Name: Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Keşfedin, CRISPR/Cas9 ve HMEJ yoluyla büyük DNA şablonlarının birincil insan T hücrelerine viral olmayan entegrasyonunu. Bu yöntem, immünoterapi uygulamaları için düşük maliyetli ve yüksek verimli hücre mühendisliği sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">T cells in health and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature reviews. Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li>
<li>Dotti, G., Gottschalk, S., Savoldo, B., Brenner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+therapies+using+chimeric+antigen+receptor-expressing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells.</a> Immunol Rev. 257 (1), 107-126 (2014).</li>
<li>DeRenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+strategies+to+enhance+CAR+T+cell+persistence+for+patients+with+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors.</a> Front Immunol. 10, 218(2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chimeric+switch-receptor+targeting+PD1+augments+the+efficacy+of+second-generation+CAR+T+cells+in+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A chimeric switch-receptor targeting PD1 augments the efficacy of second-generation CAR T cells in advanced solid tumors.</a> Cancer Res. 76 (6), 1578-1590 (2016).</li>
<li>Yeku, O. O., Purdon, T. J., Koneru, M., Spriggs, D., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armored+CAR+T+cells+enhance+anti-tumor+efficacy+and+overcome+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Armored CAR T cells enhance anti-tumor efficacy and overcome the tumor microenvironment.</a> Sci Rep. 7 (1), 10541(2017).</li>
<li>Schober, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+replacement+of+T-cell+receptor+%CE%B1-+and+%CE%B2-chains+with+preservation+of+near-physiological+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Orthotopic replacement of T-cell receptor α- and β-chains with preservation of near-physiological T-cell function.</a> Nat Biomed Eng. 3 (12), 974-984 (2019).</li>
<li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+T+cell+function+and+specificity+with+non-viral+genome+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.</a> Nature. 559 (7714), 405-409 (2018).</li>
<li>Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-based+cancer+immunotherapy%3A+Emerging+efficacy+and+pathways+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance.</a> Immunol Rev. 290 (1), 127-147 (2019).</li>
<li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenberg%2C+SA+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+antigen+and+NK+cell+activating+ligand+expression+in+malignant+cells%3A+a+story+of+loss+or+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">HLA antigen and NK cell activating ligand expression in malignant cells: a story of loss or acquisition.</a> Semin Immunopathol. 33 (4), 321-334 (2011).</li>
<li>Walther, W., Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+transfer%3A+a+review+of+their+use+in+the+treatment+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases.</a> Drugs. 60 (2), 249-271 (2000).</li>
<li>Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+platforms+within+the+gene+therapy+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Viral vector platforms within the gene therapy landscape.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).</li>
<li>Kumar, M., Keller, B., Makalou, N., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+determination+of+the+packaging+limit+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors.</a> Hum Gene Ther. 12 (15), 1893-1905 (2001).</li>
<li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature reviews. Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Pomeroy, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+genetically+engineered+primary+human+natural+killer+cell+platform+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">a genetically engineered primary human natural killer cell platform for cancer immunotherapy.</a> Mol Ther. 28 (1), 52-63 (2020).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Sci Rep. 8 (1), 12144(2018).</li>
<li>Nguyen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stabilized+Cas9+nanoparticles+and+modified+repair+templates+increase+genome+editing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.</a> Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Semenova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cytosolic+DNA+sensors+bind+plasmid+DNA+after+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple cytosolic DNA sensors bind plasmid DNA after transfection.</a> Nucleic Acids Res. 47 (19), 10235-10246 (2019).</li>
<li>Wimberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+inhibition+of+DNA-PK+and+Pol%CF%B4+improves+integration+efficiency+and+precision+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Simultaneous inhibition of DNA-PK and Polϴ improves integration efficiency and precision of genome editing.</a> Nat Comm. 14 (1), 4761(2023).</li>
<li>Monjezi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CAR+T-cell+engineering+using+non-viral+Sleeping+Beauty+transposition+from+minicircle+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors.</a> Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).</li>
<li>Kay, M. A., He, C. -Y., Chen, Z. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nat Biotechnol. 28 (12), 1287-1289 (2010).</li>
<li>Webber, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-induced+targeted+integration+of+large+DNA+payloads+in+primary+human+T+cells+via+homology-mediated+end-joining+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cas9-induced targeted integration of large DNA payloads in primary human T cells via homology-mediated end-joining DNA repair.</a> Nat Biomed Eng. 8, 1553-1570 (2024).</li>
<li>Williams, J. A., Paez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell+and+gene+therapy+safety+and+performance+using+next-generation+Nanoplasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Improving cell and gene therapy safety and performance using next-generation Nanoplasmid vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 494-503 (2023).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Hendel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified+guide+RNAs+enhance+CRISPR-Cas+genome+editing+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present%2C+and+future+of+non-viral+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The past, present, and future of non-viral CAR T cells.</a> Front Immunol. 13, 867013(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Asetik Asit</td><td>Kırlangıç Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>%2.5 CTS Bağışıklık Hücresi Serumu Replasmanı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofaktör X Kiti L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofaktör X Kiti S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Olarak Modifiye Edilmiş Kılavuz RNA'lar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>ve</td><td>Özel tasarım</td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink</td><td>L-7206</td><td></td></tr><tr><td>CTS OpTmizer T hücresi Genişletme Ortamı SFM + OpTmizer T hücresi Genişleme Takviyesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048501</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11141D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL2</td><td>PeproTech</td><td>200-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lonza 4D nucelofector&nbsp; Çekirdek</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D nükleofektör&nbsp; X</td><td>Ünitesi Lonza</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>Minicircle</td><td>Sistem Biyobilimler</td><td>MN910A-1</td><td>Özel tasarım</td></tr><tr><td>N-Asetil-L-sistein</td><td>MiliporeSigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplazmid</td><td>Aldevron</td><td>na</td><td>Özel tasarım</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

