Name: Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Öğrenin, lüminesans tabanlı raportör testleriyle DNA çift iplikli kırılma onarım aktivitesini hücrelerde kantitatif olarak değerlendirin. Bu yüksek verimli yöntem, kanser ilaç keşfi ve DNA hasar yanıtı biyolojisini anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm çalışmalar Artios Pharma Ltd. tarafından finanse edildi. Şekil 1 ve Şekil 3 Biorender.com ile oluşturuldu.

Nanolusiferaz Raportör Testleri ile DNA Çift İplikli Kırılma Onarımının Miktarının Belirlenmesi

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism%2C+cellular+functions+and+cancer+roles+of+polymerase-theta-mediated+DNA+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).</li>
<li>Ceccaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous-recombination-deficient+tumours+are+dependent+on+Pol%CE%B8-mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair.</a> Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).</li>
<li>van de Kooij, B., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+reporter+constructs+to+monitor+pathway-specific+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks.</a> Front Genet. 12, 809832(2021).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).</li>
<li>Rajendra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((titratable+and+high-throughput+reporter+assays+to+measure+DNA+double+strand+break+repair+activity+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells.</a> Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Wyatt, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+polymerase+%CE%B8-mediated+end+joining+in+the+repair+of+chromosome+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks.</a> Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).</li>
<li>Wood, R. D., Doublié, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+protection+by+DNA+polymerase+%CE%B8%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome protection by DNA polymerase θ.</a> Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>Zatreanu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol%CE%B8+inhibitors+elicit+BRCA-gene+synthetic+lethality+and+target+PARP+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance.</a> Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).</li>
<li>Stockley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-based+optimization+of+small-molecule+in+vitro+and+in+vivo+probes+for+human+DNA+polymerase+theta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta.</a> J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+the+BRCA2-RAD51+interaction+modulates+RAD51+assembly+and+potentiates+DNA+damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death.</a> Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).</li>
</ol>

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S ve H.M.R.R., Artios Pharma Ltd.'nin çalışanları ve hissedarlarıdır. G.C.M.S., AstraZeneca PLC'nin hissedarıdır. S.J.B., Artios Pharma Ltd.'nin Kurucu Bilim İnsanı ve hissedarıdır. Bu çalışmada özetlenen bazı muhabirler için bir patent başvurusu yapılmıştır (WO 2021/001647). Promega, NanoLuc® teknolojisinin ve modifiye edilmiş NanoLuc® polinükleotidlerinin kaynağıdır. Artios Pharma, modifiye edilmiş NanoLuc® polinükleotidlerini üretmek için Promega tarafından yetkilendirildi.

