Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu
13 Ekim 2023
Protokol, doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere 10x Genomik platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar.
Tümör biyolojisi hakkındaki bilgimiz arttıkça ve hücrelerin tümör içinde nasıl etkileşime girdiğinin ve hasta sonuçlarını nasıl etkilediğinin inceliklerini anlamaya olan ilgimiz arttıkça, tümör mikroçevresindeki heterojen hücreleri analiz etmenin önemi de artmıştır. Tek hücreli RNA'nın elde edilmesine ve aynı hücreden eşleştirilmiş hücre tarzında saldırı dizilimine izin veren çoklu dizileme, bu amaca yönelik önemli bir ilerleme sağlar. Bununla birlikte, bu deneylerden elde edilen verilerin kalitesi, deney koşullarının ve girilen biyolojik materyalin kalitesine büyük ölçüde bağlıdır.
Bu protokol, 10x Genomics platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, taze veya dondurulmuş tek hücreli süspansiyonlar kullanılarak güvenilirdir. Doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi için öneriler sunuyoruz.
Bu protokolde laboratuvarımızda primer doku tipi olan insan pankreatik duktal adenokarsinom örnekleri kullanıldı. Pankreas kanseri, hücrelerin yanı sıra nispeten yapışkan dokuyu da taşıyan oldukça desmoplastik bir tümör tipini temsil eder. Ayrıca, araştırma için mevcut pankreas tümörü örnekleri de nispeten küçük olma eğiliminde olduğundan, yakalanan hücrelerin miktarını en üst düzeye çıkarmak için çaba sarf edilmektedir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, 10x Genomics platformunu kullanarak çok genomlu sekanslama için katı tümör örneklerinden çekirdek izole etmek için güvenilir ve optimize edilmiş bir yöntem sunar. Doku ayrıştırma koşulları ve tek hücreli süspansiyonların krioprezervasyonu için öneriler içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Onkoloji
- Genomik
Arka Plan
- Tümör biyolojisini anlamak, hasta sonuçlarını iyileştirmek için kritik öneme sahiptir.
- Tümör mikroçevresi içindeki heterojen hücrelerin analizi giderek daha önemli hale gelmektedir.
- Çok genomlu sekanslama, aynı hücreden RNA ve ATAC sekanslamanın eşleştirilmiş elde edilmesini sağlar.
- Verilerin kalitesi, deneysel koşullara ve biyolojik malzemeye büyük ölçüde bağlıdır.
Çalışmanın Amacı
- Katı tümörlerden çekirdek izole etmek için güvenilir bir protokol sağlamak.
- Çok genomlu sekanslama verilerinin kalitesini artırmak.
- Tümör mikroçevrelerinin analizini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Katı tümör örneklerinden çekirdek izole etmek.
- Taze veya dondurulmuş tek hücreli süspansiyonların kullanımı.
- Doku ayrıştırma koşulları için öneriler.
- Tek hücreli süspansiyonlar için krioprezervasyon teknikleri.
Ana Sonuçlar
- Çekirdek izolasyonu için optimize edilmiş yaklaşım kuruldu.
- Hem taze hem de dondurulmuş örneklerden güvenilir sonuçlar elde edildi.
- Çok genomlu sekanslama için veri kalitesi geliştirildi.
- Doku işleme ve krioprezervasyon için yönergeler sağlandı.
Sonuçlar
- Protokol, tümörlerden çekirdek izolasyonunun güvenilirliğini artırır.
- Çok genomlu sekanslama tekniklerinin ilerlemesini destekler.
- Gelecek çalışmaları, iyileştirilmiş deneysel koşullardan faydalanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Optimized nuclei isolation from solid tumor specimens is critical for generating high-quality multiome sequencing data, directly impacting the reliability of tumor heterogeneity analyses in translational oncology. This protocol addresses the challenge of extracting intact nuclei from both fresh and frozen desmoplastic tumor tissues, supporting robust single-cell multiomic profiling. Reliable nuclei preparation at this stage enhances predictive confidence in downstream discovery and biomarker development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity interrogation of tumor cell heterogeneity at the single-cell level.
- Supports functional target validation by preserving diverse cell populations during isolation.
- Facilitates mechanistic de-risking through accurate representation of the tumor microenvironment.
Screening & Assay Development
- Provides standardized nuclei preparations for reproducible multiome sequencing assays.
- Ensures quantitative and qualitative consistency in input material for downstream workflows.
- Improves assay readiness by accommodating both fresh and cryopreserved tumor samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling paired RNA and chromatin accessibility profiling.
- Maintains disease relevance by capturing the complexity of solid tumor microenvironments.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by standardizing input quality.
Pipeline & Workflow Integration
This nuclei isolation protocol is positioned at the interface of tissue processing and multiomic data generation, bridging early discovery and translational research workflows.
- Discovery Biology: Maximizes hypothesis testing power by preserving cell diversity and integrity.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality nuclei for scalable multiome sequencing assays.
- Analytics: Enables robust quantitative readouts for comparing tumor cell states and chromatin landscapes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by supporting paired single-cell RNA and ATAC-seq analyses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, adaptable protocol for diverse solid tumor types and sample conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumor biology and target validation studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability across fresh and frozen tumor samples.
- Strategic Value: Reduces risk of data loss or artifact introduction at the sample preparation stage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of oncology discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissociation and nuclei handling for optimal yield and quality.
- Demands access to specialized reagents, cell strainers, and quantitative assessment tools.
- Necessitates cross-team standardization of digestion and lysis conditions for reproducibility.
- Must be adapted for varying tumor types and sample sizes, especially for desmoplastic tissues.
- Careful monitoring of nuclear integrity is essential to avoid downstream sequencing artifacts.
