Murin Dalak Dokusu Oluşumunu Araştırmak için Bazal Membran Matris Kapsüllü Hücre Agregasyonu
June 28th, 2024
Bu makale, yarı katı bir bazal membran matrisi içinde dalak hücrelerini toplamak ve kapsüllemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bazal membran matris yapıları, organoid gelişimini incelemek için veya in vivo transplantasyon ve doku rejenerasyon çalışmaları için üç boyutlu kültürde kullanılabilir.
Bu protokolün genel amacı, hücreleri yarı katı bir matris içinde toplamak ve kaplamaktır. Gömülü hücre agregatları daha sonra üç boyutlu in vitro kültürde veya in vivo transplantasyon deneyleri için bir araç olarak kullanılabilir. Bu yöntemin temel avantajı, hücre agregasyonunu sağlamak için basit metodoloji ve ekipman kullanmasıdır.
Ayrıca bir dizi hücre türüne ve sayısına da uygulanabilir. Bu teknik, dalağın yenilenmesi için gerekli olan belirli bir hücre tipini ortaya çıkarmıştır. Dalak dokusu rejenerasyonunun daha fazla düzenleyicisini ortaya çıkarabilir veya daha geniş doku mühendisliği çalışmaları için bir platform görevi görebilir.
Eksi 20 santigrat derecelik bir dondurucuda 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kutusunu önceden soğutarak başlayın. Daha sonra Parafilmi 10 dakika boyunca% 80 etanole batırın, ardından PBS'de 10 dakikalık bir yıkama yapın. Hücre çözeltisini hazırlamak için, istenen hücre sayısını 14 mililitrelik konik bir tüpe alın.
Hücreleri 200g ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, yaklaşık 20 mikrolitre hacim bırakarak süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peleti daha sonra kalan süpernatan hacimde yeniden süspanse edilebilir.
Önceden soğutulmuş bir pipet ucu kullanarak 2 mikrolitre buz gibi Matrigel'i aspire edin. Pipet ucunu çıkarmak için hafifçe döndürün ve çıkarın. Önceden sterilize edilmiş bir Parafilm şeridini gerin ve filmi delmemeye dikkat ederek pipet ucunun ucuna yerleştirin.
Ucun sızdırmaz olduğundan emin olmak için Parafilmi yan tarafa sarmaya devam edin. Ardından hücre çözeltisini Matrigel'in üzerine nazikçe yerleştirin. Pipet ucunu buz üzerinde bırakın ve içine 1,2 mililitrelik küme tüpü yerleştirilmiş 14 mililitrelik konik bir tüp hazırlayın.
Pipet ucu daha sonra iç içe geçmiş tüp konfigürasyonunun içine yerleştirilebilir ve 5 dakika boyunca 400 g ve 4 santigrat derecede santrifüjlenebilir. Tüpü 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Tüp, daha fazla ihtiyaç duyulana kadar buz üzerine yerleştirilebilir.
Parafilmi pipet ucundan dikkatlice çıkarın, ardından ince bir tel piston yerleştirin ve Matrigel tıkacını doku kültürü ortamına atın. Toplanan hücreler 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürlenebilir. Elektrikli makas kullanarak kürkü tıraş edin ve cildi %80 etanol ile temizleyin.
Deride omurgaya dik iki santimetrelik bir kesi yapın ve periton duvarını ortaya çıkarın. Daha sonra böbreğin üzerindeki periton duvarında daha küçük ikinci bir kesi yapılır. Baskı uygulayın ve böbreğin dışını boşaltın.
Düzenli olarak steril PBS uygulayarak böbreğin nemli tutulduğundan emin olun. Böbrek kapsülünü bir çift ultra ince forseps ile sıkıştırın ve ikinci bir çift kullanarak zıt yönlerde hafifçe yırtın. Kapsül zarını böbrek parankiminden dikkatlice ayırın.
Böbrek kapsülünü bir çift forseps ile kaldırın ve pipet ucunu yavaşça açıklıktan kaydırın. Pipet ucuna yavaşça bir tel piston yerleştirin ve Matrigel tapasını çıkarın. Böbreği PBS ile nemlendirin ve periton boşluğuna yeniden içselleştirin.
Periton duvarını 5-O-Vicryl dikişlerle kapatın ve bir AutoClip uygulayıcısı ve iki adet 9 milimetrelik yara klipsi kullanarak cilt insizyonunu kapatın. Bu protokoldeki önemli bir adım, yarı katı bir matris içindeki hücreleri toplamaktır. Optimum santrifüj hızları ile bir orta katman konumlandırması elde edilir.
Daha yüksek hızlar hücreleri pipetin en ucuna kadar iterken, yetersiz hızlar matris boyunca hücre hareketini engeller. Katılaşmanın ardından, Matrigel yapısı pipet ucundan çıkarılabilir. İn vitro kültürlenen dalak stromal yapıları, üç boyutlu küresel organoid yapılar oluşturur.
Organoidler, dokunun tüm çapı boyunca bulunan hücrelerle içi boş olmayan bir yapı sergiler. Beyaz kan hücreleri, kırmızı kan hücreleri ve hemopoietik olmayan stromal ve endotel hücreleri dahil olmak üzere üç geniş hücre popülasyonundan oluşurlar. Yapılar, doku rejenerasyon çalışmaları için böbrek kapsülünün altına da nakledilebilir.