Burada, dört ana DSBR yolunun (HR, NHEJ, MMEJ ve SSA) hücresel yeterliliğini ölçmek için bir dizi ekstrakromozomal lüminesans tabanlı raportörün oluşturulması ve uygulanması için protokolleri tanımladık7. Raportör substratlar, geçici transfeksiyon yoluyla hücrelere sokulabilir ve aynı kökenli hücresel DSBR yolakları ile etkileşime girdikten sonra yeniden oluşturulan hassas ve sağlam bir plaka bazlı NanoLuc lüminesans okuması kullanılarak DSBR aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir.
Raportör substrat üretiminin çeşitli aşamaları, substratların hücrelere transfeksiyonu ve veri yorumlama, bu tahlillerin başarılı bir şekilde yürütülmesi için kritik öneme sahiptir. Raportör substratları oluşturmak için standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılsa da, sürecin jel elektroforezi ile görselleştirilmesi, transfeksiyondan önce substratların en yüksek kalitesini ve saflığını sağlar. Bu tahliller geçici transfeksiyona bağlı olduğundan, bu yöntemler için ortak hususlar geçerlidir. Bunlar, tohumlama yoğunluğunun, transfeksiyon koşullarının (reaktifler ve DNA miktarları dahil) optimize edilmesini ve ileri ve geri transfeksiyon formatlarında uygunluğun değerlendirilmesini içerir. Bu raportör tahlilleri, bir dizi elektroporasyon ve lipofeksiyon protokolü ile başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir ve bu tahliller yapılmadan önce seçenekler tam olarak araştırılmalıdır. Ayrıca, NanoLuc sinyalinin (raportör substratı) Firefly sinyaline (kontrol) normalleştirilmesiyle türetilen kompozit onarım sinyali yerine, bileşen NanoLuc ve Firefly sinyallerinin incelenmesine de özen gösterilmelidir. Artefaktlar, Firefly sinyalindeki değişiklikler tarafından yönlendirilen orandan kaynaklanabilir. Örneğin, oldukça spesifik bir bileşik kullanılarak doz-yanıt modunda inhibisyonu değerlendirmek, NanoLuc sinyalini, kararlı kalması gereken Firefly sinyalini bozmadan titre edilebilir bir şekilde bastırmalıdır (Şekil 4G, H). Bununla birlikte, Firefly sinyallerinin bozulduğu durumlarda, Firefly sinyalinin etkilenmediği bir doz penceresi belirlenerek onarım üzerindeki yararlı etkiler yine de belirlenebilir (Şekil 5).
En sık kullanılan DSBR raportör tahlilleri ile karşılaştırıldığında, bu ekstrakromozomal lüminesans tabanlı raportör tahlillerinin bazı belirgin avantajları vardır. DSBR yolları yüksek oranda korunduğundan, hücresel makineler hücre modelleri arasında farklılık gösterse bile, tahliller yine de DSBR yeterliliği ve yol seçimi hakkında rapor verebilir. Bu, DSBR'nin değerlendirmesini, optimum geçici transfeksiyon koşulları önceden oluşturulduğu sürece, kullanıcının ilgilendiği herhangi bir modele açar.
Raportör gen olarak Nanolusiferaz'ın kullanılması, DSBR raportör tahlillerinde geleneksel olarak kullanılan floresan seçeneklerine göre de avantajlar sunar. NanoLuc hızlı olgunlaşır ve lüminesans, bir plaka okuyucu8 kullanılarak yüksek hassasiyetle tespit edilir. Substrat onarımının hızıyla birleştiğinde (raportör substratlar, onarıma hazır DSB uçlarına sahip hücrelere transfekte edildiğinden), bu DSBR raportör testi formatı, endüstriyel bir ilaç keşif kademesinin bir parçası olarak küçük molekülleri taramak için gereken hızlı geri dönüş ve kantitatif sağlamlık için idealdir. Gerçekten de, yakın zamanda, Polθ polimeraz alanı13'ün küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanması için kullanılan keşif kaskadında rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportör testinin uygulanmasını tanımladık.
DSBR'nin genetik ve farmakolojik bozulmaları hakkında spesifik soruları ele almak için raportör testlerinin uygulanmasında da esneklik vardır (Şekil 3). Örneğin, raportör substratların transfeksiyonundan önce, hücreler 48-72 saat boyunca ilgilenilen bir gene karşı siRNA ile transfekte edilebilir. Alternatif olarak, gen aşırı ekspresyonunun DSBR yolakları üzerindeki etkileri, raportör substratların transfeksiyonundan 24-48 saat önce plazmit transfeksiyonu gerçekleştirilerek test edilebilir. Farmakolojik çalışmalar için, mevcut protokol zaten küçük moleküllerin kullanımının standart iş akışına nasıl dahil edilebileceğini açıklamaktadır, ancak alternatif formatlar, ön inkübasyonlar veya yıkamalar gibi bileşik tedavi rejimlerinde değişiklikler içerebilir.
Geçici transfeksiyonun ölçeklenebilirliği, raportör substratlarının toplu transfeksiyonunun taramadan önce gerçekleştirildiği büyük ölçekli tarama yaklaşımlarını da destekleyebilir. Ayrıca, transfeksiyondan okumaya kadar testin süresi de değişebilir. Standart süreler 16-24 saat olabilse de, bazı testler 6 saat gibi kısa bir sürede okunabilir7. Hücre canlılığını tehlikeye atabilecek küçük moleküllerden veya siRNA'dan kaynaklanan toksisite ile ilgili endişeler de test süresinin belirlenmesinde dikkate alınmalıdır.
Özetle, bu çalışmada özetlenen ve yakın tarihli bir yayında7 tam olarak açıklanan tahliller, hücresel DSBR yeterliliğinin hızlı ve sağlam bir değerlendirmesini sağlar. Oldukça hassas ve titre edilebilirler, bu da onları hem genetik hem de farmakolojik çalışmalara uygun hale getirir. En önemlisi, raportör substratlar geçici transfeksiyon yoluyla hücrelere sokulabildiğinden, kromozomal DSBR raportörlerinde olduğu gibi kararlı entegrasyon ile belirli hücre hatlarıyla sınırlı kalmak yerine, ilgilenilen herhangi bir transfekte edilebilir hücre modelinde kullanılma potansiyeline sahiptirler. Bununla birlikte, bu raportör ekstrakromozomal tahlillerin belirgin bir sınırlaması, genoma entegrasyon eksikliğinin, DNA onarımının fizyolojik, kromatinize bağlamını ve bununla ilişkili düzenleyici ipuçlarını ve orkestrasyonunu tam olarak özetleyemeyebilmesidir15. Bu amaçla, ekstrakromozomal raportör tahlilleri, mevcut DSBR değerlendirme yöntemlerini tamamlayıcı niteliktedir ve hem temel araştırma hem de ilaç keşfi için uygun kaynak araç setini genişletir.

