Name: Kimerik Antijen Reseptörü T Hücrelerinde İn Vitro Genom Çapında CRISPR Nakavt Taraması Gerçekleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Keşfedin kimerik antijen respetörü T hücrelerinde genom çapında CRISPR nakavt taraması yöntemini. Bu protokol, direnç mekanizmalarını anlamak ve CAR T hücre tedavisi yanıtlarını iyileştirmek için sağlam bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Daha da önemlisi, aşağıda özetlenen protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB 18-005745) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC HIP00000252.43) yönergelerini takip eder ve bunlardan onay almıştır. Lentiviral üretim de dahil olmak üzere tüm hücre kültürü çalışmaları, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip bir hücre kültürü başlığında gerçekleştirilmelidir. Özellikle, lentiviral çalışma, bertaraf edilmeden önce öğeleri dezenfekte etmek için %2 çamaşır suyu kullanımı da dahil olmak üzere biyogüvenlik seviye 2 (BSL-10) önlemleri altında yapılmalıdır.
1. CRISPR Kütüphanesinin Güçlendirilmesi
<ol>
	<li>CRISPR kitaplığını üreticinin tavsiyelerine göre yükseltin. Kısaca, aşağıdakileri tamamlayarak CRISPR kütüphanesini dört elektroyetkin hücre alikotuna elektrostatik hale getirin:<ol>
		<li>1.0 mm'lik bir küvette 25 μL elektroyetkin hücreye 2 μL 50 ng/μL CRISPR kütüphane plazmidi ekleyin.</li>
		<li>Aşağıdaki ayarları kullanarak numuneleri elektrostatik hale getirin: 10 μF, 600 Ohm, 1.800 volt ve 3,5 ms ile 4,5 ms arasında bir zaman sabiti.</li>
		<li>975 μL geri kazanım ortamında geri kazanın ve ek 1 mL geri kazanım ortamı içeren bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Tüm alikotları 250 °C'de 1 saat boyunca 37 RPM'de döndürün.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dönüşümleri plakalayın:<ol>
		<li>Elektroporasyonlu hücrelerin tüm alikotlarını bir araya getirin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>400 μL dönüşüm karışımını 100 μg / mL karbenisilin ile önceden ısıtılmış 10 cm Luria suyu (LB) plakalarına yayarak tüm elektroporasyonlu hücreleri plakalayın. Plakayı 14 saat boyunca 32 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolonileri hasat edin:<ol>
		<li>Her plakaya 1 mL LB ortamı + 100 μg/mL karbenisilin pipetleyin. Kolonileri her plakadan kazıyın ve 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın.</li>
		<li>Yıkamak ve tam iyileşme sağlamak için her plakaya 1 mL LB ortamı + 100 μg/mL karbenisilin daha ekleyin.</li>
		<li>Bir maksi hazırlık kitinin talimatlarını izleyerek bir maksi hazırlık yapın.</li>
		<li>Elde edilen plazmit DNA'sını bir araya getirin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. CRISPR kütüphanesinde temel gRNA temsilini doğrulamak için yeni nesil dizileme
NOT: Bu CRISPR kütüphanesi için NGS primerleri, önceki bir yayındatasarlanmıştır 27. Her numune için farklı bir ters astar kullanmak, her numuneyi barkodlayacak ve sıralama sırasında numunelerin havuzlanmasına izin verecektir.
<ol>
	<li>Numuneleri aşağıdaki reaksiyon karışımıyla PCR için hazırlayın (toplam hacim = 50 μL): yüksek kaliteli PCR ana karışımı, 2x: 25 μL; havuzlanmış şablon DNA, 0.5 μg: 1 μL; NGS kütüphanesi ileri astar, 10 μM: 1.25 μL; NGS kütüphanesi ters astar, 10 μM: 1.25 μL; DNaz içermeyen su: 21,5 μL.</li>
	<li>Aşağıdaki döngü koşullarıyla PCR gerçekleştirin: döngü 1: 98 °C'de 3 dakika denatüre; döngü 2-23: 98 °C'de 10 saniye denatüre etme, 63 °C'de 10 saniye tavlama, 72 °C'de 25 saniye uzatma; döngü 24: 72 °C'de 2 dakika uzatın.</li>
	<li>Her numune için PCR reaksiyonlarını bir araya getirerek ve PCR ürününü üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırarak PCR reaksiyonunu saflaştırın.</li>
	<li>%2 (a/h) agaroz jel üzerinde her numune için 3 μg PCR ürünü çalıştırın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı jelden çıkararak PCR ürününü (~ 260-270 bp) jelden çıkarın. En az 500 ng DNA hedefleyin.</li>
	<li>Ekstrakte edilen numuneleri -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Örneklerle yeni nesil dizileme (NGS) gerçekleştirin ve gRNA27 başına 100 okuma hedefleyin.</li>
	<li></li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li> <ol><li><li><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li></li><li></ol></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li><li><ol><li><li><li> </li><li><li></li><li></li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li><li></li></ol></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li><li><li><li></li><li><li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67338/67338eq01.jpg" style="margin: auto;"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67338/67338eq02.jpg" style="margin: auto;"></li></ol><ol><li><ol><li><ol><li><li> </li><li></li><li></ol></li><li> </li><li><ol><li><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol></li><li> </li><li> </li><li></li><li></li></ol><ol><li><ol><li></li><li><li><ol><li></li><li><li></li><li> </li></ol></li></ol></li><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></li></ol></li><li></li><li><ol><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><li><ol><li><li><li></li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li><li><li></li><li></ol></li></ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Tedavi direncini araştırmak için CART hücrelerinde genom çapında CRISPR ekranları

