Kimerik Antijen Reseptörü T Hücrelerinde İn Vitro Genom Çapında CRISPR Nakavt Taraması Gerçekleştirme

Car T hücre tedavisi, on yıldan fazla süren remisyonlara yol açan yenilikçi bir kanser immünoterapisi türüdür. Bununla birlikte, kalıcı yanıtların oranları hala sınırlıdır. Bu protokolle, direncin arkasındaki mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirmeyi ve CAR T hücre tedavisine yanıtı iyileştirmek için araçlar oluşturmayı amaçlıyoruz.

Şu anda CAR T hücre tedavisini iyileştirmek için kombinasyon tedavileri ve CAR tasarımının optimizasyonu dahil olmak üzere birçok yaklaşım kullanılmaktadır. Bununla birlikte, infüzyon öncesi CAR T-hücresi ürünlerinin epigenetik profilinin önemli bir belirleyici yanıt olduğuna dair artan kanıtlar nedeniyle, genetik düzenleme teknolojileri popüler araçlar haline gelmiştir.

CAR T hücrelerinin genomik düzenlemesi, preklinik ve klinik çalışmalarda toksisiteleri önlemede ve CAR T hücrelerinin genişlemesini ve kalıcılığını artırmada başarı göstermiştir. Genom çapında bir CRISPR nakavt ekranı protokolümüz, CAR T hücresi işlevini iyileştirmek için en iyi genetik düzenlemeleri belirlemek için verimli ve tarafsız bir yaklaşım sağlar.

Genom çapında gen bozulmalarının etkili olabilmesi için büyük ölçekli ve yeterli seçim koşulları gerekir. CAR T hücresi tükenmesinin gelişimini incelemek için, en uygun gen düzenlemelerini seçmek için iki hafta boyunca 80 milyondan fazla CAR T hücresini uyarmamız gerektiğini öğrendik.

Protokolümüz tükenme gelişimini değerlendirmek için tasarlanmış olsa da, bu protokol diğer direnç mekanizmalarının gelişimini değerlendirmek için ayarlanabilir. Farklı ortamlarda genom çapında ekranları tamamlayarak, sonunda CAR T hücre tedavisine genel yanıtları iyileştirmek için en iyi düzenlemeleri belirleyebiliriz.

[Ekran Okuyucusu] CAR T hücrelerini CRISPR kütüphanesi ile dönüştürdükten sonra, numuneleri yıkamak için 300 santigrat derecede beş dakika boyunca 4 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve numuneleri 20 mililitre T hücresi ortamında yeniden süspanse edin. Yeni nesil dizileme için numuneleri korumak için, kılavuz RNA başına 500 hücrelik bir kılavuz RNA temsilini sürdürmek için yeterli sayıda CAR T hücresini 50 mililitrelik konik bir tüpe ayırın. Numuneyi 300 g'da 4 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra hücre peletini bir mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 50 mililitrelik konik tüpü bir mililitre PBS ile yıkayın ve yıkamayı aynı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra numuneleri 500 g'da 4 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletlerini -20 santigrat derecede saklayın. Ko-kültürü başlatmak için, CD19 pozitif JeKo-1 hücrelerine bire bir oranında CAR T hücreleri ekleyin. Ko-kültürün toplam hacmini T hücre ortamı ile 160 mililitreye getirin ve numuneleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatörde saklayın. CAR T hücrelerini yeniden uyarmak için, ko-kültürleri 50 mililitrelik konik tüplere toplayın ve numuneleri 300 g'da 4 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Her numuneyi 80 mililitre T hücresi ortamında yeniden süspanse edin ve 80 mililitre T hücresi ortamındaki altı JeKo-1 hücresinin gücüne 80 kez 10 ekleyin. Numuneleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatörde saklayın. 15. günde, CAR T hücrelerini ko-kültürden izole etmek için önce hücreleri sayın. T hücrelerini CAR T JeKo-1 ko-kültürlerinden izole etmek için CD4 pozitif T hücreleri için pozitif bir seçim kitini CD8 pozitif T hücreleri için pozitif bir seçim kiti ile birleştirin. Sonra izole edilmiş T hücrelerini sayın. Numuneleri yeni nesil dizileme için korumak için, altı CAR T hücresinin gücünde 33 kez 10'u 50 mililitrelik konik bir tüpe alikotlayın ve numuneyi 300 g'da 4 santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra 50 mililitrelik konik tüpü bir mililitre PBS ile yıkayın ve yıkamayı aynı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numuneleri santrifüjledikten ve süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletlerini -20 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, bir genomik DNA izolasyon kiti kullanarak donmuş CAR T hücresi peletlerinden genomik DNA'yı izole edin. İzole edilmiş genomik DNA'yı, önce %100 etanolü -20 santigrat dereceye kadar önceden soğutarak etanol çökeltme yoluyla saflaştırın. Ayrıştırılan DNA'yı birkaç mikrosantrifüj tüpüne eşit olarak ayırın ve her bir alikotun 200 ila 250 mikrolitre olduğundan emin olun. İki hacim önceden soğutulmuş %100 etanol, 0.1 hacim üç molar sodyum asetat ve mililitre glikojen başına bir mikrolitre 20 miligram ekleyin. Numuneleri gece boyunca -20 santigrat derecede inkübe edin. İkinci gün, çökeltilmiş DNA'yı peletlemek için numuneleri 13.000 g'da 20 dakika döndürün. Süpernatanı çıkarın ve peletleri 7.500 g'da 10 dakika döndürerek bir mililitre% 70 etanol ile yıkayın. Peletleri tamamen kuruttuktan sonra, peletleri 50 mikrolitre steril suda tekrar süspanse edin. Genomik DNA'yı yeni nesil dizileme için hazırlamak için, burada gösterilen belirtilen reaksiyon karışımı ile bir PCR ayarlayın. Ardından aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak PCR'yi gerçekleştirin. Her numune için PCR reaksiyonlarını çekin ve PCR ürününü üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. %2'lik bir agaroz jel üzerinde her numune için üç mikrogram PCR ürünü çalıştırın. Üreticinin talimatlarına göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı çıkararak PCR ürününü jelden çıkarın. Ekstrakte edilen numuneleri -20 santigrat derecede saklayın.