedavisidir. Yine de, PDAC hastalarının büyük çoğunluğu Gemsitabin 7,8 gibi kemoterapi ilaçlarına karşı güçlü direnç gösterdiğinden bu seçenek çok sınırlıdır. Erlotinib gibi diğer ilaçlar, çoğu Erlotinib direnci9 gösteren spesifik mutasyonlara sahip küçük bir grup PDAC hastası için mevcuttur. Çoğu PDAC hastasında kemoterapi ile ilişkili olumsuz yan etkiler, bu tedavinin bir başka dezavantajıdır10. Son zamanlarda, umut verici stratejiler, immün kontrol noktası inhibitörlerinin (ICI'ler) ve küçük moleküllü kinaz inhibitörlerinin (SMKI'ler) PDAC tedavisinde etkili olabileceğini göstermiştir, ancak bu hedefe yönelik tedavilere kalıcı yanıtlar hastaların azınlığı ile sınırlı kalmaktadır11,12. Genel olarak, PDAC'a özgü erken biyobelirteçlerin keşfi, erken tanı ve tedavi için yeni yollar açabilir.
PDAC, non-invaziv pankreas kanalı epitel proliferasyonlarından kaynaklanan pankreas intraepitelyal neoplazmlarından (PanIN) öncü lezyonlarındangelişir 13,14. PanIN oluşumu KRAS gibi onkogen mutasyonları ile başlatılırken, PDAC'a ilerleme için ek genetik ve epigenetik değişiklikler gereklidir. PanIN'in farklı aşamalardan invaziv PDAC'a ilerlemesinin yaklaşık 10 yıl sürdüğü öngörülmüştür 13,15,16,17. Bu zaman dilimi, erken PDAC tanısından yararlanmak için harika bir fırsat sağlar. Bu nedenle, PDAC ilerlemesini incelemek için tümör ksenogreft hayvan modelleri ve organoid kültürleri oluşturmak için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır 18,19,20,21. Bu modeller, erken PanIN fazlarından geçiş olmasa da, PDAC'nin invaziv aşamalarını incelemek için çok yararlı olmuştur. Bu nedenle, erken tespit biyobelirteçlerinin keşfedilmesini sağlamak için PanIN aşamalarının erken ilerlemesini özetleyebilecek deneysel modeller geliştirmek önemlidir.
Dört transkripsiyon faktörü OCT4, SOX2, KLF4 ve c-MYC (OSKM) kullanılarak somatik hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması, hücresel plastisiteninkapsamını göstermiştir 22. Kanser hücresi plastisitesi iyi belgelenmiştir ve insan kanser hücrelerini iPSC'lere yeniden programlamak, hücreleri orijinal hücresel durumlarına sıfırlamak için başarıyla kullanılmış ve kanserin ilerlemesi sırasında biriken epigenetik hakaretlerin çoğunu ortadan kaldırmıştır 23,24,25,26,27,28,29. Bu nedenle, kanser hücresi kimliğini manipüle etmek için bu yeniden programlama stratejisini kullanma olasılığı, kanser tedavisinde büyük umut vaat etmiştir30,31. Aslında, PDAC'lerden türetilen iPSC'lerin farklılaşmasının, erken PanIN aşamaları32 boyunca PDAC ilerlemesini özetleyebileceğini daha önce göstermiştik. PDAC'ın erken-orta evrelerine özgü genleri ve yolakları tanımlayarak, erken PDAC tanısı için klinik olarak kullanılabilecek aday biyobelirteçler tanımlanmıştır32,33. Bununla birlikte, tek bir iPSC hattı kullanılarak keşfedilen biyobelirteçler, PDAC hastalarının çoğunda sınırlı kapsama alanı göstermiştir32. Diğer PDAC hastalarından iPSC hatları üretmenin zorlukları, daha güvenilir biyobelirteçler keşfetme yeteneğini durdurmuştur. Bu, OSKM iletiminin heterojenliği de dahil olmak üzere birçok teknik faktörden kaynaklanmaktadır, çünkü insan birincil PDAC hücrelerinin yalnızca küçük bir kısmı dört faktörün tümünü içeriyordu ve yeniden programlamaya başarılı bir şekilde yanıt verdi. Burada, OSKM'nin daha verimli ve tutarlı bir çift lentiviral iletimi kullanılarak birincil PDAC hücrelerinin yeniden programlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-insan TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Hipofiz Özü (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Vibrio cholerae Merck'ten Kolera Toksini</td><td>;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen, sıçan kuyruğu Merck'ten Tip I çözelti</td><td>&nbsp;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Tamamlanmış Tanımlı K-SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp; 10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC ile İşlenmiş Çoklu Kuyu Plakaları</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Corning şırınga filtreleri</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431231</tr><tr><td>Corning doku kültürü ile muamele edilmiş kültür yemekleri</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS430599</tr><tr><td>Gün Impex&nbsp; Virkon Dezenfektan Virüsidal Tabletler</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD Transfeksiyon Reaktifi&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>&nbsp; E2312</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin çözeltisi, Tip B, H2O</td><td>Merck&nbsp;</td> içinde %2;<td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Temel Medya (GMEM)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>İnsan EGF Rekombinant Protein</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FGF-bazik (FGF-2/bFGF) (154 aa) Rekombinant Protein, PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Pankreas Kanalı Epitel Hücre Hattı (H6c7)</td><td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>iMEF besleyici hücreler&nbsp;</td><td>iXcells Biyoteknoloji</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>Keratinosit Serum İçermeyen Ortam (KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut serum Değişimi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0.45 & mu; M şırınga filtre ünitesi (steril)</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>Polibren (Heksadimetrin bromür)&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta (ATCC modifikasyonu)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Piruvat</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Steril Şırıngalar (60 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TripLE Ekspres Enzim (1x), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihidroklorür)</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

