Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu
13 Ekim 2023
Protokol, doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere 10x Genomik platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar.
Tümör biyolojisi hakkındaki bilgimiz arttıkça ve hücrelerin tümör içinde nasıl etkileşime girdiğinin ve hasta sonuçlarını nasıl etkilediğinin inceliklerini anlamaya olan ilgimiz arttıkça, tümör mikroçevresindeki heterojen hücreleri analiz etmenin önemi de artmıştır. Tek hücreli RNA'nın elde edilmesine ve aynı hücreden eşleştirilmiş hücre tarzında saldırı dizilimine izin veren çoklu dizileme, bu amaca yönelik önemli bir ilerleme sağlar. Bununla birlikte, bu deneylerden elde edilen verilerin kalitesi, deney koşullarının ve girilen biyolojik materyalin kalitesine büyük ölçüde bağlıdır.
Bu protokol, 10x Genomics platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, taze veya dondurulmuş tek hücreli süspansiyonlar kullanılarak güvenilirdir. Doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi için öneriler sunuyoruz.
Bu protokolde laboratuvarımızda primer doku tipi olan insan pankreatik duktal adenokarsinom örnekleri kullanıldı. Pankreas kanseri, hücrelerin yanı sıra nispeten yapışkan dokuyu da taşıyan oldukça desmoplastik bir tümör tipini temsil eder. Ayrıca, araştırma için mevcut pankreas tümörü örnekleri de nispeten küçük olma eğiliminde olduğundan, yakalanan hücrelerin miktarını en üst düzeye çıkarmak için çaba sarf edilmektedir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, 10x Genomics platformu kullanılarak çoklu-om sekanslama amacıyla katı tümör örneklerinden çekirdek izolasyonu için güvenilir ve optimize edilmiş bir yöntemi özetlemektedir. Doku disosyasyon koşulları ve tek hücre süspansiyonlarının kriyoprezervasyonu için önerileri içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Genomik
Arka Plan
- Tümör biyolojisini anlamak, hasta sonuçlarını iyileştirmek için kritik öneme sahiptir.
- Tümör mikroçevresindeki heterojen hücrelerin analiz edilmesi giderek daha önemli hale gelmektedir.
- Multi-om sekanslama, tek hücreli RNA ve ATAC sekanslamasının eşleşmiş şekilde elde edilmesine olanak tanır.
- Veri kalitesi, deneysel koşullara ve biyolojik materyale yüksek derecede bağımlıdır.
Çalışmanın Amacı
- Katı tümörlerden çekirdek izolasyonu için güvenilir bir protokol sağlamak.
- Çoklu-om sekanslama verilerinin kalitesini artırmak.
- Tümör mikroçevrelerinin analizini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonu.
- Taze veya dondurulmuş tek hücre süspansiyonlarının kullanımı.
- Doku disosiyasyon koşulları için öneriler.
- Tek hücre süspansiyonları için kriyoprezervasyon teknikleri.
Temel Sonuçlar
- Çekirdek izolasyonu için optimize edilmiş bir yaklaşım geliştirilmiştir.
- Hem taze hem de dondurulmuş örneklerden güvenilir sonuçlar elde edilmiştir.
- Multi-om sekanslama için veri kalitesi artırılmıştır.
- Doku işleme ve kriyokorunma için kılavuzlar sağlanmıştır.
Sonuçlar
- Bu protokol, tümörlerden çekirdek izolasyonunun güvenilirliğini artırır.
- Çoklu omik sekanslama tekniklerinin ilerlemesini destekler.
- Gelecekteki çalışmalar, iyileştirilmiş deneysel koşullardan faydalanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Solid tümör örneklerinden optimize edilmiş çekirdek izolasyonu, yüksek kaliteli multiom sekanslama verilerinin üretilmesi için kritik öneme sahiptir ve translasyonel onkolojideki tümör heterojenite analizlerinin güvenilirliğini doğrudan etkiler. Bu protokol, hem taze hem de dondurulmuş desmoplastik tümör dokularından sağlam çekirdeklerin çıkarılması zorluğunu ele alarak, güçlü tek hücreli multiomik profillemeyi destekler. Bu aşamadaki güvenilir çekirdek hazırlığı, sonraki keşif ve biyobelirteç geliştirme süreçlerindeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Tümör hücresi heterojenliğinin tek hücre düzeyinde yüksek doğrulukla sorgulanmasını sağlar.
- İzolasyon sırasında çeşitli hücre popülasyonlarını koruyarak fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Tümör mikroçevresinin doğru temsili yoluyla mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Tekrarlanabilir multiom dizileme analizleri için standartlaştırılmış çekirdek preparasyonları sağlar.
- Ardıl iş akışları için girdi materyallerinde kantitatif ve kalitatif tutarlılık sağlar.
- Hem taze hem de kriyoprezerve edilmiş tümör örneklerini kabul ederek analiz hazırlığını iyileştirir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Eşleşmiş RNA ve kromatin erişilebilirliği profillemesini mümkün kılarak translasyonel biyobelirteç keşfiyle uyum sağlar.
- Katı tümör mikroçevrelerinin karmaşıklığını yakalayarak hastalıkla olan ilgiyi korur.
- Girdi kalitesini standartlaştırarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu çekirdek izolasyon protokolü, doku işleme ile multiomik veri üretimi arasındaki arayüzde yer alarak, erken keşif ve translasyonel araştırma iş akışları arasında bir köprü kurmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Hücre çeşitliliğini ve bütünlüğünü koruyarak hipotez testi gücünü maksimize eder.
- Tarama: Ölçeklenebilir multiom sekanslama analizleri için tekrarlanabilir, yüksek kaliteli çekirdekler sağlar.
- Analitik: Tümör hücresi durumlarını ve kromatin manzaralarını karşılaştırmak için sağlam kantitatif okumalar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Eşleştirilmiş tek hücre RNA ve ATAC-seq analizlerini destekleyerek biyobelirteç uyumunu kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli katı tümör tipleri ve örnek koşulları için standartlaştırılmış, uyarlanabilir bir protokol oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tümör biyolojisi ve hedef doğrulama çalışmalarındaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Taze ve dondurulmuş tümör örneklerinde tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Numune hazırlama aşamasında veri kaybı veya artefakt oluşma riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Onkoloji keşif ve translasyonel programlarının riskten arındırılmış ilerleyişini destekler.
Uygulama Hususları
- Optimum verim ve kalite için doku disosiasyonu ve çekirdek işleme konusunda uzmanlık gerektirir.
- Özel reaktiflere, hücre süzgeçlerine ve kantitatif değerlendirme araçlarına erişim gereklidir.
- Tekrar üretilebilirlik için sindirim ve lizis koşullarının ekipler arası standardizasyonu gereklidir.
- Özellikle desmoplastik dokular için, farklı tümör tiplerine ve örnek boyutlarına göre uyarlanmalıdır.
- Sonraki sekanslama aşamalarında artefaktların önlenmesi için nükleer bütünlüğün dikkatle izlenmesi esastır.