DNA çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler), hücrelerin bu lezyonları onarmak için çoklu DSB onarım (DSBR) yolları geliştirmesi nedeniyle özellikle toksik bir DNA hasarı1 sınıfını temsil eder. Dört ana DSBR mekanizması, homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ) ve tek iplikli tavlamadır (SSA)2,3. DSBR yolakları, sağlıklı doku gelişiminin ve fizyolojisinin korunmasına katkıda bulunur ve kanser gibi hastalıklara karşı koruma sağlar. Ayrıca, bu onarım mekanizmaları, hassas onkolojide küçük molekül modülatörlerinin geliştirilmesi için terapötik potansiyele sahiptir. Örneğin, MMEJ onarım yolunda çok önemli bir enzim olan DNA Polimeraz θ'yi (Polθ) hedeflemek, kanserde HR eksikliği ile sentetik ölümcüllüğü nedeniyle ilgi çekmiştir4.
Bu nedenle DSBR'yi anlamak geniş klinik etkilere sahiptir ve tüm ana DSBR yollarının aktivitesini ölçebilen fonksiyonel hücresel tahlillere ihtiyaç vardır5. Tahliller hem genetik hem de farmakolojik sorgulama için uygun olmalı ve ilgilenilen hücre modellerinde konuşlandırılabilir olmalıdır. Küçük moleküllü ilaç keşif çabalarını desteklemek için, tahlillerin son derece hassas olması, titre edilebilir olması, hızlı bir geri dönüşe sahip olması ve bileşik taraması için uygun yüksek verimli formatlara ölçeklenebilir olması gerekir.
Genel olarak, DSBR daha önce hücre genomuna6 kararlı bir şekilde entegre edilmiş floresan tabanlı raportör tahlil sistemleri kullanılarak ölçülmüştür. Bununla birlikte, kromozomal DSBR'nin fizyolojik rekapitülasyonu belirgin bir avantaj olsa da, bu tür tahliller, raportörün entegre edildiği, emek yoğun numune hazırlama ve akış sitometrisi ile analiz kullandığı ve sınırlı verim, geri dönüş süresi, sağlamlık ve duyarlılığa sahip olduğu bir konak modelle sınırlıdır, ilaç keşif çabaları için gerekli tüm temel özellikler.
Burada, dört ana DSBR yolunun değerlendirilmesine izin veren bir dizi DSBR raportör tahlilini açıklıyoruz. Raportör tahlil substratları paketi Şekil 1'de özetlenmiştir ve yakın tarihli bir yayın7'de daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ekstrakromozomaldirler, basit geçici transfeksiyon yoluyla hücrelere girmelerine izin verirler ve belirli DSBR mekanizmaları ile etkileşime girerek yeniden yapılandırılması gereken bir nanolusiferaz raportör gen8'in dahil edilmesi, duyarlılık, sağlamlık ve ölçeklenebilirlik sağlar. Aşağıdaki DSBR raportör substrat varyantları protokole dahil edilmiştir (Şekil 1):
Rezeksiyondan bağımsız MMEJ: Bu doğrusal substrat, rezeke edilmiş DNA uçları9'u taklit eden tek sarmallı DNA (ssDNA) çıkıntılarına sahip bir çekirdek çift sarmallı DNA (dsDNA) bölgesinden oluşur. ssDNA bölgelerinin terminalindeki dört nükleotid mikrohomolojisi, raportör gen için başlangıç kodonunu kodlar. Bu substratın MMEJ yoluyla onarımı, raportör gen açık okuma çerçevesini (ORF) geri yükler.
Rezeksiyona bağımlı MMEJ: N-terminal raportör gen ekzonu, 8 baz çifti (bp) mikrohomoloji ile çevrili bir durdurma kodonu içeren bir segment tarafından kesilir. Sağlam raportör geni eski haline getirmek için MMEJ aracılı onarımdan önce nükleolitik uç rezeksiyonu gereklidir.
Künt NHEJ: Raportör gen, N ve C terminal bölümlerine ayrılır ve bunlardan ikincisi promotörün yukarısına yerleştirilir. DSB, EcoRV kullanılarak üretilir ve hem raportör gen bölümlerinin yeniden birleştirilmesi hem de raportör ORF'nin geri yüklenmesi için NHEJ tarafından doğrudan ligasyon (son işleme olmadan) gerektirir.
Künt olmayan NHEJ: DSB bir intron içinde bulunur ve restriksiyon enziminin seçimine bağlı olarak kohezif veya kohezif olmayan uçlara sahip olacaktır. Bu alt tabakanın NHEJ tarafından onarımı, ligasyonun son işlemden önce yapılmasını gerektirir.
Uzun şablon İK: Raportör genin N-terminal ekzonu, orijinal raportör gen dizisinin 22 bp'sinin yerini alan kısıtlama bölgelerini içeren bir DNA segmenti tarafından kesilir. Bu diziyi geri yüklemek için, HR ile onarım, C-terminal eksonunun akış aşağısına yerleştirilen 2,5 kilobaz (kb) homoloji şablonunu kullanır.
Kısa şablon İK: DSB'yi oluşturmak için gereken kısıtlama bölgesi, yerel raportör gen dizisinin bir kısmının yerini alır ve çerçeve içi bir durdurma kodonu sunar. Uzun şablon sürümü gibi, bu HR alt tabakası da raportör ORF'nin doğru onarımı ve geri yüklenmesi için aşağı akış homoloji şablonunu (360 bp) gerektirir.
SSA: Bu substrat, raportör genin N-terminal ekzonu içinde bulunan bir erken durdurma kodonu içerir. Bu durdurma kodonunun çıkarılması ve sağlam raportör gen dizisinin eski haline getirilmesi, homolojilerin hizalanmasından önce iki yönlü uzun menzilli rezeksiyonu içeren SSA ile onarım gerektirir.
DSB'nin üretilmesi için, raportör substratların bir kısmı I-SceI ile sindirilebilir (Şekil 1). Bu, ters oryantasyonlarda tandem I-SceI bölgelerine sahip rezeksiyona bağımlı MMEJ, künt olmayan NHEJ, uzun şablon HR ve SSA raportörlerinde kohezif olmayan uçlara sahip doğrusal bir substrat oluşturacaktır. Kısa şablon HR raportör substratında, tek I-SceI sitesinin sindirimi uyumlu uçlar oluşturacaktır. Künt olmayan NHEJ, rezeksiyona bağımlı MMEJ, uzun şablon HR ve SSA plazmitleri de HindIII ile sindirilebilir, bu da tamamlayıcı kohezif uçlar üretecektir.
Raportör tahlil substratlarının oluşturulması için protokoller sağlıyoruz ve tahlillerin nasıl gerçekleştirilebileceğini açıklıyoruz, küçük moleküllere titre edilebilir yanıtlar, hücresel gücün, hedef üzerindeki aktivitenin ve yol seçiciliğinin değerlendirilmesi dahil olmak üzere DSBR'yi ölçmek için nasıl kullanılabileceğine dair ayrıntılar sağlıyoruz.

