Name: Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin, radyoterapi ve kinaz inhibitörleri ile ön işlem görmüş tümör hücreleriyle allojenik ko-kültürde insan T hücresi aktivasyonunu akış sitometrisi ile nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem immünoterapi stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Hiam-Galvez, K. J., Allen, B. M., Spitzer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+immunity+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Systemic immunity in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 21 (6), 345-359 (2021).</li>
<li>Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+as+tools+and+targets+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Macrophages as tools and targets in cancer therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).</li>
<li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+cancer+immunotherapy%3A+From+t+cell+basic+science+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A guide to cancer immunotherapy: From t cell basic science to clinical practice.</a> Nat Rev Immunol. 20 (11), 651-668 (2020).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+cancer+immunosurveillance+and+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting.</a> Immunity. 21 (2), 137-148 (2004).</li>
<li>Mittal, D., Gubin, M. M., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+cancer+immunoediting+and+its+three+component+phases--elimination%2C+equilibrium+and+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into cancer immunoediting and its three component phases--elimination, equilibrium and escape.</a> Curr Opin Immunol. 27, 6-25 (2014).</li>
<li>Irianto, T., Gaipl, U. S., Ruckert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+during+anti-cancer+radio%28immuno%29therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immune modulation during anti-cancer radio(immuno)therapy.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 382, 239-277 (2024).</li>
<li>Burtness, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+alone+or+with+chemotherapy+versus+cetuximab+with+chemotherapy+for+recurrent+or+metastatic+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck+%28keynote-048%29%3A+A+randomized%2C+open-label%2C+phase+3+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab alone or with chemotherapy versus cetuximab with chemotherapy for recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (keynote-048): A randomized, open-label, phase 3 study.</a> Lancet. 394 (10212), 1915-1928 (2019).</li>
<li>Hecht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+single+cycle+induction+treatment+with+cisplatin%2Fdocetaxel%2F+durvalumab%2Ftremelimumab+in+locally+advanced+HNSCC%3A+First+results+of+checkered-CD8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of single cycle induction treatment with cisplatin/docetaxel/ durvalumab/tremelimumab in locally advanced HNSCC: First results of checkered-CD8.</a> J Immunother Cancer. 8 (2), e001378(2020).</li>
<li>Chen, J. A., Ma, W., Yuan, J., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+biomarkers+and+rationale+strategies+to+overcome+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Translational biomarkers and rationale strategies to overcome resistance to immune checkpoint inhibitors in solid tumors.</a> Cancer Treat Res. 180, 251-279 (2020).</li>
<li>Solomon, B., Young, R. J., Rischin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+Genomics+and+emerging+biomarkers+for+immunomodulatory+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Head and neck squamous cell carcinoma: Genomics and emerging biomarkers for immunomodulatory cancer treatments.</a> Semin Cancer Biol. 52 (Pt 2), 228-240 (2018).</li>
<li>Meidenbauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+atm+or+atr+in+combination+with+hypo-fractionated+radiotherapy+leads+to+a+different+immunophenotype+on+transcript+and+protein+level+in+HNSCC%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of atm or atr in combination with hypo-fractionated radiotherapy leads to a different immunophenotype on transcript and protein level in HNSCC.</a> Front Oncol. 14, 1460150(2024).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of radiotherapy.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8151(2020).</li>
<li>Wimmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypofractionated+radiotherapy+upregulates+several+immune+checkpoint+molecules+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+independently+of+the+HPV+status+while+icos-l+is+upregulated+only+on+HPV-positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Hypofractionated radiotherapy upregulates several immune checkpoint molecules in head and neck squamous cell carcinoma cells independently of the HPV status while icos-l is upregulated only on HPV-positive cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (17), 9114(2021).</li>