büyük dna Şablonlarının homoloji aracılı uç birleştirme hedefli entegrasyonu yoluyla birincil İnsan t hücrelerinin viral olmayan mühendisliği

Non-Viral Engineering of Primary Human T Cells via Homology-Mediated End-Joining Targeted Integration of Large DNA Templates

Burada, "Dev Minicircle" yapısı olarak adlandırılan büyük (&gt;6.3 kb) bir multisistronik şablon, CRISPR / Cas9 düzenlemesi kullanılarak birincil insan T hücrelerindeki TRAC lokusuna entegre edildi; TRAC'a özgü gRNA, evrensel gRNA ve negatif kontrol olarak kullanılan Cas2 mRNA'dan yoksun bir duruma sahip TRAC'a özgü bir gRNA (TCTCAGCTGGTACACGGC), UgRNA ve HMEJ nanoplazmidi (Şekil 9A). Dev Mini Çember yapısı, TRAC'a özgü gRNA, evrensel gRNA ve Cas9 mRNA'yı içeren numuneler, GFP ekspresyonu ölçülürken ortalama #.35'lik bir knock-in oranına sahipti (#.5 ± 5.247), negatif kontrol ise GFP ekspresyonu göstermedi (Şekil 2B). Deneysel koşullar arasında kat genişlemesi (Şekil 2C) ve canlılık (Şekil 2D) açısından önemli bir fark yoktu. Bu sonuçlar, mükemmel hücre canlılığını ve hücre genişlemesini korurken çok büyük bir şablonun yüksek verimli bir şekilde devreye girdiğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68150/68150fig01.jpg"> Şekil 1: HMEJ yapı tasarımının şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68150/68150fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68150/68150fig02.jpg"> Şekil 2: Dev mini daire yapısı ile elektroporasyona tabi tutulan T hücrelerinin karakterizasyonu. (A) Dev Mini Çember yapısının şematik gösterimi, bir GSG bağlayıcı, bir anti-CD19 CAR ve MND promotörü altında bir DHFR mutein ve eGFP ile TRAC promotörü altında bir anti-mezotelin CAR ve RQR8'i kodlayan &gt;büyük (6.3 kb) bir multisistronik şablon. (B) RQR8 ekspresyon yüzdesi, (C) kat genişlemesi ve (D) Dev Mini Daire yapısı ve CRISPR-Cas9 reaktifleri ile elektroporasyondan dokuz gün sonra T hücrelerinin canlılığı, CRISPR-Cas9 reaktifleri olmayan Dev Mini Daire ile elektroporasyonlu negatif bir kontrol ile karşılaştırıldığında. (***p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68150/68150fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plaka Boyutu</td>
			<td>Küvet Hacmi</td>
			<td>Hücreler/Kuyu</td>
			<td>Kurtarma Ortamının Hacmi</td>
			<td>NAC ile 1x TCM hacmi</td>
			<td>Toplam Final Hacmi</td>
		</tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td>
			<td>22/22 μL</td>
			<td>1-3 x 106</td>
			<td>300 μL</td>
			<td>680 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td>
			<td>100/110 μL</td>
			<td>4-20 x 106</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>2,9 mL</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr><tr><td>24 oyuklu G-Rex plakası</td>
			<td>20-110 μL</td>
			<td>1-20 x 106</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>5.6 mL</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Küvetler ve geri kazanım plakaları için hücre konsantrasyonları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Küvet Boyutu</td>
			<td>Şablon Plazmid</td>
			<td>Hedef bölge gRNA'sı</td>
			<td>Plazmid doğrusallaştırma gRNA</td>
			<td>Cas9 mRNA</td>
		</tr><tr><td>20 μL</td>
			<td>1-2 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1,5 μg)</td>
		</tr><tr><td>100 μL</td>
			<td>5-10 μg (5 μg)</td>
			<td>5-15 μg (5 μg)</td>
			<td>5-15 μg (5 μg)</td>
			<td>5-15 μg (5 μg)</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Gerekli CRISPR/Cas9 reaktiflerinin ve DNA şablonunun miktarı.

