Floresan ve Radyoaktif İzleyicilerle Mikro Kabarcıkların Üretilmesi ve Etiketlenmesi

Mikro kabarcıklar, benzersiz kanser görüntüleme ve tedavi yeteneklerine sahip gazla doldurulmuş ultrasona duyarlı parçacıklardır. Gelişen yardımcı programları, uygulama odaklı izlenebilir mikro kabarcıklar oluşturularak stratejik olarak geliştirilebilir. Etiketlenmemiş, radyoetiketli, floresan ve multimodal mikro kabarcıkların özelleştirilebilir şekilde üretilmesine izin veren bir lipid mikro kabarcık üretim protokolü geliştirerek bu hedefi kolaylaştırmayı amaçlıyoruz.

Verimli ve kararlı mikro kabarcıklı radyo etiketleme elde etmek önemsiz olmayan bir zorluktur. Lipid mikro kabarcıklar kırılgandır ve bu nedenle bunları imalat sonrası radyo etiketleme yaklaşımlarında ısı, zaman ve saflaştırma adımlarına maruz bırakmak fiziksel, kimyasal özelliklerini ve stabilitelerini bozabilir. Öte yandan, prefabrikasyon radyo etiketleme, özel ekipman ve artan radyasyona maruz kalma gerektirir.

Radyoizotop şelasyonunun mikro kabarcık aktivasyonundan önce, ancak lipid süspansiyon oluşumundan sonra meydana geldiği yeni bir hibrit protokol geliştirerek bu zorlukların üstesinden geliyoruz. Bu tek hazneli yaklaşım, partikülün fiziksel kimyasal özelliklerini koruyan yüksek verimli, saflaştırma gerektirmeyen mikro kabarcıklı radyo etiketlemeyi ilk kez kolaylaştırıyor. Önemli bir ek avantaj, protokollerin çok yönlülüğüdür. Öğütülmüş özel mikro kabarcık imalatı sırasında dahil edilebilir ve ticari olarak mevcut olanlar gibi önceden oluşturulmuş mikro kabarcık lipid süspansiyonlarına uyarlanabilir. Çeşitli mikro kabarcık lipid ve şelatör bileşimlerinde başarılı bir şekilde uygulanabilir ve buna göre özel radyoaktif, floresan veya trimodal mikro kabarcıklar üretebilir.

Bu özellikler birlikte, mekanik içgörüleri ilerletebilen ve mikro kabarcık farmakokinetik çalışma, multimodal görüntüleme, tedavi planlaması ve sinerjik tedavilerin etkinleştirilmesi dahil olmak üzere birçok alanda mikro kabarcık odaklı ultrason tedavilerinin ilerlemesini destekleyebilen mikro kabarcık lipid kabuklarının çok modlu temsili izlenmesini sağlar.