pankreatik duktal adenokarsinomun pluripotentliğe yeniden programlanması

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Transkripsiyon faktörleri kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) üretimi, hemen hemen tüm farklılaşmış hücre tiplerinden elde edilmiştir ve araştırma ve klinik uygulamalar için oldukça değerli olduğu kanıtlanmıştır. İlginç bir şekilde, pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) gibi kanser hücrelerinin iPSC yeniden programlanmasının invaziv PDAC fenotipini geri döndürdüğü ve kanser epigenomunu geçersiz kıldığı gösterilmiştir. PDAC kaynaklı iPSC'lerin farklılaşması, PDAC ilerlemesini erken pankreatik intraepitelyal neoplazi (PanIN) öncüsünden özetleyebilir ve PDAC ilerlemesi sırasında erken meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, PDAC'den türetilen iPSC'ler, erken tespit tanı belirteçlerinin keşfi için PDAC'nin en erken aşamalarını modellemek için kullanılabilir. Bu, daha erken PanIN evreleri için güvenilir biyobelirteçlerin bulunmaması nedeniyle tipik olarak geç metastatik evrelerde teşhis edilen PDAC hastaları için özellikle önemlidir. Bununla birlikte, PDAC da dahil olmak üzere kanser hücre hatlarının pluripotentliğe yeniden programlanması zorlu, emek yoğun ve farklı hatlar arasında oldukça değişken olmaya devam etmektedir. Burada, bisiztronik lentiviral vektörleri kullanarak çeşitli insan PDAC hücre hatlarından iPSC'ler üretmek için daha tutarlı bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan iPSC çizgileri stabildir ve yeniden programlama faktörlerinin veya indüklenebilir ilaçların eksojen ekspresyonuna bağımlılık göstermez. Genel olarak, bu protokol, daha spesifik ve PDAC vakalarını temsil eden erken biyobelirteçleri keşfetmek için gerekli olan çok çeşitli PDAC'den türetilmiş iPSC'lerin oluşturulmasını kolaylaştırır.