<ol><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-year+follow-up+supports+curative+potential+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1).</a> Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+ciloleucel+CAR+T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Locke, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+activity+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%3A+A+single-arm%2C+multicentre%2C+phase+1-2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial.</a> Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+adult+relapsed+or+refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).</li>
<li>Bai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antigen-specific+landscape+of+CAR+T+infusion+product+identifies+determinants+of+CD19-positive+relapse+in+patients+with+all%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all.</a> Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nat Med. 24, 563-571 (2018).</li>
<li>Gennert, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulatory+landscape+of+human+CAR+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+anti-CD19+CAR+T+cell+infusion+products+associated+with+efficacy+and+toxicity+in+patients+with+large+B+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas.</a> Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).</li>
<li>Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+CRISPR%2FCAS9+to+knock+out+GM-CSF+in+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells.</a> J Vis Exp. (149), e59629(2019).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. 133 (7), 697-709 (2019).</li>
<li>Cox, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+disruption+in+CART+cells+modulates+T+cell+activation+and+enhances+CART+cell+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity.</a> Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).</li>
<li>Ottaviano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+trial+of+CRISPR-engineered+CAR19+universal+T+cells+for+treatment+of+children+with+refractory+B+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia.</a> Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).</li>
<li>Mccutcheon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+regulators+of+human+CD8%2B+T+cell+function+identified+through+orthogonal+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens.</a> Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).</li>
<li>Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+activation+screen+to+optimize+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype.</a> Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+of+CAR+T+cells+and+cancer+stem+cells+reveals+critical+dependencies+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies.</a> Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).</li>
<li>Shifrut, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+in+primary+human+T+cells+reveal+key+regulators+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function.</a> Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).</li>
<li>Belk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+crispr+screens+of+T+cell+exhaustion+identify+chromatin+remodeling+factors+that+limit+T+cell+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence.</a> Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).</li>
<li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC-seq+maps+the+comprehensive+and+dynamic+chromatin+accessibility+landscape+of+CAR-T+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction.</a> Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
<li>Beider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+signatures+associated+with+CAR+T+cell+exhaustion+and+impaired+clinical+response+in+patients+with+B+cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies.</a> Cells. 11 (7), 1140(2022).</li>
<li>Wherry, E. J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">cell exhaustion.</a> Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Prinzing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+DNMT3A+in+CAR+T+cells+prevents+exhaustion+and+enhances+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity.</a> Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).</li>
<li>Lynn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-jun+overexpression+in+CAR+T+cells+induces+exhaustion+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance.</a> Nature. 576, 293-300 (2019).</li>
<li>Tang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibition+via+CRISPR+promotes+the+long-term+efficacy+of+CAR+T+cells+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors.</a> JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control%2C+modeling%2C+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biol. 16, 281(2015).</li>
<li>Sakemura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer-associated+fibroblasts+in+the+bone+marrow+prevents+resistance+to+CART-cell+therapy+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma.</a> Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).</li>
<li>Stewart, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+drives+exhaustion+of+CD8%2B+CART+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells.</a> Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).</li>