[Ekran Okuyucusu] Bir mikro pipet kullanmaya başlamak için, kabarcık oluşumunu önleyerek bir şişede tercih edilen mikro kabarcık lipid filminin kenarları boyunca bir mililitre AA-PGG çözeltisi ekleyin. Perfloropentan veya PFP hattını yerleştirmek için yeterli boşluk bırakarak flakon açıklığını kapakla kısmen kapatın. PFP'yi sıvının üzerinde 20 saniye boyunca şişenin üst boşluğuna akıtın ve şişeyi kapatın. Şişenin alt yarısını bir dakika boyunca 70 ila 80 santigrat derece su banyosuna daldırın. Daha sonra şişeyi 69 santigrat derece banyo sonikatöründe 30 saniye boyunca sonikleştirin. Sonikasyondan sonra, şişeyi silin ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Şişenin üst boşluğunu PFP gazı ile doldurun. Ardından şişeyi kapatın ve kenarları Parafilm ile kapatın. Kristalleşen bir kapta 60 santigrat derecelik bir su banyosu kurmak için, tabağa manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve sıcaklık kontrollü bir sıcak karıştırma plakasına yerleştirin. Sıcaklığı izlemek için suya bir termal prob yerleştirin ve zayıf ama görünür bir huni oluşturmak için karıştırma hızını ayarlayın. Forseps kullanarak, 0.1 normal hidroklorik asit içinde bakır klorür formunda bakır 64 içeren kapalı bir şişeyi bir doz kalibratörüne aktarın. Bakır 64 aktivitesini ve saati kaydedin. Forseps kullanarak, şişeyi doz kalibratöründen çıkarın ve kurşunlu bir kaba koyun. Mililitre başına megabekerel cinsinden değeri hesaplamak için, doz kalibratöründe belirtilen aktiviteyi bakır 64 hacmine bölün. Lipid süspansiyonunun kapağını açın ve bir şişe tutucusuna sabitleyin. Ardından, şişeyi forseps ile tutarak bakır 64 şişenin kapağını açın. Bir mikropipet kullanarak, 40 ila 250 megabekerel aktiviteye karşılık gelen bir hacimde bakır 64 çözeltisini lipit süspansiyonuna aktarın. Düz kauçuk uçlu forseps kullanarak, bakır 64'ü süspansiyona karıştırmak için radyoaktif lipid süspansiyonunu en az beş kez yukarı ve aşağı döndürün. Flakon sağ tarafı yukarı bakarken, flakonu stabilize ederken kapağı hafifçe vurun. Dikkatlice, şişenin kapağını kısmen açın ve iğne donanımlı bir PFP hattı yerleştirin. Flakon üst boşluğunu 20 saniye boyunca PFP ile doldurun. Daha sonra şişeyi parafilm ile kapatın ve kapatın. Bir doz kalibratörü kullanarak flakon aktivitesini ölçün ve zamanı kaydedin. Daha sonra, şişeyi bir köpük şişe tutucusuna yerleştirin, böylece şişenin alt yarısı ısıya maruz kalır. Tutucuyu 60 santigrat derece karıştırma su banyosuna daldırın ve bir saat ısıtın. Bu arada, iTLC şeritlerini hazırlamak için cam mikrofiber kromatografi kağıdını şeritler halinde kesin. Şeritleri etkinleştirmek için 80 santigrat derecelik bir cam kurutma fırınında ısıtın. Bir saat sonra, şişeyi su banyosundan çıkarın ve kenarlarını kağıt mendille silin. Lastik uçlu forseps kullanarak şişeyi yukarı ve aşağı döndürün. Flakon dik konumdayken, flakonu stabilize ederken kapağı hafifçe vurun. Parafilmi çıkarın ve sıkışan suyu çıkarmak için kapağın etrafını silin. Aktive edilmiş bir iTLC şeridinin alt merkezinden bir santimetre uzakta bir ila iki mikrolitre lipit süspansiyonu tespit edin. Lekenin kurumasını bekleyin. Bir mikropipet kullanarak, 10 mililitrelik bir test tüpünün dibine 200 mikrolitre iTLC eluent ekleyin. Tüpü kurşun bir kaba koyun. Benekli iTLC şeridini tüpe ekleyin ve eluent şeridin tepesinden yaklaşık bir santimetreye ulaşana kadar gelişmesine izin verin. Daha sonra, forseps kullanarak, geliştirilen şeridi çıkarın ve dikey olarak tutun. Şeridi gama sayacı uyumlu beş mililitrelik plastik tüpler üzerinde üçe bölün. İtme kapaklarını tüplere yerleştirin. Bakır 64 aktivitesini tespit etmek için bir gama sayacı kullanarak tüpler ve boş bir kontrol tüpü içeren şeridi ölçün. Dakikadaki sayımları kaydedin ve arka plan radyasyonunu düzeltmek için kontrol tüpü aktivitesini diğer okumalardan çıkarın. Ardından, dakika başına düzeltilmiş sayımlara göre radyo kimyasal saflığını hesaplayın. Ardından, radyo etiketli lipid süspansiyon şişesinin kapağını açın ve süspansiyona 8.89 mikrolitre normal sodyum hidroksit ekleyin. Şişeyi kapattıktan ve döndürdükten sonra, kapak boşluğunda sıkışan süspansiyonu çıkarmak için şişeye hafifçe vurun ve kafa boşluğunu PFP gazı ile doldurun. Şişeyi mekanik bir çalkalayıcıya yerleştirin ve sütlü bir mikro kabarcık süspansiyonu oluşturmak için 4.530 RPM'de 45 saniye boyunca etkinleştirin. Oda sıcaklığına pasif olarak soğutulduktan sonra, mikro kabarcık süspansiyonunu yeniden askıya almak için şişeyi nazikçe ters çevirin. Şişeyi düz bir yüzeye koyun ve iki dakika bekleyin. Bu arada, bir mililitrelik plastik şırıngayı 18 gauge iğne ile donatın ve şırıngayı aspire ederek ve havayı içeri ve dışarı daldırarak havalandırın. İki dakika sonra, şişeyi hızlı bir şekilde açın ve şişenin altından 400 ila 550 mikrolitre süspansiyon çekin. İğnenin kenarlarını dikkatlice silin ve mikro kabarcık süspansiyonunu bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü kapattıktan sonra, son mikro kabarcık ürününün aktivitesini bir doz kalibratöründe ölçün ve zamanı not edin. Aktiviteyi mililitre başına megabekerel cinsinden elde etmek için aktivite değerini boşaltılan hacme bölün. Başlamak için, uyumlu bir mikro santrifüj tüpünde 0,5 mililitre, 30.000 moleküler ağırlıklı kesme santrifüj filtre ünitesine 10 ila 200 mikrolitre mikro kabarcık süspansiyonu ekleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin. Ardından, mikro santrifüj tüpü ile kapağı arasındaki bağlantıyı kesmek için makas kullanın. Kapağı CAPS etiketli 20 mililitrelik bir parıldama şişesine yerleştirin. Filtre ünitesini TUBE 2 etiketli yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. İnfranatant içeren ilk mikro santrifüj tüpünü TUBE 1 etiketli 20 mililitrelik bir sintilasyon şişesine yerleştirin. TÜP 2'deki filtre ünitesine 200 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin. Filtre ünitesini tekrar 12.000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Son filtre ünitesi transferinden sonra 200 mikrolitre distile suyu TÜP 3 ve santrifüjdeki filtre ünitesine ekleyiniz. Santrifüjlemeden sonra, tüpün kapağını kesin, kapak sintilasyon şişesine ekleyin ve filtre ünitesini UNIT etiketli yeni bir 20 mililitrelik sintilasyon şişesine aktarın. TÜP 3'ü 20 mililitrelik yeni bir cam parıldama şişesine yerleştirin. Beş sintilasyon şişesini kapatın ve boş bir kontrol olarak bir boş ve kapaklı sintilasyon şişesi hazırlayın. Bakır 64 aktivitesini tespit etmek için bir gama sayacındaki altı sintilasyon şişesini ölçün. Boş kontrolü diğer flakon ölçümlerinden çıkarın. Radyo etiketleme veya şelasyon verimliliğini hesaplayın.