<li>Derer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoradiation+increases+pd-l1+expression+in+certain+melanoma+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemoradiation increases pd-l1 expression in certain melanoma and glioblastoma cells.</a> Front Immunol. 7, 610(2016).</li>
<li>Schatz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normofractionated+irradiation+and+not+temozolomide+modulates+the+immunogenic+and+oncogenic+phenotype+of+human+glioblastoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlenther+Onkol%22%5BJournal%5D)">Normofractionated irradiation and not temozolomide modulates the immunogenic and oncogenic phenotype of human glioblastoma cell lines.</a> Strahlenther Onkol. 199 (12), 1140-1151 (2023).</li>
<li>Xu, M. M., Pu, Y., Zhang, Y., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+adaptive+immunity+in+the+efficacy+of+targeted+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of adaptive immunity in the efficacy of targeted cancer therapies.</a> Trends Immunol. 37 (2), 141-153 (2016).</li>
<li>Olivo Pimentel, V., Yaromina, A., Marcus, D., Dubois, L. J., Lambin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+co-culture+assay+to+assess+anti-tumor+cd8%28%2B%29+t+cell+cytotoxicity+via+luminescence+and+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel co-culture assay to assess anti-tumor cd8(+) t cell cytotoxicity via luminescence and multicolor flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 487, 112899(2020).</li>
<li>Kulp, M., Diehl, L., Bonig, H., Marschalek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+human+t+cells+with+leukemia+cells+to+measure+regulatory+t+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary human t cells with leukemia cells to measure regulatory t cell expansion.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101661(2022).</li>
<li>Ruckert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulatory+effects+of+radiotherapy+as+basis+for+well-reasoned+radioimmunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlenther+Onkol%22%5BJournal%5D)">Immune modulatory effects of radiotherapy as basis for well-reasoned radioimmunotherapies.</a> Strahlenther Onkol. 194 (6), 509-519 (2018).</li>
<li>Samstein, R. M., Riaz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response+in+immunotherapy+and+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Radiat+Oncol%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response in immunotherapy and radiation.</a> Adv Radiat Oncol. 3 (4), 527-533 (2018).</li>
<li>Meeren, A. V., Bertho, J. M., Vandamme, M., Gaugler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+enhances+il-6+and+il-8+production+by+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation enhances il-6 and il-8 production by human endothelial cells.</a> Mediators Inflamm. 6 (3), 185-193 (1997).</li>
<li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ifn-gamma+upregulates+survivin+and+ifi202+expression+to+induce+survival+and+proliferation+of+tumor-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ifn-gamma upregulates survivin and ifi202 expression to induce survival and proliferation of tumor-specific T cells.</a> PLoS One. 5 (11), e14076(2010).</li>
<li>Saraiva, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+HLA-dr+in+cytotoxic+t+lymphocytes%3A+A+validated+predictive+biomarker+and+a+potential+therapeutic+strategy+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Expression of HLA-dr in cytotoxic t lymphocytes: A validated predictive biomarker and a potential therapeutic strategy in breast cancer.</a> Cancers (Basel). 13 (15), (2021).</li>
<li>Dillon, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+inhibition+potentiates+the+radiation-induced+inflammatory+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atr inhibition potentiates the radiation-induced inflammatory tumor microenvironment.</a> Clin Cancer Res. 25 (11), 3392-3403 (2019).</li>
<li>Geiger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+modulates+T+cell+metabolism+and+enhances+survival+and+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">L-Arginine modulates T cell metabolism and enhances survival and anti-tumor activity.</a> Cell. 167 (3), 829-842.e13 (2016).</li>
<li>Rodriguez, P. C., Quiceno, D. G., Ochoa, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+availability+regulates+t-lymphocyte+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">L-Arginine availability regulates t-lymphocyte cell-cycle progression.</a> Blood. 109 (4), 1568-1573 (2007).</li>
<li>Lozano-Ojalvo, D., López-Fandiño, R., López-Expósito, I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLozano-Ojalvo%2C+D+%22The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo+models%22">The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. Cham. 169-180 (2015).</li>
<li>Gronholm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+for+precision+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy.</a> Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).</li>