<li>FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. 
 <a target="_blank" href=" https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/"> https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bbmerge. , 
 <a target="_blank" href=" https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh"> https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh</a> (2019).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+CAS9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-CAS9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Dong, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immunotherapy+target+discovery+using+genome-scale+in+vivo+CRISPR+screens+in+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells.</a> Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CRISPR+screens+in+vivo+map+T+cell+fate+regulomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer.</a> Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).</li>
<li>Sutra Del Galy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+CRISPR+screens+identify+SOCS1+as+intrinsic+checkpoint+of+CD4%2B+TH1+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response.</a> Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).</li>
<li>Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-intrinsic+determinants+of+CAR-T+response+revealed+by+iterative+in+vivo+genome-wide+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening.</a> Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Lentivirüs üretimi için kullanılan hücreler</td></tr><tr><td>Biotin ProteinL Antikoru</td><td>GenScript</td><td>M00097</td><td>CAR tespiti için anti-kappa zincir antikoru</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin disodyum tuzu</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1389-1G</td><td>Karbenisilin antibiyotik</td></tr><tr><td>CD4 İzolasyonu Boncuk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD8 İzolasyon Boncukları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Hücre Tedavi Sistemleri) Dynabeads CD3 / CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td>NC2279958</td><td></td></tr><tr><td>DNaz İçermeyen Su</td><td>İnvitrojeni</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)</td> <td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep İnsan T Hücresi İzolasyon Kiti</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>17951RF</td><td>Negatif izolasyon kiti</td></tr><tr><td>Endura Elektroyetkin Hücreler&nbsp;</td><td>Biyoaraştırma Teknolojileri</td><td>60242-1</td><td>Geri kazanım ortamlı elektroyetkin hücreler</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>GeCKO v2 CRISPR Nakavt Havuzlanmış Kitaplık A</td><td>AddGene</td><td>1000000048</td><td>CRISPR kütüphanesi plazmid</td></tr><tr><td>Gen Pulser II&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105</td><td>Elektroporatör</td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Milipore Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>CD19+ hedef hücreler&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000075</td><td>Bir transfeksiyon reaktifi (Lipofectamine 3000 Reaktifi) ve bir nötr ko-lipid reaktifi (p3000) içeren transfeksiyon reaktif kitiCANLI</td></tr><tr><td>/ÖLÜ Aqua</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lenforep</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>7851</td><td>Yoğunluk gradyan ortamı</td></tr><tr><td>Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi Kitleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12748412</td><td>Maxi-hazırlık kiti</td></tr><tr><td>NEBNext Yüksek Kaliteli 2X PCR MasterMix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541S</td><td>Yüksek kaliteli PCR mastermix</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>İndirgenmiş serum ortamı</td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>AddGene</td><td>22036</td><td>Lentiviral ambalaj plazmidi</td></tr><tr><td>Pennisilin-streptomisin-glutamin (100X)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>AddGene</td><td>12259</td><td>VSV-G plazmid eksprese eden</td></tr> zarf <tr><td>Havuzlanmış İnsan AB Serumu&nbsp;</td><td>Yenilikçi Araştırma</td><td>ISERABHI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Gek ekstraksiyon kiti</td></tr><tr><td>Qucik-DNA Midiprep Plus Kiti</td><td>gDNA'yı izole etmek için kullanılan</td><td>Zymo Research</td><td>D4075</td> Kiti</tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Otomatik hücre ayırıcı</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 Orta (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>85450</td><td>Yoğunluk gradyan ayırma tüpü</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>71448-16</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Antikoru (PE)</td><td>BioLegend</td><td>405203</td><td>İkincil antikor CAR tespiti için kullanılan</td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj (Optima XPN-80)</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Filtre Sistemleri, 0.22 ve mikro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Filtre Sistemleri, 0.45 & m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165-0045</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre Ortamı</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Hematopoetik hücre ortamı</td></tr></tbody></table>

