Genetik Olmayan Optik Stimülasyon Yoluyla Ca²⁺ Yayılımını İncelemek için Kardiyak Mikrofizyolojik Bir Sistem

Araştırma, materyal bazlı fotostimülasyon yöntemlerini entegre ederek in vitro kardiyak mikrofizyolojik modelleri geliştirmeyi amaçlamaktadır. Uzun ömürlülük ve stimülasyon invazivliğindeki sınırlamaların üstesinden gelmeye, kardiyak fizyolojiyi incelemek için güvenilir araçlar sağlamaya, ilaç tarama süreçlerini iyileştirmeye ve hastalık modellemesinde uygulamaları teşvik etmeye odaklanır. Biyostimülasyondaki son gelişmeler, hassas non-invaziv hücresel kontrol gibi kaldıraç kullanır.

Optogenetik, hücresel aktiviteyi düzenlemek için genetik modifikasyonu mümkün kılarken, ortaya çıkan materyal bazlı fototransdüserler genetik olmayan alternatifler sunar. Bu yenilik, çeşitli uygulamalarda nöronları, kardiyomiyositleri ve iskelet kası hücrelerini incelemede ve modüle etmede önemli bir atılım sağlar. Mevcut deneysel zorluklar arasında derin dokulara tutarlı ışık iletimi elde edilmesi, fototransdüserlerin biyouyumluluğunun ve stabilitesinin optimize edilmesi ve ışığa dayalı stimülasyon tekniklerinin hassasiyetinin iyileştirilmesi yer almaktadır.

Ek olarak, hücresel canlılığı ve işlevselliği korurken bu yöntemleri karmaşık biyolojik sistemlerle entegre etmek önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Bu protokol, kardiyak mikrofizyolojik modellerde non-invaziv hassas stimülasyon tekniklerine duyulan ihtiyacın araştırma boşluğunu ele almaktadır. Ziapin2 gibi malzeme bazlı fototransdüserler kullanan bu yaklaşım, geleneksel elektriksel stimülasyon ve optogenetiğin sınırlamalarının üstesinden gelerek, doku canlılığını ve işlevini korurken gelişmiş zamansal ve uzaysal kontur sunar.

Bulgularım, kalp dokularında hücresel aktivite üzerinde daha fazla hassasiyet ve kontrol sağlayan, invaziv olmayan, malzeme bazlı bir ışık stimülasyon tekniği sunarak araştırmayı ilerletecektir. Bu yaklaşım, genetik modifikasyonlara olan ihtiyacı ortadan kaldırarak kalp fonksiyonunu modellemek, hastalık mekanizmalarını incelemek ve daha etkili terapötik stratejiler geliştirmek için çok yönlü bir araç sağlar. Başlamak için, biri beyaz diğeri mavi olmak üzere iki kat laboratuvar bandını bir milimetre kalınlığında şeffaf, çizilmeye ve ultraviyole dayanıklı akrilik bir tabakaya yapıştırın.

Bant üzerindeki talaş desenini amaçlanan tasarıma göre kesin, ardından bir karbondioksit lazer kazıyıcı kullanarak akrilik levhayı daireler halinde kesin. Cımbız kullanarak en içteki çizginin içindeki iki bant katmanını çıkarın. Keskin bir çizgi bırakarak kalın çizgileri ve koyu lekeleri çıkarmak için cipsleri 30 dakika ila bir saat saf ağartıcıda bekletin ve cipsleri gece boyunca veya en az üç saat boyunca akan deiyonize su ile bir beherde durulayın.

Cipsleri polidimetilsiloksan veya PDMS damgalarında 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun, temiz% 70 etanolde 30 dakika boyunca çizgi oluğu özelliklerine sahip. Cipsleri ve pulları bir kaputun altındaki temiz bir alana aktarın ve yaklaşık bir ila iki saat hava akımı altında kurumaya bırakın. Daha sonra, taze hazırlanmış jelatini 15 dakika boyunca sonikleştirin, ardından kullanıma hazır olana kadar 65 santigrat derece su banyosuna geri koyun.