<li>Perez, C., Gruber, I., Arber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-the-shelf+allogeneic+t+cell+therapies+for+cancer%3A+Opportunities+and+challenges+using+naturally+occurring+%26%2334%3Buniversal%26%2334%3B+donor+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Off-the-shelf allogeneic t cell therapies for cancer: Opportunities and challenges using naturally occurring &#34;universal&#34; donor t cells.</a> Front Immunol. 11, 583716(2020).</li>
<li>Martinez Bedoya, D., Dutoit, D., Migliorini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+car+t+cells%3A+An+alternative+to+overcome+challenges+of+car+t+cell+therapy+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Allogeneic car t cells: An alternative to overcome challenges of car t cell therapy in glioblastoma.</a> Front Immunol. 12, 640082(2021).</li>
<li>Schnellhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+FOXP3%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+rectal+cancer+depends+on+immune+phenotypes+defined+by+CD8%2B+cytotoxic+T+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of FOXP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in rectal cancer depends on immune phenotypes defined by CD8+ cytotoxic T cell density.</a> Front Immunol. 13, 781222(2022).</li>
<li>Zitvogel, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+W+%22Oncoimmunology%3A+A+practical+guide+for+cancer+immunotherapy%22">Oncoimmunology: A practical guide for cancer immunotherapy</a>. , Springer International Publishing. Cham. 23-39 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL Cellstar tüpleri</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cellstar tüpleri</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu hücre kültürü plakası steril, kapaklı</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu hücre kültürü plakası steril, F altlı, kapaklı</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AZD0156</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S8375</td><td></td></tr><tr><td>Berzosertib (VE-822)</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S7102</td><td></td></tr><tr><td>CASYcups</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651794</tr><tr><td>CASYton</td><td>OMNI Yaşam Bilimleri GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651808</tr><tr><td>CD25a, PE-Dazzle594, Fare IgG1</td><td>Biolegend</td><td>356126</td><td></td></tr><tr><td>CD28-UNLB</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>IM1376</td><td></td></tr><tr><td>CD3a, Krome Turuncu, Fare IgG1</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>B00068</td><td></td></tr><tr><td>CD3e Monoklonal Antikor</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>MA1-10176</td><td></td></tr><tr><td>CD4, APC, Fare Anti-İnsan Fare IgG1</td><td>BD Pharmingen</td><td>555349</td><td></td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, insan</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8a, PerCP-Cy5.5, Fare IgG1</td><td>Biolegend</td><td>300924</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Derin Kırmızı Boya</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>CFSE&</td><td>nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&akut; s Modifiye Kartal ve akut; s Medium)</td><td>PAN-Biotech GmbH</td><td>P04-02500</td><td></td></tr><tr><td>DxFlex Akış Sitometresi (Otomatik Yükleyicili)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>C44326, C02846</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu dihidrat</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td> <td>S0615-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS üstün&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>S0615-100ML</td><td>Isıyla etkisiz hale getirilmiş FBS üretimi için. 56 ° C'de 30 dakika ısıtın; Kompleman proteinlerini etkisiz hale getirmek için karıştırılarak C.</td></tr><tr><td>Graph Pad Prism (sürüm numarası 9)</td><td>GraphPad</td> <td>Yazılımı-HLA-DR</td><td></td></tr><tr><td>, DP, DQ Antikor, anti-insan, APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-123-550</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza (sürüm numarası 2.1)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizin-monohidroklorür</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>L5626-100G</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stok Çözümü</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MS Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer tarafından geliştirilmiş sayım odası</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG&nbsp;</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PBS Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>1514-122</td><td></td></tr><tr><td>ROTISeyl 1077</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Orta</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>R1790</td><td></td></tr><tr><td>SepMate 50mL tüpler</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>T6146-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td>15400054</tr></tbody></table>

