Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi

Tümör hücreleri, tedavi sırasında immün fenotipi değiştirir, bu da sonucu etkileyebilir ve bu nedenle araştırmamızın amacı, bu etkileşimlerin daha iyi anlaşılmasını sağlamak için T hücreleri ve tümör hücreleri arasındaki etkileşimi araştırmaktır.

Radyoterapiyi kinaz inhibitörlerine birleştirerek özellikle radyoya dirençli tümörlerde radyo duyarlılığını arttırmak. DNA hasar tepkisini hedeflemek şu anda son gelişmelerin merkezi bir parçasıdır. Radyobiyoloji alanında hali hazırda in vitro ve in vivo veriler arasındaki karşılaştırılabilirliği artırmak için üç boyutlu hücre kültürü modelleri ve ko-kültür modelleri oluşturulmaktadır.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, uygun bir hacimde D10 ortamında HSC4 tümör hücreleri elde edin. Her biri 96 kuyucuklu plakada 200 mikrolitre ortamda 15.000 hücre içeren koşul başına en az üç kuyu tohumlayın. Ko-kültür gününde her tedavi için sadece tümör hücresi ve sadece T hücresi kontrolü için kuyucuklar ve hücre sayımı için kuyucuklar dahil olmak üzere numune tedavisi için bir plaka belirleyin. İkinci günde, tümör hücrelerini gerekli konsantrasyonlarda kinaz inhibitörleri ile tedavi edin. Bir plakayı üç ila dört saat sonra ve 24 saatlik inkübasyondan sonra hipofraksiyone ışınlama için beş gri ile aynı şekilde ışınlayın. Periferik kan mononükleer hücreleri veya PBMC izolasyonu için, sağlıklı bir donörden toplanan EDTA karışık kanı iki adet 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Her iki santrifüj tüpünü de 50 mililitreye kadar PBS ve% 2 FBS ile doldurun. Ardından, PBMC ayrımı için plastik kakmalı altı santrifüj tüpü hazırlayın. Her birini 15 mililitre soğuk yoğunluklu gradyan ortamı ile doldurun. Yoğunluk gradyan ortamını 12 ila 15 mililitre seyreltilmiş kanla dikkatlice kaplayın. Tüpleri 1.200 G'de yavaşlama olmadan 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dört yeni 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Kullanılmış tüpleri atın. Yeni santrifüj tüplerini 50 mililitreye kadar PBS ve% 2 FBS ile doldurun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 120 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın. Hücre peletini %2 FBS içeren bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve iki peleti bir şahin tüpünde birleştirin. Santrifüj tüpünü tekrar 50 mililitreye% 2 FBS içeren PBS ile doldurun. PBMC'leri 300 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın. Hücre peletini 80 mikrolitre MACS artı 10'da yedi hücrenin gücüne kadar tamponda yeniden süspanse edin. Yedi hücrenin gücüne 10'da 20 mikrolitre CD8 mikro boncuk ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice karıştırın. Dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri iki mililitre MACS artı 10'da yedi hücrenin gücüne kadar tamponla yıkayın. Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 1000 mikrolitre MACS artı tamponda yeniden süspanse edin. Mıknatısa iki MS sütunu yerleştirin ve altına iki adet 15 mililitrelik santrifüj tüpü yerleştirin. Sütunları 500 mikrolitre MACS plus tampon ile dengeleyin. Daha sonra hazırlanan MS sütununa eşit miktarda hücre süspansiyonu yükleyin. Sütunları 500 mikrolitre MACS artı tampon ile üç kez durulayın. Son toplanan hücreleri akış veya CD8 negatif olarak etiketleyin ve bunları tek bir santrifüj tüpünde birleştirin. Daha sonra CD8 pozitif T hücreleri etiketli yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpü alın. Manyetik olarak etiketlenmiş CD8 pozitif T hücreleri içeren her iki sütunu da 1000 mikrolitre MACS ve her biri tampon ile yıkayın. T hücrelerini boyamadan önce, beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1000 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Süspansiyonu tekrar 300 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini 2000 mikrolitre bir mikromolar CFSE boyama solüsyonunda yeniden süspanse edin. 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, lekeli hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, T hücresi ortamında tekrar süspanse edin. Hücreleri CD3 ve CD28 kaplı altı kuyulu plakaya tohumlayın ve inkübe edin. Dördüncü günde, T hücrelerini hasat edin ve kendi ortamlarında yeniden süspanse edin. Belirlenen kuyucukları saydıktan sonra istenen sayıda T hücresini tümör hücresi kuyucuklarına bire bir oranında ekleyin. Yedinci günde, T hücresi proliferasyonunun niceliğini belirlemek için kültür plakasını inkübatörden çıkarın. Hücreleri yıkadıktan sonra, istenen antikorlarla boyayın ve T hücrelerini değerlendirmek için akış sitometrisi yapın. Tekliler elde etmek için ileri dağılım alanına karşı ileri dağılım yüksekliğine dayalı olarak ikili popülasyonu hariç tutun. T hücrelerini ileri saçılma alanına karşı yan saçılma alanına göre tanımlamak için tekilleri çizin. T hücrelerini ayırt etmek için CD3 ifadesini yan saçılma alanına göre çizin. Ayrıca, CD8 sinyalini yan saçılma alanına karşı çizdikten sonra CD8 pozitif T hücrelerini tanımlayın. Tüm T hücreleri CD3 ve CD8 eksprese etmelidir. Tüm CD8 pozitif T hücrelerinin CFSE sinyalini bir histogram olarak çizin. Geçit adımlarını tamamladıktan sonra, giriş olarak CD8 pozitif T hücrelerini seçin ve ilgili yüzey işaretleyici floresansını yan saçılma alanına karşı çizerek CD25 veya HLA-DR izotip ifadelerini analiz edin. Proliferatif T hücrelerinin oranı, ışınlanmış HSC4 tümör hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde artmıştır. Radyasyon tedavisi veya RT ve RT artı ATR'nin inhibisyonu, RT artı ATM inhibisyonuna kıyasla T hücresi proliferasyonunu önemli ölçüde arttırdı. Yüksek proliferatif T hücreleri arasında, RT artı ATR inhibisyonu proliferasyonu uyarmada en etkili olanıydı. CD25'in T hücreleri üzerindeki ekspresyonu, RT ile muamele edilen HSC4 tümör hücreleri ile ko-kültürden sonra aşağı regüle edildi. Tümör hücrelerinin tek başına ATM inhibitörü ile ön tedavisi, ATR inhibitörüne kıyasla CD25 ekspresyonunu önemli ölçüde azalttı. RT ve ATM inhibitörünün kombinasyonu, RT artı ATR inhibitörüne kıyasla artmış CD25 ekspresyonu ile sonuçlandı. RT artı ATR inhibitörü ile ön işleme tabi tutulmuş HSC4 hücreleri ile ko-kültür, tek başına RT veya RT artı ATM inhibitörüne kıyasla HLA-DR ekspresyonunu daha da arttırdı.