Dört hafta sonra, santral arteriyoller, B hücre folikülleri, fibroblastik retiküler hücreler, kırmızı pulpa miyeloid hücreleri, marjinal zon metalofilik makrofajlar, kırmızı pulpa sinüzoidleri ve foliküler dendritik hücre ağları, T hücre zonu, kırmızı pulpa makrofajları ve marjinal zon retiküler hücreleri dahil olmak üzere organize dalak doku yapısı gözlenebilir. Hücre agregasyonu ve kapsüllemeyi denerken, hızlı çalışmayı ve tüm malzemeleri buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Transplantasyonlar için en önemli adım, pipet ucunu böbrekten çekerken Matrigel tıkacının dışarı atılmasıdır.
Kapsül zarının delinmemesine veya böbrek parankiminin yırtılmamasına dikkat edilmelidir. Bu protokol, dalak dokusu rejenerasyonunda iki stromal hücre popülasyonunun gereksinimlerini araştırmak için kullanıldı. Bu temsili deneyde, sadece trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü-beta pozitif MAdCAM negatif hücrelerden tükenmiş agregalar doku büyümesini başlatamadı, bu da bu özel hücre popülasyonunun dalağın yenilenmesi için gerekli olduğunu düşündürdü.
Genel Bakış
Bu makale, dalak hücrelerini yarı-katı bir bazal zar matrisi içinde toplamak ve kapsüllemek için bir protokol tanımlamaktadır. Bu teknik, organoid gelişimini incelemek için üç boyutlu kültürde veya in vivo transplantasyon ve doku rejenerasyon çalışmalarında kullanılabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre toplanması
- Doku mühendisliği
- Rejeneratif tıp
Arka Plan
- Protokol, hücrelerin yarı-katı bir matris içinde kapsüllenmesine izin verir.
- Çeşitli hücre tipleri ve sayılarına uygulanabilir.
- Bu yöntem, dalak rejenerasyonu için gerekli olan spesifik hücre tiplerini ortaya çıkarmıştır.
- Daha geniş doku mühendisliği çalışmaları için bir platform sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Dalak hücrelerini bazal zar matrisi içinde toplamak ve kapsüllemek.
- Üç boyutlu in vitro kültürü kolaylaştırmak.
- In vivo transplantasyon deneylerini mümkün kılmak.
Kullanılan Yöntemler
- Dalak hücrelerinin toplanması.
- Yarı-katı bazal zar matrisi içinde kapsülleme.
- Basit metodoloji ve ekipman kullanımı.
- Çeşitli hücre tiplerinde uygulama.
Ana Sonuçlar
- Dalak hücrelerinin başarılı bir şekilde toplanması ve kapsüllenmesi.
- Dalak rejenerasyonu için gerekli olan spesifik hücre tiplerinin tanımlanması.
- Doku rejenerasyonunun daha fazla düzenleyicisini ortaya çıkarmanın potansiyeli.
- Doku mühendisliği çalışmaları için bir platformun kurulması.
Sonuçlar
- Protokol, hücre toplanması için basit bir yöntem sağlar.
- Dalak dokusu rejenerasyonunu anlamak için önemli sonuçları vardır.
- Bu teknik, gelecekteki doku mühendisliği araştırmalarını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Basement membrane matrix encapsulated cell aggregation enables controlled investigation of cellular requirements for murine spleen tissue formation, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This platform provides predictive confidence for identifying essential stromal cell populations in tissue regeneration, directly informing target validation and tissue engineering strategies. The method's adaptability to both in vitro organoid culture and in vivo transplantation positions it as a reusable capability for regenerative medicine R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular mechanisms underlying spleen tissue regeneration.
- Supports functional validation of stromal cell populations critical for organogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating and testing specific cell types.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies on tissue formation requirements.
Screening & Assay Development
- Prepares validated three-dimensional organoid systems for downstream analysis.
- Standardizes encapsulation and aggregation for reproducible tissue constructs.
- Generates quantitative outputs on organoid structure and cellular composition.
- Enables scalable evaluation of cell population contributions to tissue formation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro and in vivo models for translational continuity in tissue engineering.
- Supports risk-adjusted advancement of regenerative strategies based on functional tissue outcomes.
- Provides a disease-relevant system for studying immune organ regeneration.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to successful tissue formation.
Pipeline & Workflow Integration
This encapsulation and aggregation method bridges early discovery, screening, and preclinical validation by enabling controlled manipulation and assessment of cell populations in both organoid and transplantation models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular drivers of spleen tissue regeneration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative organoid constructs for comparative studies.
- Analytics: Provides measurable outputs on tissue architecture and cell-type contributions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo tissue formation and functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse tissue engineering and regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target cell populations for tissue regeneration.
- Operational Value: Standardizes encapsulation and aggregation for reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for advancing regenerative strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of tissue engineering approaches.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, encapsulation, and organoid culture techniques.
- Needs access to centrifugation, sterile handling, and transplantation instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across experiments.
- Adaptable to various cell types and tissue models with protocol optimization.
- Careful handling is essential to avoid tissue or organ damage during transplantation steps.
