Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu/Cas12a tabanlı bir sistem kullanılarak Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının hızlı ve spesifik tespiti

Araştırmam solunum yolu hastalıkları ve enfeksiyon üzerine odaklanıyor. Bu alanda ilerleyen güncel teknolojileri ve tüm proje alanındaki araştırma boşluklarını ele alacağım. Burada bahsettiğimiz temel teknolojiler arasında yeni nesil dizileme, CRISPR, tek hücreli RNA dizileme ve organ analiz modelleri yer alıyor. Standart kalp hastalıkları konusunda teşhis konusunda zor bir figürleri var ve daha iyi tedavi buluyorlar. Protokolüm, Acinetobacter baumannii'nin hızlı ve spesifik bir şekilde tespit edilmesi ihtiyacını ele alıyor ve zaman alıcı ve kültür tabanlı teknikler gibi güncel tanı konularındaki sınırlamaların üstesinden geliyor.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, standart tasarım ilkelerine dayalı astar tasarım araçlarını kullanarak 12 çift astar tasarlayın. 12 astar çifti oluşturmak için dört ileri astar ve üç ters astar elde edin. Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi'nden Primer-BLAST aracını kullanarak her bir primer çiftini özgüllük ve etkinlik açısından değerlendirin. Ardından, sabit dizi olarak LbaCas12a CRISPR RNA iskele dizisini kullanarak CRISPR RNA'yı veya kılavuz RNA'yı veya gRNA'yı tasarlayın. Hedefe özel bir segment dahil edin, protospacer bitişik motifinin veya PAM'ın tamamlayıcı olmayan ipliğin beş ana ucunda yer aldığından emin olun. Pozitif rekombinant plazmidin inşası için, önce ileri ve geri primer setlerini kullanarak Acinetobacter baumannii 16S rDNA segmentini amplifiye edin. 50 mikrolitrelik PCR reaksiyon karışımını ekranda verildiği gibi hazırlayın. PCR makinesinde PCR döngü koşullarını ayarlayın. Pozitif PCR ürününü saflaştırdıktan sonra, BamHI ve SalI enzimleri ile sindirilmiş bir PUC57 vektörüne klonlayın. Pozitif rekombinant plazmiti sterilize edilmiş çift damıtılmış su ile on kat artışlarla seri olarak seyreltin. Daha fazla deney için seyreltilmiş plazmidi eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, astarsız rehidrasyon tamponunu, A. baumannii'nin ileri ve geri primerlerini ve çift damıtılmış suyu 465 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar karıştırın. Karışımı RPA kitinden enzim reaksiyon tüplerine aktarmadan önce vorteksleyin ve kısaca döndürün. İyice karıştırın ve 25 mikrolitre 280 milimolar magnezyum asetat ekleyin. Daha sonra, mikrolitre başına 10⁷ kopya içeren pozitif rekombinant plazmitin bir mikrolitresini farklı primer çiftleri ile çözelti A'ya pipetleyin. Çözeltiyi 39 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Ardından, bir RPA saflaştırma kiti kullanarak güçlendirilmiş ürünleri saflaştırın. En parlak ve en geniş banda sahip astar çiftini belirlemek için saflaştırılmış ürünü 120 voltta %1'lik bir agaroz jel üzerinde 10 dakika çalıştırın. RPA amplifikasyon sistemini optimize etmek için, çözelti A'nın nihai hacmini 465 mikrolitreye ayarlarken diğer tüm reaksiyon bileşenlerinin konsantrasyonlarını sabit tutun. Daha sonra, verildiği gibi nihai primer konsantrasyonlarını elde etmek için uygun hacimlerde RNA içermeyen çift damıtılmış su ekleyin ve inkübe edin. RPA ürününü saflaştırdıktan ve elektroforezleştirdikten sonra, bant yoğunluğunu ve dağılımını analiz ederek optimum primer konsantrasyonunu ve inkübasyon süresini belirleyin. Çözelti B'yi hazırlamak için, tek sarmallı DNA muhabirini, CAST12a reaksiyon tamponunu, CRISPR RNA CAST12a'yı ve çift damıtılmış suyu 15 mikrolitrelik bir son hacme kadar karıştırın. Çözelti B'ye beş mikrolitre rekombinaz polimeraz amplifikasyonu veya RPA ürünü ekleyin. Homojen olana kadar iyice karıştırın. Numuneleri bir floresan kantitatif PCR cihazına yerleştirin. Özgüllük testi için, bir referans DNA ekstraksiyon kiti kullanarak veya bakterileri suda kaynatarak çeşitli türlerden DNA şablonları elde edin. Negatif kontrol olarak su kullanın. DNA şablonlarının 10 nanogramını veya bir mikrolitresini, ileri ve geri primerler içeren çözelti A'ya aktarın. Ardından 25 mikrolitre 280 milimolar magnezyum asetat pipetleyin. İyice karıştırın ve 39 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, reaksiyon ürününden beş mikrolitre çözelti B'ye ekleyin ve karıştırın. Numuneleri bir floresan kantitatif PCR cihazına yerleştirin. Kanalı FAM olarak ayarlayın ve floresan sinyalini her dakika 39 santigrat derecede toplam 60 dakika boyunca okuyun. RPA-CRISPR CAST12a tabanlı algılama platformunun duyarlılık değerlendirmesi için, reaksiyon şablonu olarak mikrolitre başına bir ila 10° kopya arasında değişen konsantrasyonlara seyreltilmiş pozitif bir rekombinant plazmit kullanın. Negatif kontrol olarak su kullanın. Plazmidi çözelti A'ya aktarın, magnezyum asetat ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi inkübe edin. İnkübasyondan ve çözelti B'ye aktarıldıktan sonra, floresan işaretini okuyunal. Primer çifti F3-R3, agaroz jel elektroforezi üzerinde en parlak ve en yoğun bantları gösteren, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu için en etkili olarak tanımlandı. Amplifikasyon için optimal primer konsantrasyonu 0.44 mikromolar olarak belirlendi ve optimal reaksiyon süresi 20 dakika olarak belirlendi. CRISPR RNA1'in floresan yoğunluğu zamanla artarken, CRISPR RNA2 artmadı ve A. baumannii tespiti için CRISPR RNA1'in seçilmesine yol açtı. Özgüllük analizi, A. baumannii dedektör sisteminin yalnızca A. baumannii DNA'sını tespit ettiğini ve diğer bakteriyel DNA örnekleri için floresan gözlenmediğini doğruladı. Sistem, mikrolitre DNA başına bir kopya kadar düşük bir kopya tespit edebilir ve bu da onu oldukça hassas hale getirir. Yanal akış şeridi testi, diğer bakteri türleriyle çapraz reaktivite göstermeyerek tespit yönteminin yüksek özgüllüğünü doğruladı. A. baumannii testi, mikrolitre başına 10⁷ kopyadan mikrolitre başına tek bir kopyaya kadar seyreltmeler boyunca DNA'yı başarıyla tespit etti ve UV ışığı altında sağlamlığını doğruladı.