<table><tbody><tr><td>10x TBE tamponu</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>%20 TBE-akrilamid jel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6315BOX</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE tamponu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13321</td><td></td></tr><tr><td>6x Jel Yükleme Boyası, Mor</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu beyaz plaka (şeffaf alt ve kapaklı)</td><td>Porvair</td><td>204012</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td> DNA Antarktika fosfataz ve 10X <td>tamponunun boncuk bazlı saflaştırılması için</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>430-101</td><td>Plaka okuyucu</td></tr><tr><td>Kontes II Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX1000</td><td>Hücre sayacı</td></tr><tr><td>Özel oligonükleotidler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Rezeksiyondan bağımsız MMEJ substratı için özel sipariş. Tablo 2'ye bakın.</td></tr><tr><td>D300e</td><td>Tecan</td><td>30100152</td><td>DMSO bazlı bileşik dağıtıcı</td></tr><tr><td>D300e D4+ kaset</td><td>Tecan</td><td>30097371</td><td>D300e bileşik dağıtıcı için yüksek hacimli kaset</td></tr><tr><td>D300e T8+ kaset</td><td>Tecan</td><td>30097370</td><td>D300e bileşik dağıtıcı için düşük hacimli kaset</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit, hücre kültürü sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Şekil 4'te kullanılan bileşikler için araç ve Şekil 5</td></tr><tr><td>DSBR raportör kaynak plazmitleri</td><td>Artios</td><td></td><td>Talep üzerine akademik topluluğa sunulmaktadır&nbsp;</td></tr><tr><td>EcoRV-HF ve 10x CutSmart tampon</td><td>NEB</td><td>R3195M</td><td></td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3031&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Ultra Düşük Aralıklı DNA Merdiveni</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1211</td><td>Düşük moleküler ağırlıklı DNA merdiveni</td></tr><tr><td>HEK-293 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>HindIII-HF protokolünde kullanılan örnek hücre hattı</td></tr><tr><td>ve 10x CutSmart tamponu</td><td>NEB</td><td>R3104M</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Moleküler Biyoloji sınıfı su</td><td>Fisher Scientific</td><td>10275262</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI ve 10x Tango Tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>ER1771</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>VWR</td><td>20842.33</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME reaktifi ve tamponu</td><td>PolyPlus</td><td>114-15</td><td>Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>MegaStar 1.6</td><td>VWR</td><td>521-1749</td><td>15 veya 50 mL tüpler için santrifüj</td></tr><tr><td>MEM Eagle</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-08056</td><td>HEK-293 hücreleri için kültür ortamı</td></tr><tr><td>Mikroplaka çalkalayıcı</td><td>Fisherbrand</td><td>15504070</td><td>Mikroplaka orbital çalkalayıcı</td></tr><tr><td>MicroStar 17R</td><td>VWR</td><td>521-1647</td><td>1.5 veya 2 mL tüpler için</td></tr> santrifüj <tr><td>MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>5840300</td><td>Hücre veya su bazlı reaktif dağıtıcı</td></tr><tr><td>MultiDrop Standart Kaset</td><td>Thermo Fisher</td><td>24072670</td><td>MultiDrop reaktif dağıtıcı için Kaset</td></tr><tr><td>NanoDLR Durdur & Firefly</td> lüminesansını söndürmek ve NanoLuc lüminesansını tespit etmek için Glo Buffer ve Substrate <td>Promega</td><td>N1630 veya N1650</td><td>Reporter lusiferaz (NanoLuc) reaktifi. Firefly'ı tespit etmek için Nano-Glo Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi kiti</td></tr><tr><td>ONE-Glo EX Luciferase Test Tamponu ve Substrat</td><td>Promega</td><td>N1630 veya N1650</td><td>Kontrol lusiferaz (Firefly) tahlil reaktifinin bir parçası. Nano-Glo Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi kitinin bir parçası</td></tr><tr><td>PBS (kalsiyum veya magnezyum olmadan)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Firefly plazmidi (veya benzeri)</td><td>Promega</td><td>E1310 (veya eşdeğeri)</td><td>Firefly kontrol plazmidi</td></tr><tr><td>pNL1.1 NanoLuc plazmidi (veya benzeri)</td><td>Promega</td><td>N1091 (veya eşdeğeri)</td><td>NanoLuc kontrol plazmiti, ekipman ayarlarının/optimizasyon deneylerinin ayarlanması için</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yüklemeli Mor 1 kb DNA Merdiveni</td><td>NEB</td><td>N0552S</td><td>Yüksek moleküler ağırlıklı DNA merdiveni</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat (3 M), pH 5.5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9740</td><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td></tr><tr><td>SYBR Gold (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td> ile jel ekstraksiyonu sırasında pH ayarı <td>için ssDNA ve dsDNA'nın görselleştirilmesi için</td></tr><tr><td>SYBR Güvenli (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Yalnızca dsDNA'nın görselleştirilmesi için</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz ve 10x Ligaz tamponu</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi leke %0.4İnvitrojen</td><td></td> <td>T10282</td><td>Hücre sayımı sırasında canlılığın ölçümü için</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi; %0.25 Tripsin ve 0.53 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>XhoI ve 10x CutSmart tampon</td><td>NEB</td><td>R0146M</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek verimli ve kantitatif lüminesans tabanlı raportör testleri kullanılarak dna Çift İplikli kırılma onarım aktivitesinin değerlendirilmesi

