In Vivo'da Görüntüleme, eklemlerdeki lökositlerin göç davranışını ortaya çıkarıyor

Lökosit kan kemik hücreleri kemik iliğinden türediği için, iltihaplanmaya yol açmak için dokuya girmelidirler. Bu sürecin kontrolü, iltihabı hafifletmek için yeni tedavilerin geliştirilebileceği kilit bir noktayı temsil eder. Genel olarak, iltihaplı dokuya lökositlerin kaçakçılığı post-kapiller venüllerde gerçekleşir ve yapışma zincirini takip eder; bu kasad, damar duvarı tarafından serbest akan lökositin yakalanmasıyla başlar.

Bunu damar duvarı boyunca pro yönünde yuvarlanma takip eder. Endotelyumda durma. Yani, damar yüzeyinde yapışma ve sürünmeden dolayı doku içinde belirli bir konuma ve transendotel göçüne uygun bir yer bulmak mümkündür.

İltihapları tetikliyor. Bu belirgin adımlar, kemoattrasyonlar dahil moleküler sinyallerin birleşimiyle düzenlenir. Kemoattrektant, ZP Cs aracılığıyla lökositleri aktive eder ve göç zincirinde kritik roller oynar.

Ek son nokta çalışmaları ve in vitro deneyler, kemoattrektan ve kemoattrektant reseptör sinyallerinin in vivo olarak lökositlerin göç davranışını dinamik olarak nasıl düzenlediğine dair içgörü sağlamamıştır. Son zamanlarda görüntüleme teknolojisindeki gelişmeler, canlı hayvanlarda bağışıklık hücresi göçüne eşi benzeri görülmemiş bakış açıları sundu ve in vivo bağışıklık hücre ticaretinin moleküler düzenlemesi konusundaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirdi. Bu nedenle, yakın zamanda, nötrofillerin eklem iltihaplanma bölgelerine kaçakçılığını kontrol eden moleküler mekanizmayı incelemek için başvurduk.

Yani bizim canlı eklem görüntülememiz, böylece eklem içinde tip III aşırı duyarlılık reaksiyonlarında yeni bir paradigma inşa ediyorlar. Yani, komplement bileşeni C5a iltihabın başlatıcısı olarak görev yaparken, doku yerleşik hücreler, tip III aşırı duyarlılık reaksiyonlarının mevcut paradigmasında iltihabda daha önemli roller oynamaktadır. Bu nedenle, eklemin in-vivo görüntülemesi, iltihaplanmış eklemle lökositlerin göç davranışını ve moleküler dinamiklerini ortaya çıkarmak için değerli bir tekniktir.

Bu nedenle, iltihaplı eklemlerde bu süreci inceleyen araştırma gruplarını desteklemek amacıyla in-vivo eklem görüntüleme protokolünü paylaşıyoruz. 0,05 molyar asetik asitte seyreltilmiş sığır tip II kolajenini dört derecede gece boyunca çalkalayarak tam Freund adjuvantı ile cam şırıngada 1:2 oranında emülsiyon karışımı kollajen sulandırması oluşturulur. Ayrıca yaklaşık 20 dakika elle karıştırılabilir.

Bu süreç ısı üretir, bu yüzden emülsiyon içeren cam şırıngayı buz üzerinde soğutun. Aşılamadan önce anestezi edilen bir fare. Tüyleri aşılama için makas kullanarak kuyruk boyunca şekillendirin.

Emülsiyonun 100 mikrolitre hacmini kuyruğun tabanına yakın deri altı boşluğa yavaşça enjekte edin. Artritin klinik puanlanması ve pati kalınlığının ölçülmesi, hastalık aktivitesinin değerlendirilmesi için gereklidir. Genellikle, artrit klinik puanlama ve pati kalınlığı ölçümleri ilk aşılamadan sonra her bir ila üç günde bir alınır.

Artrit klinik puanı bu puana, her farenin dört pençesinin toplamıdır. Puanlar aşağıdaki şekilde kaydedilmiştir. Yani, sıfır anormal.

Bunlardan biri eritem ve bir parmak şişliğidir. İkincisi eritem ve iki parmak şişmesi veya eritem ile ayak bileği eklemlerinin şişmesidir. Üç parmaklık eritem ve üç parmaktan fazla şişlik veya iki parmak ile ayak bileği ekleminde şişliktir.