Mikrobiyal transglutaminaz veya MTG tüpünü, kapağı hafifçe gevşetilmiş bir kurutucuya yerleştirin ve kabarcıkları çıkarmak için vakumu yavaşça açın. Gazdan arındırma işleminden sonra MTG tüpünü 37 santigrat derece su banyosuna geri koyun. Ardından, bir ızgara tabakasını temiz Parafilm ile kaplayın ve cipsleri ızgaraya yerleştirin.

PDMS damgasını kullanım için yakınınızda bulundurun. Kabarcıkları önlemek için dikkatlice pipetleyerek beş mililitre jelatin çözeltisine beş mililitre MTG ekleyin. Şimdi, karışımın talaş alanını kapladığından emin olarak, her bir çipin üzerine yaklaşık 0,5 mililitre jelatin karışımını hızlı bir şekilde kesin.

Çizgi desenli PDMS damgasını üstüne yerleştirin ve jelatinin dokunun uzunlamasına eksenine paralel desenlendiğinden emin olmak için 200 gramlık bir ağırlık uygulayın. Tüm talaşlar kalıplandıktan sonra, çevresel rahatsızlığı önlemek ve gece boyunca çapraz bağlanmalarına izin vermek için üzerlerini bir cam kavanozla örtün. PDMS damgasının çipten ayrılmasını kolaylaştırmak için jelatini 30 dakika ila bir saat boyunca nemlendirmek için çip ve PDMS damgasını PBS ile doldurulmuş yeni bir P150 kabına sıkıştırın.

Çipin etrafındaki fazla kalıptan çıkarılmış jelatini çıkardıktan sonra, temiz çipi PBS ile doldurulmuş yeni bir P150 kabına aktarın. PDMS damgalarını %70 etanolde saklayın. Cipsleri sterilize etmek için, kaputun altında 10 dakika etanolde bekletin.

Cipsleri PBS'ye aktarın, 10 dakika bekletin, ardından üç kez PBS yıkayın. Kaplama çözeltileri için, mililitre fibronektin başına 20 mikrogramı, bir ila 100 seyreltme Geltrex ile takviye olmadan kültür ortamında karıştırın. Cipsleri bu çözelti ile 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatörde iki saat boyunca kaplayın.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositleri 10 mikromolar Y-27632 içeren RPMI ortamında çözün ve tohumlayın. Ortamı 24 saat sonra Y-27632 içermeyen RPMI ile değiştirin. Hücre tohumlamasından üç gün sonra, beyaz bandı cipslerden dikkatlice çıkarmak için cımbız kullanın.

Yüksek hızlı bir kamera ile donatılmış modifiye edilmiş bir tandem lens mikroskobu ve uyarma ışık kaynağı olarak 200 miliwatt'lık bir cıva lambasından oluşan optik haritalama aparatını hazırlayın. Belirlenen kalsiyum görüntüleme kamerasının önüne dikroik bir ayna yerleştirin. Optik pacing için, fototransdüser olan Ziapin2'yi uyarmak için bir LED ışık kaynağı kullanarak dokunun bir ucuna optik nokta stimülasyonu uygulayın.

Dokudan bir milimetre uzağa yerleştirilmiş geçici olarak düzenlenmiş bir optik fiber aracılığıyla dokuları 0.5 veya bir hertz frekansında hızlandırın. Numuneyi, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca kültür ortamına eklenen iki mikromolar X-Rhod-1 ile inkübe edin. Cipsleri taze kültür ortamı ile yıkadıktan sonra, B-27 eksi insülin ve HEPES ile desteklenmiş fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ortamına aktarın.

Doku çiplerini fizyolojik sıcaklığa ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir tabağa yerleştirin ve saniyede 2,5 kare kare hızında kayıtlara başlayın. Kalsiyum dalgası yayılımı, fizyolojik değerlerle tutarlı olarak saniyede yaklaşık 4,5 santimetre olarak hesaplanan iletim hızlarıyla, 0,5 veya bir hertz frekanslarında fotostimülasyon sırasında net bir uzamsal ve zamansal çözünürlükle başarılı bir şekilde görselleştirildi. Genlik, yükselme süresi, maksimum bozunma, eğim ve bozunma süresi dahil olmak üzere kalsiyum geçici parametreleri, ışık stimülasyonu ve elektrik stimülasyonu arasında kantitatif olarak benzerdi ve karşılaştırılabilir fonksiyonel tepkileri doğruladı.