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

DNA çift iplikçik kırılmalarının (DSB'ler) onarımı, genom stabilitesinin ve hücre canlılığının korunması için çok önemlidir. Hücrelerde DSB onarımına (DSBR) çeşitli mekanizmalar aracılık eder: homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ) ve tek iplikli tavlama (SSA). Hücresel tahliller, çeşitli uyaranlara yanıt olarak bu yolların yeterliliğini ve modülasyonunu ölçmek için gereklidir.
Burada, her biri hücrelerdeki dört ana DSBR yolundan biri tarafından bir nanolusiferaz raportör geninin sulandırılmasını ölçen bir dizi ekstrakromozomal raportör testi sunuyoruz. İlgilenilen hücrelere geçici transfeksiyon üzerine, yola özgü raportör substratların onarımı, Nanolusiferaz (NanoLuc) lüminesansının tespiti ile 24 saatin altında ölçülebilir.
Bu sağlam tahliller kantitatif, hassas, titre edilebilir ve yüksek verimli bir tarama formatına uygundur. Bu özellikler, DNA onarım araştırmalarında ve ilaç keşfinde geniş uygulamalar sağlar ve şu anda mevcut olan hücresel DSBR tahlilleri araç setini tamamlar.

Raportör tahlillerinin her birinin onarımı, aynı prosedür kullanılarak tespit edilebilir ve ölçülebilir. Bir substratın hücrelerdeki akraba onarım yolu ile doğru onarımı, NanoLuc'u kodlayan sağlam, işlevsel bir ORF'yi yeniden oluşturacaktır. Bu lüminesans sinyali bir plaka okuyucu kullanılarak tespit edilebilir.
Firefly lusiferazı kodlayan sağlam bir plazmit ile birlikte transfeksiyon, bir transfeksiyon kontrolü görevi görür. Bu kontrol iki amaca hizmet eder. İlk olarak, DSBR'nin genetik veya farmakolojik yollarla modülasyonu ile bozulmaması gerektiğinden, NanoLuc sinyalini normalleştirmek için bir standart sağlar. İkincisi, hücre döngüsü modülasyonu, transkripsiyon/translasyon üzerindeki etkiler veya genel toksisite gibi lusiferaz sinyalini etkileyen hedef dışı hücresel bozulmaların bir göstergesini sağlayabilir.
NanoLuc'un Firefly'a oranı, onarımın vekil bir okuması olarak hizmet eder. Lüminesans değerleri, aynı kuyu içinden iki lusiferaz sinyalinin normalleştirilmesiyle dışa aktarılabilir ve analiz edilebilir. Genetik bozulma çalışmaları söz konusu olduğunda (örneğin, vahşi tip ve KO veya hedeflenmeyen ve hedef siRNA'nın karşılaştırılması), onarım genellikle ebeveyn numunesine (vahşi tip hücreler veya hedeflemeyen kontrol siRNA ile tedavi edilen hücreler) normalize edilir. Farmakolojik modülasyon durumunda, bileşikle muamele edilmiş bir numuneden alınan değerler, araç muamelesi tarafından üretilen değere normalize edilir.
Açıklanan muhabir paketinin tam doğrulaması yakın zamanda yayınlandı7. DSBR'nin genetik ve farmakolojik modülasyonunun karakterizasyonunu örnekleyen veriler Şekil 4'te gösterilmiştir (7'den uyarlanmıştır). Polθ, MMEJ'nin anahtar aracısıdır ve bu enzimin kaybının veya inhibisyonunun hücresel MMEJ 3,10'u spesifik olarak ablate ettiği tahmin edilmektedir. Polθ'yu kodlayan gen olan POLQ'nun 11 nakavt edildiği bir hücre hattı kullanılarak, rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportör testi, MMEJ'nin gerçekten neredeyse tamamen bastırıldığını göstermektedir. Bileşen NanoLuc ve Firefly lüminesans sinyallerinin değerlendirilmesi, gözlemlenen onarım kusurunun, Firefly sinyali (kontrol) bozulmazken NanoLuc sinyalindeki (raportör substrat tarafından kodlanan) bir azalma tarafından yönlendirildiğini göstermektedir (Şekil 4A-C). Buna karşılık, künt uçlu NHEJ raportörü kullanılarak NHEJ yeterliliğinin değerlendirilmesi, POLQ nakavtının raportör substratının onarımını engellemediğini göstermektedir (Şekil 4D-F). Birlikte, bu genetik veriler MMEJ aracılı onarımda Polθ'nin spesifik rolünü desteklemektedir. Bu