Önceden İşlem görmüş tümör hücrelerinin allojenik ko-kültür ortamında İnsan t hücresi aktivitesinin analizi

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

Bir HNSCC'den türetilen HSC4 tümör hücreleri tohumlandı ve gece boyunca inkübe edildi. 24 saat sonra, hücreler bir kinaz inhibitörü ile muamele edildi. 3 saat sonra, fraksiyon başına 5 Gy'lik ilk iki doz uygulandı. 24 saat sonra, ikinci doz uygulandı ve hücreler gece boyunca tekrar inkübe edildi. Buna paralel olarak, ko-kültürün başlamasından 48 saat önce, T hücreleri sağlıklı bir donörün kanından izole edildi. İlk olarak, PBMC'ler yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpleri ve steril bir ayırma ortamı kullanılarak izole edildi. PBMC'ler bir hücre sayma odası kullanılarak sayıldı ve CD8+ T hücreleri, CD8+ T hücre izolasyon kiti kullanılarak izole edildi. İzole edilen CD8+ T hücreleri daha sonra CFSE (1 μM) ile boyandı ve daha sonra sayıldı. T hücreleri, 1.5 x 106 hücre / 3 mL yoğunluğa sahip CD3 / CD28 önceden kaplanmış kuyu plakalarına ekildi. 48 saatlik stimülasyondan sonra, T hücreleri hasat edildi, sayıldı ve 10.000 hücre / 10 μL yoğunlukta yeniden süspanse edildi. Ek olarak, ekilen tümör hücrelerinin temsili kuyuları hasat edildi ve sayıldı ve ortam, kalan tüm kuyucuklar için değiştirildi. T hücreleri tümör hücrelerine 1:1 oranında eklendi. Ko-kültür 96 saat sonra hasat edildi, süpernatant -20 ° C'de saklandı ve hücreler boyandı ve akış sitometrisi ile ölçüldü (Şekil 1).
T hücreleri boyut dışlanması ve CD3/CD8 pozitifliği ile tanımlandı. CD3 + / CD8 + pozitif hücrelerin CFSE sinyali, proliferatif olmayan T hücrelerinin (yüksek CFSE sinyali) ve çoğalan T hücrelerinin farklı alt popülasyonlarının dağılımını (CFSE sinyal yoğunluğu kaybı) gösterdi. Prolifere olan T hücrelerinin oranı, HSC4 HNSCC hücre hattı için örnek olarak ölçülmüştür (Şekil 4A). En az bir bölünme gösteren tüm T hücreleri "proliferatif" olarak tanımlandı. 3'ten fazla bölünme gösteren T hücreleri "yüksek proliferatif" olarak tanımlandı (Şekil 4B). HPV-negatif hücre hattı HSC4 için, T hücreleri ışınlanmış tümör hücreleri ile birlikte yetiştirildiğinde proliferasyon hızında hafif bir artış tespit edildi. ATR'nin RT ve RT artı inhibisyonu, RT artı ATM inhibisyonu ile tedavi edilen HSC4 hücrelerinin T hücreleri ile ko-kültürlerine kıyasla önemli ölçüde artmış ardışık T hücresi proliferasyonu ile sonuçlandı. T hücrelerinin "yüksek proliferatif" fraksiyonu ile ilgili olarak, HSC4 hücrelerinin RT artı ATR'nin inhibisyonu ile ön muamelesi, T hücresi proliferasyonunu uyarmada en etkili olmuştur (Şekil 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig04v2.jpg"> 
Şekil 4: T hücresi proliferasyonunda HSC4 tedavisine bağlı değişikliklerin analizi için CFSE ile boyanmış T hücrelerinin proliferasyonu. (A) Önceden tedavi edilmiş HPV-negatif HSC4 tümör hücreleri ile 96 saatlik ko-kültürden sonra çoğalan T hücrelerinin oranı. RT + ATMi ile tedavi edilen HSC4 tümör hücreleri ile ko-kültür sonrası T hücresi proliferasyonu, RT veya RT artı ATRi tedavisi ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede düşüktü. (B) HSC4 tümör hücrelerinin RT'si, yüksek oranda çoğalan T hücrelerinin daha yüksek bir fraksiyonunu indükledi (üçten fazla hücre bölünmesi. RT + ATRi ön işleme tabi tutulmuş HSC4 tümör hücrelerinin T hücreleri ile ko-kültüründen sonra, yüksek oranda proliferatif T hücrelerinin yüzdesi en yüksekti. Çubuklar, dört bağımsız, sağlıklı donörden alınan T hücreleri ile yapılan dört bağımsız deneyden elde edilen verileri göstermektedir (n = 4; Ortalama ± SD). (*p≤ 0.05, **p≤ 0.01, ***p≤ 0.001, ****p≤ 0.0001; istatistiksel anlamlılık, normal dağılımlı olmayan veriler için iki kuyruklu Mann-Whitney-U kullanılarak tüm deneysel koşulların karşılaştırılmasıyla test edilmiştir). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig04largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Proliferasyona dayalı CFSE kaybı, T hücresi proliferasyon hızını ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, birkaç hücre yüzeyi markörü, CD25 ve HLADR gibi T hücresi aktivitesi ile ilişkili olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, tüm CD3+ ve CD8+ T hücrelerinin yüzeyindeki CD25 ve HLA-DR'nin akış sitometrisi ile analizi yapıldı (Şekil 5). Farklı CD25yüksek veya HLA-DRyüksek alt popülasyonları tespit edilebiliyorsa ve bu yüksek pozitif hücrelerin geçitlenmesiyle ayırt edilebiliyorsa, ifade ölçülebilir (Şekil 3B). Farklı bir alt popülasyon tespit edilemezse, tüm popülasyonun ortalama floresan yoğunluğu (MFI) ölçülebilir ve MFI'nin duruma dayalı kaymaları ölçülebilir (Şekil 3C).
Örnek olarak, CD25 ve HLA-DR'nin MFI'si tarafından tanımlanan ekspresyon, önceden tedavi edilmiş HSC4 tümör hücreleri ile 96 saatlik ko-kültürden sonra analiz edildi (Şekil 5). T hücrelerinin RT ile muamele edilen HSC4 tümör hücreleri ile ko-kültüründen sonra, T hücreleri üzerindeki CD25 ekspresyonu güçlü bir şekilde aşağı regüle edildi. Özellikle, tümör hücrelerinin sadece ATMi ile ön muamelesi, ATRi ön tedavisine kıyasla önemli ölçüde azalmış bir CD25 ekspresyonu ile sonuçlanmıştır. RT ile kombine ortamda, RT, T hücreleri üzerinde CD25 ekspresyonunun azalmasına neden olsa da, RT'nin ATMi ile kombinasyonu, RT artı ATRi ile karşılaştırıldığında CD25'in artmış ekspresyonu ile sonuçlanmıştır (Şekil 5A). HLA-DR'nin T hücreleri üzerindeki ekspresyonu ile ilgili olarak, RT genellikle HLA-DR'nin yukarı regülasyonuna yol açmıştır, ancak yine ATMi veya ATRi ile kombinasyon halinde farklı bir davranış gözlenmiştir (Şekil 5B). RT + ATRi kombinasyonu ile ön işleme tabi tutulan HSC4 hücreleri ile birlikte kültürlenen T hücreleri, tek başına RT veya RT + ATMi ile karşılaştırıldığında HLA-DR ekspresyonunu arttırdı.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig05v2.jpg"> 
Şekil 5: Ön işlem görmüş HSC4 tümör hücreleri ile 96 saatlik ko-kültürden sonra T hücrelerinin yüzeyinde CD25 ve HLA-DR aktivasyon belirteçlerinin ekspresyonu. CD25 ve HLA-DR ekspresyonu, tüm T hücresi popülasyonunun MFI'sinin kaymasına dayalı olarak analiz edildi. HSC4'ün RT'si, T hücreleri üzerinde CD25 ekspresyonunun azalmasına ve HLA-DR ekspresyonunun artmasına neden oldu. RT'nin ATMi ile kombinasyonu, RT artı ATRi ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde farklı ifade modelleriyle sonuçlandı. Kutu grafikleri, dört bağımsız, sağlıklı donörden alınan T hücreleri ile yapılan dört bağımsız deneyden elde edilen verileri göstermektedir (n = 4; Ortalama ± SD). Veriler, normal dağılım göstermeyen veriler için iki kuyruklu Mann-Whitney-U testi kullanılarak tüm deney koşulları birbiriyle karşılaştırılarak analiz edilmiştir (*p≤ 0.050). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig05largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu veriler, örnek olarak, tümör hücrelerinin, bu durumda HSC4 HNSCC hücrelerinin tedavisinin, tümör hücrelerinin immünojenisitesini etkilediğini göstermektedir. Bu, tümör hücrelerinin önceden uyarılmış T hücreleri ile birlikte yetiştirilmesiyle izlenebilir, bu da uygulanan tümör hücresi tedavi rejimine dayalı olarak insan T hücreleri üzerinde çeşitli bir proliferasyon davranışına ve aktivasyon belirteçlerinin ekspresyonuna yol açar.

Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi

Cytotoxic T cells play a key role in the elimination of tumor cells and are, therefore, intensively studied in cancer immunology. The frequency and ...

analysis-human-t-cell-activity-an-allogeneic-co-culture-setting-pre

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bryostatin 1/Ionomycin Yoluyla Tümör-reaktif T hücrelerinin ex vivo Genişleme ve Ortak Gama Zinciri Sitokinler Formülasyon

Bu yazıda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde alloantigen özel anerji ikna etmek için basit bir teknik anlatılmaktadır. Tekniği olmayan alloreactive donör hücreleri oluşturmak için klinik olarak uygulanabilir. İnfüzyon bu hücrelerin bağışıklık sulandırıldıktan geliştirmek ve allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu sonrası toksisite azaltabilir.

Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Krom salınım tahlili, sitotoksik T hücresi aktivitesini tespit etmek için ortak bir tahlil, bazı sınırlamalar vardır. Bu madde, antijen spesifik CD8 T hücreleri ve insan göğüs kanseri tümör hattı ile, SKBR3 kullanarak, bir empedans dayalı bir yaklaşım hücre öldürme saptama yeteneğine için incelenmiştir.

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Bu video, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücresi aktivitesini doğrulamak için bir in vitro testi göstermektedir. CD19 antijeni ve sitoplazmik lusiferaz eksprese eden B hücreli lenfoma hücreleri, CD19'a özgü CAR T hücreleri ile birlikte kültürlenir. Bir tümör üzerinde CD19'a CAR bağlanması, CAR T hücrelerinin tümör hücresi sitotoksisitesine neden olan sitokinleri ve toksinleri serbest bırakmasına neden olur. CAR T hücresi aktivitesi, tümör hücrelerinde salınan sitokin ve azalmış lusiferaz...

Tümöre Özgü CAR T Hücrelerinin Anti-Tümör Aktivitesini Değerlendirmek için İn Vitro Test

Bu makale, tanımlanmış bir alloantijene spesifik olarak yanıt veren insan T hücresi klonlarının üretilmesi ve yayılması için bir yöntemi açıklar. Bu protokol, çeşitli peptit-MHC ligandlarına özgü insan T hücrelerinin klonlanması için uyarlanabilir.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

Bu kağıt sitometrisi görüntüleme akışı kullanarak T hücrelerinin karışık bir popülasyonda alloreaktivitesini ölçülmesi için bir yöntemi tarif etmektedir.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Burada, yalıtım ve CD4 karakterizasyonu için bir protokol+ T hücre alt kümeleri insan periferik kandan açıklanmıştır. Saf CD4+ T-hücreleri tarafından akış sitometresi T foliküler yardımcı hücresi alt kümeleri oranlarını belirlemek için analiz.

CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Burada, kanser-bağışıklık döngüsünü oluşturan adımları izlemek ve karakterize etmek için basit, hızlı ve güvenilir bir multiparametrik akış sitometrisi ve çip üzerinde tümör destekli protokolü detaylandırıyoruz. Gerçekten de, kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tümörleri alt etmek ve klinik bakıma rehberlik etmek için kritik bilgiler sağlar.

Kanser-Bağışıklık Döngüsünü Çoğaltmak için İn Vitro Sistemlerde Ko-Kültür

Öğrenin, radyoterapi ve kinaz inhibitörleri ile ön işlem görmüş tümör hücreleriyle allojenik ko-kültürde insan T hücresi aktivasyonunu akış sitometrisi ile nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem immünoterapi stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi

Daha fazla video keşfet