kimerik antijen reseptörü t hücrelerinde İn vitro genom Çapında crispr nakavt taraması gerçekleştirme

Performing an In Vitro Genome-Wide CRISPR Knockout Screen in Chimeric Antigen Receptor T Cells

CART hücre aktivitesini tarafsız bir şekilde iyileştirmek için düzenlenebilen genleri ve yolları sorgulamak için, in vitro genom çapında bir CRISPR nakavt ekranı tasarladık (Şekil 1). Bu ekranın iki aşaması vardır: bir CART hücresi üretim aşaması ve seçici bir basınç aşaması. CART hücre üretim aşamasında, en az 110 × 106 T hücresi önce sağlıklı donör PBMC'lerden izole edilir ve CD3 + / CD28 + boncukları ile aktive edilir. Ertesi gün, 1. günde...

Kimerik Antijen Reseptörü T Hücrelerinde İn Vitro Genom Çapında CRISPR Nakavt Taraması Gerçekleştirme

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy is an innovative form of targeted immunotherapy that has revolutionized the treatment of cancer. However, ...

performing-an-vitro-genome-wide-crispr-knockout-screen-chimeric

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin ex vivo üretilmesi için kullanılan bir teknik gösterilmektedir. İnsan T hücreleri, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile kaplanmış manyetik boncuklar ve interlökin-2 (IL-2) ile takviye edilmiş bir ortam ile inkübe edilir ve bu da T hücresi aktivasyonuna ve çoğalmasına yol açar. Transgenik RNA'nın konakçı genomuna entegre olmasına ve transgeni eksprese etmesine izin veren transgenik lentiviral vektörler tanıtılır. Bu, transdüksiyona...

Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Üretmek için Ex Vivo Bir Teknik

Bu videoda, tümör antijenine özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin ex vivo üretimi için bir teknik gösterilmektedir. Transgenik RNA taşıyan retroviral vektörler, T hücresi sağkalımını ve proliferasyonunu teşvik etmek için interlökin-2 ile takviye edilmiş bir ortamda dalak hücreleri ile karıştırılır. Karışım daha sonra rekombinant insan fibronektin fragmanları ile kaplanmış bir plakaya aktarılır ve virüsün hücre ile füzyonunu kolaylaştırmak için santrifüjlenir, bu da RNA'nın...

Tümöre özgü kimerik antijen reseptör T hücreleri oluşturmak için bir ex vivo teknik

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Burada, CAR-T hücrelerini değiştirmek için CRISPR Cas Teknolojisini kullanarak birincil insan T hücrelerinde gen düzenleme protokolü sunuyoruz.

İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Birincil CAR T hücreleri için optimize edilmiş bir CRISPR-Cas9 knockout tarama protokolü geliştirdik. Enzimatik sindirim ve sgRNA kaseti çekilmesiyle gDNA taşınmasını azaltarak, bu yaklaşım PCR artefaktlarını en aza indirerek doğru sgRNA tespitini ve fonksiyonel gen hedeflerinin sağlam tanımlanmasını sağlar.

CAR T Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Ekranlarının İyileştirmesi: Kütüphane Hazırlığı için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Keşfedin kimerik antijen respetörü T hücrelerinde genom çapında CRISPR nakavt taraması yöntemini. Bu protokol, direnç mekanizmalarını anlamak ve CAR T hücre tedavisi yanıtlarını iyileştirmek için sağlam bir çerçeve sunar.

Kimerik Antijen Reseptörü T Hücrelerinde İn Vitro Genom Çapında CRISPR Nakavt Taraması Gerçekleştirme

Daha fazla video keşfet