gözlemler, Polθ'nun polimeraz alanının yakın zamanda bildirilen oldukça güçlü ve spesifik bir inhibitörü olan ART55812,13 ile farmakolojik olarak tamamen özetlenmiştir (Şekil 4G), burada MMEJ'nin titre edilebilir inhibisyonu gözlenir, bu da Ateşböceği sinyalinde değil NanoLuc'ta belirli bir azalmadan kaynaklanır (Şekil 4H). Ayrıca, genetik verilerle uyumlu olarak, NHEJ üzerinde herhangi bir etkisi yoktur (Şekil 4I, J). Bu veriler birlikte, bu raportörlerin DSBR yolaklarının genetik modülasyonunu karakterize etmek ve küçük moleküllerin hücresel gücünü ve hedef/yol özgüllüğünü göstermek için nasıl kullanılabileceğini vurgulamaktadır.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig04.jpg"> Şekil 4: Polθ'nun genetik nakavt ve farmakolojik inhibisyonunun MMEJ ve NHEJ raportör sinyalleri üzerindeki etkileri. eHAP1, WT ve POLQ(-) hücreleri, Firefly kontrol plazmidi ve (A-C) rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportörü veya (D-F) künt uçlu NHEJ raportörü ile transfekte edildi. MMEJ veya NHEJ onarımının yüzdesi, transfeksiyondan 24 saat sonra DMSO ile muamele edilen kontrole normalize edilmiş, Ateşböceği lüminesansı üzerindeki NanoLuc lüminesansının oranıdır. Veriler, her biri ortalama 8 teknik kopya olan üç biyolojik kopyanın ortalama ± SEM'ini temsil eder. HEK-293 hücreleri, bir Ateşböceği kontrol plazmidi ve (G, H) rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportörü veya (I, J) künt uçlu NHEJ raportörü ile transfekte edildi ve Polθ polimeraz inhibitörü ART558 ile tedavi edildi. Onarım yüzdesi, transfeksiyondan 24 saat sonra, DMSO ile muamele edilen kontrole normalize edilmiş, Ateşböceği lüminesansı üzerindeki NanoLuc lüminesansının oranıdır. (G) ve (I)'deki bireysel lüminesans sinyallerinin yüzde inhibisyonu, DMSO ile muamele edilen kontrole göre hesaplandı ve sırasıyla (H) ve (J)'de gösterildi. Veriler, her biri ortalama 4 teknik kopya olan 2 biyolojik kopyanın ortalama ± SEM'ini temsil eder. Bu şekil Rajendra ve ark.7'den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: NanoLuc = Nanolusiferaz; MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; WT = vahşi tür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig05.jpg"> Şekil 5: RAD51 inhibitörü CAM833 tarafından HR raportör sinyalinin inhibisyonu. (A) HEK-293 hücreleri, bir Firefly lusiferaz kontrol plazmidi olan uzun şablon HR raportör substratı ile transfekte edildi ve RAD51 inhibitörü CAM83314 ile muamele edildi. NanoLuc ve Ateşböceği lüminesansı, transfeksiyondan 16 saat sonra okundu. HR onarımının yüzdesi, DMSO ile muamele edilen kontrole normalize edilmiş, NanoLuc lüminesansının Firefly lüminesansı üzerindeki oranıdır. Kesikli çizgiler, EC 50 eğrisinde HR inhibisyonu yüzdesini veCAM833 konsantrasyonunu vurgular. Veriler, her biri ortalama 4 teknik kopya olan 2 biyolojik kopyanın ortalama ± SEM'ini temsil eder. (B) (A)'daki bireysel lüminesans sinyallerinin yüzde inhibisyonu, DMSO ile muamele edilen kontrole göre hesaplanmıştır. Kesikli çizgiler, 3,33 μM CAM833'te (EC50) NanoLuc ve Firefly inhibisyon yüzdesini vurgular. CAM833 konsantrasyonlarında 10 μM'≥ Firefly sinyalindeki azalma, yüksek dozlarda bileşik toksisitenin göstergesidir; bununla birlikte, Firefly sinyalinin etkilenmediği konsantrasyonlarda NanoLuc sinyalinde azalma gözlenir, bu da CAM833'ün hedef HR inhibisyonunu indüklediğini düşündürür. Bu şekil Rajendra ve ark.7'den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: NanoLuc = Nanolusiferaz; HR = homolog rekombinasyon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Muhabir alt tabakası</td>
			<td>Kaynak plazmit (kb cinsinden boyut, direnç)</td>
			<td colspan="3">DSB üretimi</td>
