Radyosensitif ve radyodirençli genleri ortaya çıkarmak için genom çapında CRISPR ekranı

Bu araştırma, genom çapında CRISPR taraması ve radyoterapiye odaklanmaktadır. Işınlamadan sonra akciğer kanseri hücresinde genom çapında bir CRISPR ekranı kullanarak radyoya duyarlı ve radyoya dirençli genleri görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Mevcut deneysel zorluklar, genomun muazzam karmaşıklığından ve altta yatan mekanizmaları keşfetmedeki potansiyel zorluklardan kaynaklanan hedef dışı etkileri içerir. Geleneksel tarama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, CRISPR kalıcı genetik modifikasyon sağlar ve üstün hassasiyet gösterir, bu da onu fonksiyonel genomik araştırma ve hedef keşfinde özellikle değerli kılar. Gelecekte, ekibimiz bu araştırmanın geride bıraktığı sorunları çözmek için in vivo CRISPR ekranını incelemeye odaklanacak ve CRISPR teknolojisini optimize etmeye kararlı olacağız.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, yapışkan hücre yoğunluğunu mililitre başına beş hücrenin kuvvetine 10 çarpı olarak ayarlayın. Bir pipet kullanarak, farklı dozlarda radyasyon tedavisi için her 3,5 santimetrelik kültür kabına iki mililitre hücre süspansiyonu dağıtın. Bulaşıkları% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre koyun ve gece boyunca inkübe edin. Bir işaretleyici kullanarak her 3,5 santimetrelik kültür kabını bir ila beş arasında numaralandırın. Bir radyasyon kaynağı kullanarak, iki ila beş arasındaki bulaşıklara sırasıyla 2, 4, 6 ve 8 gri radyasyon dozları uygulayın. Işınlanmış hücre yoğunluğunu bir çarpı 10 üzeri mililitre başına beş hücrenin gücüne ayarlayın. Kuyucuk başına 10 mikrolitre tohum, 100 mikrolitre başına 1000 hücreye karşılık gelir, radyasyon dozu başına üç kopya ile altı oyuklu plakalara bölünür. Daha sonra, 100 mikrolitre başına 3000 hücreye karşılık gelen kuyucuk başına 30 mikrolitre, radyasyon dozu başına beş kopya ile 96 oyuklu plakalara tohumlayın. Şimdi, CCK-8 reaktifini FBS olmadan RPMI 1640 ortamı ile bir ila dokuz oranında karıştırın. Karışımı 96 oyuklu plakaya ekleyin ve plakayı karanlıkta bir saat inkübe edin. Ardından, 450 nanometredeki optik yoğunluğu ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Enfeksiyon sürecine başlamak için, lentivirüs için mililitre başına sıfırdan 800 birime kadar logaritmik bir konsantrasyon gradyanı ayarlayın. Karşılık gelen lentivirüs hacmini tabak başına iki mikrolitre polibrene ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Lentivirüs polibren karışımını her bir oyuğa yavaşça damlatın. Ebeveyn hücre yoğunluğunu mililitrede beş hücrenin gücüne 10 kere üç kez ayarlayın ve 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir mililitre aşılayın. Kuyucuklara bir konsantrasyon gradyanında puromisin ekleyin. 72 saatlik enfeksiyondan sonra, her bir oyuktaki ortamı, hücre öldürme için minimum puromisin konsantrasyonunu içeren tam ortamla değiştirin. Hayatta kalan hücrelere dayanarak her kuyu için enfeksiyon sayısını hesaplayın. Yapışık hücre yoğunluğunu bir çarpı 10 üzeri mililitre başına yedi hücrenin kuvvetine ayarlayın. Polibren tabağı başına 0.3 ila 30 mikrolitreye eşit bir enfeksiyon çokluğunda lentivirüs ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Lentivirüs ve polybren karışımını 15 santimetrelik kültür kabına yavaşça damlatın. İyice karıştırın ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Enfeksiyondan sonraki ikinci günde, besiyerini kültür kabından aspire edin ve% 10 FBS içeren 15 mililitre RPMI 1640 tam besiyeri ile değiştirin. Enfekte olmamış ebeveyn hücreleri için aynı tedaviyi negatif kontrol olarak tekrarlayın ve 72 saat boyunca kültürlemeye devam edin. Şimdi, hücreleri% 0.25 tripsin kullanarak 15 santimetrelik bir kültür kabından sindirin. RPMI 1640 tam ortamındaki hücreleri %10 PBS ile yeniden süspanse edin ve hücre sayısını sayın. Sıfırıncı gün için genomik DNA'yı çıkardıktan sonra, DNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçmek için bir NanoDrop UV spektrofotometresi kullanın. Tedavi grubundaki hücrelere uygun bir radyasyon dozu uygulayın ve kontrol grubu hücrelerini normal şekilde çoğalmaları için tedavi edilmeden bırakın. 14 günlük tedaviden sonra, hem tedavi hem de kontrol grubu hücrelerini% 0.25 tripsin kullanarak sindirin. Hücreleri %10 FBS ile RPMI 1640 tam ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peletleri bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Santrifüjleme adımını tekrarladıktan sonra, peletten 14. gün genomik DNA'sını çıkarın ve DNA konsantrasyonunu belirleyin. Daha sonra, gerekli astarları hazırlayın ve 10 mikromolar kadar seyreltin. 20 mikrolitrelik bir reaksiyon sistemi kurmak için bileşenleri ekledikten sonra, tüpü beş saniye boyunca 300 G'de kısa bir süre santrifüjleyin. Agaroz jel elektroforezi için jeli hazırlayın, tarağı ondan çıkarın ve elektroforez tankını jeli kaplayacak kadar yeterli tamponla doldurun. DNA örneğine yükleme tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Son olarak, karışımı kuyucuklara yükleyin ve 14 gün sonra elektroforez koloni oluşumuna başlayın, iki Gri radyasyona maruz kalmanın, sıfır Gri'ye kıyasla hayatta kalan koloni sayısını önemli ölçüde azalttığını ortaya koydu. CCKA testi, daha yüksek radyasyon dozlarında daha fazla azalma ile iki Gray'de hücre canlılığında önemli bir azalma gösterdi. 72 saat boyunca artan puromisin konsantrasyonları ile tedavi, bir mikromolar olanın A549 hücrelerini ortadan kaldırmak için gereken minimum konsantrasyon olduğunu gösterdi. PCR doğrulaması, 231 baz çiftinde farklı bantlar gösterdi ve CRISPR kütüphanesinde beklenen sgRNA dizilerinin uzunluğunu doğruladı. Sıralama analizi, okumaların yaklaşık %60'ının referans genomla başarılı bir şekilde eşlendiğini ortaya koydu. sgRNA okuma sayıları, genom ölçekli bir ekran için teorik beklentilerle eşleşen bir Poisson dağılımını takip etti. PCA ve ısı haritası analizi, deneysel tutarlılığı doğrulayarak yüksek gruplar arası değişkenlik ve düşük gruplar arası varyasyon gösterdi. Gen ontolojisi analizi, DNA hasar tepkisini ilk 15 sonuç arasında en zengin yol olarak tanımladı.