PDAC, BXPc3, H6C7 ve hFib hücrelerinden türetilen iPSC kolonilerinin morfolojisini gösteren temsili görüntüler Şekil 1'de gösterilmektedir. PDAC-iPSC kolonileri, yeniden programlamanın 25. gününde oluşmaya başladı. Daha yerleşik bir ESC benzeri morfolojiye sahip sağlam iPSC kolonileri, yeniden programlamanın 40. gününde tanımlanmıştır (Şekil 1). Benzer şekilde, BxPc3-iPSC'lerin oluşumu 23. günde başladı ve 35. günde daha yerleşik...

Mevcut protokol, Pankreatik Duktal Adenokarsinom (PDAC) ve normal pankreatik duktal epitel hücrelerinin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanmasını açıklamaktadır. Lentivirüsün hazırlanmasından stabil iPSC hatlarının oluşturulmasına kadar optimize edilmiş ve ayrıntılı, adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Pluripotentliğe Yeniden Programlanması

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Pankreas kanseri kök hücreleri (CSC'ler), CSC biyolojisini incelemek için güçlü bir araç olan ve yeni CSC hedefleme tedavileri geliştirmek için ilk adım olarak hizmet edebilen ankrajdan bağımsız küre kültürü tekniği kullanılarak in vitro olarak genişletilebilir. Burada pankreatik CSC'lerin genişletilmesi, analizi ve hedeflenmesi için metodoloji sağlanmaktadır.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Burada in vitro NKX6-1 + pankreas atalarıdır insan embriyonik kök hücreleri ayırt etmek için 4 aşamalı bir protokol açıklar. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre hatları çeşitli uygulanabilir.

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Rejeneratif tıp için çok önemli olduğunu somatik SCs hastalığı modelleme ve SC özellikleri anlayış kazanmak için. Burada yeniden programlamak için deneysel stratejiler mevcut, içinde vitro, yetişkin hücreler karşılık gelen Genişletilebilir doku özgü kök/progenitor hücreler tek transkripsiyon co aktivatörü YAP geçici ifade tarafından ayrıştırılan.

De Novo Somatik kök hücreleri tarafından YAP/TAZ nesil

Burada, pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut (PDX1+) hücreleri pankreas soy nesil için alan koloni sigara türü monolayer büyüme üzerinde tek hücre ayrışmış. Bu yöntem homojen hPSC elde edilen hücreleri, genetik manipülasyon üreten ve eleme için uygundur.

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Birincil acinar hücre izolasyon, protein ifade veya etkinlik modülasyon, kültür ve aşağı akış uygulamaları eski bol yararlı vivo çalışmada acinar-için-duktal metaplazi (ADM), pankreas kanseri gelişimi erken bir durumda.

Taklit ve 3 boyutlu hücre kültüründe pankreas Acinar-için-duktal metaplazi manipüle

Pankreas duktal adenokarsinomun hasta kaynaklı organoid kültürleri, epitel aliskan kollektifini yüksek sadakatle temsil eden, bu öldürücü maligniteye çeviri araþtirici araþtýrýmý saýkan, hýzlýklý bir 3 boyutlu modeldir. Burada organoidlerin kurulması ve yayılması ve bu modelleri kullanarak ilgili biyolojik tahlillerin gerçekleþtirilen ayrýntýlý yöntemlerin yer alýnmasýný saýlýyor.

Hasta Kaynaklı Pankreas Duktal Adenokarsinom Organoid Modellerinin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Mevcut protokol, düzlemsel tek katmanlı insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 transkripsiyon faktörlerinin birlikte ekspresyonunu arttırmak için geliştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, taze matrisin yenilenmesi, hücre yoğunluğunun manipüle edilmesi ve endodermal hücrelerin ayrışmasıyla elde edilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin 2D Kültür Sisteminde Pankreatik Beta Hücre Öncüllerine Farklılaşması

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Keşfedin, pankreatik duktal adenokarsinom hücrelerini iPS hücrelerine yeniden programlama protokolünü. Bu yöntem, kanser ilerlemesini ve hastalık heterojenliğini incelemek için kararlı hücre hatları oluşturur.

Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Pluripotentliğe Yeniden Programlanması

Daha fazla video keşfet