			<td>Son raporlayıcı alt tabakasının beklenen boyutu (kb)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Rezeksiyondan bağımsız MMEJ</td>
			<td>4.0, Kan</td>
			<td colspan="3">Kapakların ligasyonu ile 3' kuyrukları rezeke edildi</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Rezeksiyona bağımlı MMEJ</td>
			<td>6.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (uyumlu olmayan), HindIII (uyumlu)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Künt NHEJ</td>
			<td>4.3, Kan</td>
			<td colspan="3">EcoRV ile plazmidden eksizyon üzerine künt uçlar</td>
			<td>1.7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Künt olmayan NHEJ</td>
			<td>6.7, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (uyumlu olmayan), HindIII (uyumlu)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Uzun şablon HR</td>
			<td>9.2, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (uyumlu olmayan), HindIII (uyumlu)</td>
			<td>9.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Kısa şablon İK</td>
			<td>9.3, Amplifikatör</td>
			<td colspan="3">I-SceI (birleştirici)</td>
			<td>9.3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SSA</td>
			<td>9.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (uyumlu olmayan), HindIII (uyumlu)</td>
			<td>9.5</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Raportör substrat plazmitleri. Kısaltmalar: DSB = çift iplikçik kopması; MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; HR = homolog rekombinasyon; SSA = tek iplikli tavlama; Kan = kanamisin; Amp = ampisilin.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Sıra (5'-3')</td>
			<td>Tedarikçi</td>
			<td>Arıtma</td>
			<td>Fonksiyon</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Fos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAYFA</td>
			<td>Sol kapak, uzun oligonükleotid</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Fos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAYFA</td>
			<td>Sol kapak, kısa oligonükleotid</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATÇA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAYFA</td>
			<td>Sağ kapak, uzun oligonükleotid</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Fos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAYFA</td>
			<td>Sağ kapak, kısa oligonükleotid</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportör substratının oluşturulması için kapaklar için oligonükleotidler. Kısaltmalar: ssDNA = tek sarmallı DNA; dsDNA = çift sarmallı DNA; MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; SAYFA = poliakrilamid jel elektroforezi. Mikrohomolojilerin altı çizilmiştir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Muhabir tahlili</td>
			<td>NanoLuc raportör substrat DNA'sı (μg DNA/1x106 hücreli)</td>
			<td>Ateşböceği kontrolü lusiferaz plazmidi (μg DNA/1x106 hücre)</td>
		</tr><tr><td>Rezeksiyondan bağımsız MMEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Rezeksiyona bağımlı MMEJ</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Künt NHEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Künt olmayan NHEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Uzun şablon HR</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Kısa şablon İK</td>
			<td>2</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>SSA</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: NanoLuc raportör substratlarının ve Firefly kontrol lusiferaz plazmidinin (HEK-293, 96 oyuklu plaka formatı) geçici transfeksiyonu için DNA miktarları. Kısaltmalar: MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; HR = homolog rekombinasyon; SSA = tek iplikli tavlama.