Dördüncü yer eritem ve ayak bileği, ayak ve parmakta şiddetli şişlik, deformitedir. Bu yüzden pençe kalınlığı ölçümü, dijital kaydırma kaliperleri kullanılarak her patinin kalınlığı ölçülür. Her fare için dört pati boyunca ortalama pati kalınlığı ölçüsü kullanılır.

Fareler anestezi edilir ve fare bacağını makas makinesiyle şekillendirir. Kalan tüyleri temizlemek için tüy alma kremi kullanın. Kremi nemli gazlı bezle çıkarın.

Korneanın kurumasını önlemek ve kornea salınımı riskini azaltmak için her iki göze steril kornea kayganlaştırıcı uygulayın. Cerrahi bir dürbünde, mikro makasla cilt boyunca bir santimetre kesi yapın. Daha önce görüntülemeyi %1,5 agaroz ile PBS ile kapatın.

Sahne mikroskobun üzerinde hazırlanmış. Lazer gücü, kazancı, kayma ve konum gibi konfokal mikroskop ayarlarını ayarlayın. Uygun yer belirlendikten sonra görüntü alımı başlatılır.

CIA'nın temsilci bir sonucu. Genellikle artritin başlangıcı 28. günde gözlemlenir; artrit klinik skoru ve pençe kalınlığı 35. günde zirveye ulaşır. DBA 1-günlük farelerde CIA görülme oranı genellikle 35. güne gelindiğinde %900 ila %100'ün üzerindedir.

Burada, soldaki film kontrol farelerindeki eklemi gösteriyor, sağdaki film ise CIA farelerindeki eklemi gösteriyor. Bu filmlerde yeşil hücreler Ly6G pozitif nötrofilleri temsil eder. Turuncu hücreler CD4 pozitif T hücrelerini gösterirken, beyaz alanlar kan damarlarına karşılık gelir.

35. günde, CD4+T hücrelerine kıyasla kan damarlarının dışında daha fazla Ly6G pozitif nötrofil bulunduğunu açıkça görebilirsiniz. Bu nötrofiller oldukça hareketlidir ve iltihaplı eklem içinde aktif olarak birden fazla yönde hareket ederler. Burada, eklemlerin canlı görüntülemesinin temsilci analizini gösteriyorum.

Soldaki grafik yeni yapışan nötrofil sayısını, sağdaki ise 30 dakikalık bir kayıt sırasında yeni göç eden nötrofil sayısını gösterir. Artritik eklemlerde, hem yeni yapışan hem de transmigrasyon yapmış nötrofillerin sayısı, kontrol eklemlerinde gözlemlenenlerden önemli ölçüde daha fazladır. Sonuç olarak, fizyolojik ve patolojik koşullar altında yaşayan farelerde lökosit göç davranışlarının yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan in-vivo eklem görüntüleme protokolümüzü sunuyoruz.

Bu teknik, bağışıklık hücrelerinin iltihaplanmış dokularda nasıl etkileşime girdiğini, kan damarlarının duvarlarına nasıl yapıştıklarını, dokuya nasıl göç ettiğini ve iltihaplı yanıtı nasıl organize ettiğini doğrudan gözlemlememizi sağlar. Bu yaklaşımla, geleneksel histolojik veya in vitro yöntemlerle görünmez olan dinamik hücresel davranışları yakalayabiliriz. Bu görüntüleme sistemini nicel analiz ve moleküler belirteçlerle birleştirerek, artritin başlangıcını ve ilerlemesini sağlayan temel yolları ortaya çıkarabiliyoruz.

Önemli olarak, bu canlı gözlemlerden elde edilen içgörüler, bağışıklık hücresi dinamiklerini anlamamızı derinleştirmekle kalmaz, aynı zamanda bilimsel bir temel veya yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi için de sağlar. Bu teknoloji gelişmeye devam ettikçe ve daha fazla araştırmacı metodolojiyi uyarlayıp geliştirdikçe, in-vivo görüntülemenin karmaşık bağışıklık aracılı hastalıkların incelenmesi ve temel immünolojiyle translasyonel ve klinik araştırmaları arasında güçlü bir bağlantı kuran temel bir platform haline geleceğine inanıyoruz. Sonuç olarak, bu yaklaşımın yakın gelecekte romatoid artrit ve diğer kronik iltihap hastalıkları için yenilikçi tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunmasını umuyoruz.