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği

Many current adoptive cellular therapies rely on lenti- or retroviral vectors to engineer T cells for the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) ...

non-viral-engineering-primary-human-t-cells-via-homology-mediated-end

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Gen hedefleme metodolojileri, nakavt, knock-in ve etiketli alellere sahip transgenik fareler oluşturmak için kullanılabilir.  Burada, E. coli'de, özel gen hedefleme vektörlerini hızlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek 'alt klonlama artı ekleme' olarak adlandırdığımız gelişmiş bir yeniden birleştirme yöntemini açıklıyoruz.

Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Bu yazıda, mevcut bir TCR'nin TCRα ya TCRβ eşleştirme periferal T hücresi reseptör repertuvarının tamamlayıcı hemichain ile, ilgi konusu antijen spesifikliğini sahip antijen-spesifik T hücre reseptörleri (TCR'ler) oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. De novo oluşturulan TCRler afiniteye değişen antijen spesifikliğini muhafaza eder.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Bu iletişim kuralı ex vivo karakterizasyonu immunomodulators, kızamık virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama kullanarak ifade oncolytic virüslerin ve nesil için ayrıntılı bir iş akışı açıklar. Uygulama ve uyarlama diğer vektör platformları ve transgenes klinik çeviri için roman immunovirotherapeutics gelişimi hızlanır.

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Burada, B hücrelerindeki genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve B hücre terapötiklerinin gelişimini incelemek için gen nakavt (KO) ve knock-in (KI) için birincil insan B hücrelerinin CRISPR/ Cas9 tabanlı genom mühendisliği için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

Hematopoetik kök hücre biyolojisini ve hematolojik maligniteleri daha iyi incelemek için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC'ler) somatik mutasyonları sadık bir şekilde modellemek için yeni stratejiler gereklidir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift rAAV donör transdüksiyonunu birleştirerek HSPC'lerde heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonlarını modellemek için bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Keşfedin, CRISPR/Cas9 ve HMEJ yoluyla büyük DNA şablonlarının birincil insan T hücrelerine viral olmayan entegrasyonunu. Bu yöntem, immünoterapi uygulamaları için düşük maliyetli ve yüksek verimli hücre mühendisliği sağlar.

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği (Video) | JoVE Journal

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği

Daha fazla video keşfet