Bir dizi lüminesans tabanlı ekstrakromozomal raportör substrat kullanarak hücrelerde çift iplikli kopma onarım yolu yeterliliğinin değerlendirilmesi için protokoller sunuyoruz.

Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is ...

assessment-dna-double-strand-break-repair-activity-using-high

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

Biz DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Tahlil kinetik analiz mükellef DNA Onarım faaliyet oranları verir ve doku ve tümör lizatları veya saflaştırılmış proteinler ile DNA tamir aktivitesinin ölçümü için uyarlanabilir.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Bu iletişim kuralı plazmid DNA üzerinde tanımlanmış DNA-protein Glossar tamiri ölçmek için hedeftir. Lesioned plazmid alıcı memeli hücre satırları ve düşük molekül ağırlığı birden çok kez puan sonrası transfection hasat içine transfected. DNA onarım Kinetik sayısal qPCR tarafından takip strand özgü astar uzantısı kullanma.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Bu protokol, dna çift iplik kopmalarında transkripsiyonu tek molekül hassasiyetiyle tespit etmek için yeni bir muhabir gen sistemi ve deneysel kurulum sunar.

DNA Çift Telli Molalarda Transkripsiyonal Aktivitenin Canlı Hücre Görüntülemesi

İmünokompetan farelerde böbrek hücreli karsinom ortotopik bir model uygulanması Araştırmacı aynı hayvanda bir primer böbrek tümörü, akciğer metastazların varlığı ile tanımlanan bir klinik açıdan ilgili bir sistem elde edilir. Bu sistem, klinik öncesi, in vivo olarak tedaviler çeşitli test etmek için de kullanılabilir.

Preklinik Tedaviler Nicel ve Boyuna Değerlendirme A sinjeneik Fare Modeli Yapmış Bir Renal Hücreli Karsinom

Bu el yazması bir iletişim kuralı tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu DNA çift iplikli kırılmalara analiz için sağlar.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

Hastalık göstergeler çok çeşitli, daha fizyolojik ilgili modelleri gelişmiş ve içine uygulanan ilaç bulma programları davranıyorsun. Burada açıklanan yeni modeli sistemi pulcuklarının kültürlü ve yeni Onkoloji uyuşturucu aramak için bir yüksek üretilen iş 1536-şey plaka tabanlı sistem festivalde nasıl üç boyutlu tümör göstermektedir.

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Burada, antikanser coumarins 3D kültür ve zebra balığı kullanarak preklinik tarama mevcut.

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

Öğrenin, lüminesans tabanlı raportör testleriyle DNA çift iplikli kırılma onarım aktivitesini hücrelerde kantitatif olarak değerlendirin. Bu yüksek verimli yöntem, kanser ilaç keşfi ve DNA hasar yanıtı biyolojisini anlamak için değerlidir.

Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet