Çift modaliteli Moleküler Kartografi: Multipleks mRNA Tespitinin Protein Görüntüleme Kütle Sitometrisi ile Entegre Edilmesi

Yumurtalık kanserinin moleküler mekanizmalarını daha iyi anlamak için özel biyolojiye odaklanıyoruz; böylece hasta hayatta kalma tahminini öngörecek yeni terapötik hedefler ve biyobelirteçler bulmayı umuyoruz. IMC'nin mevcut zorluklarından biri, düşük bolluklu proteinin diseksiyonu, antikor doğrulama ve titrasyonu çalışmaları ile analiz sırasında karmaşık ve zaman alıcı piksel sınıflandırmasıdır. Hazırlanan FFPE slaytlarından fazla sıvıyı çıkararak başlayın.

Nem kontrol tepsisini fırından çıkarın ve sürgü tutucusunu tepsiye yerleştirin. Sonra, girdap RNA-ISH Amplifier 3'ü iyice ekleyin ve slaytlardaki her doku bölümünü tamamen kaplayacak kadar reaktif ekleyin. Tepsiyi kapatın ve 40 derece Celsius'ta hibritizasyon fırınına 30 dakika koyun.

İnkubasyon sırasında, metal oligonukleotid karışımını her oligoyu bir'e 15 oranında seyreltileyerek hazırlayın. Metali iyice karıştırıp girdabla karıştırın ve oda sıcaklığında bırakın, daha fazla kullanana kadar. Şimdi, nem kontrol tepsisini fırından çıkarın.

Sürgü tutucuyu tepsiden çıkarın ve tepsiyi tekrar fırına yerleştirin. Sonra, kaydırakları nükleaz içermeyen suyla önceden yıkanmış şeffaf bir kaydırma tutucuya yerleştirin. Slaytları yıkama tamponunda hafif bir çalkalama altında iki dakika boyunca yıkayın.

Sürgülerden fazla sıvıyı çıkardıktan sonra, nem kontrol tepsisini fırından çıkarın ve sürgü tutucusunu tepsiye yerleştirin. Her doku bölümünü tamamen kaplamak için daha önce hazırlanmış karışık metal oligonukleotidleri ekleyin. Şimdi tepsiyi tamamen kapatın ve 40 derece Celsius'ta 45 dakika boyunca hibritizasyon fırınına yerleştirin.

Nem kontrol tepsisini hibritizasyon fırınından çıkarın, sürgü tutucusunu çıkarın ve boş tepsiyi fırına geri koyun. Spesifik olmayan bağlanma noktalarını engellemek için, slayttaki her doku bölümünü tamamen kaplayacak yeterli miktarda bloklama tamponu ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın. Slaytlar inkübüasyon yaparken, antikor karışımını antikor seyreltici tamponu kullanarak seyreltirerek hazırlayın.

Kuluçka bittikten sonra, doku slaytlarından tamponu atın ve önceden hazırlanmış antikor karışımını doku bölümlerini tamamen kaplaacak kadar dağıtın. Sonra, slaytları bir nem odasına yerleştirin ve gece boyunca dört derece Celsius'ta kuluçkaya geçirin. Yeni bir İridyum interkalator çözeltisi hazırlamak için, RNase-içermeyen TBS kullanarak 500 mikromolar stok çözeltisinden bire 2.000 seyreltme yapın.

Slaytları, nükleaz içermeyen suyla önceden yıkanmış şeffaf bir slayt tutucuya yerleştirin ve slaytları TBS-T tamponunda hafif çalkalayarak beş dakika boyunca yıkayın. Sonra, slaytları boyamak için hazırlanmış İridyum çalışma çözeltisini ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka yapın. Bundan sonra, kaydırakları nükleaz içermeyen suyla önceden yıkanmış şeffaf bir kaydırma tutucusuna yerleştirin.

Slaytları TBS-T tamponunda hafif bir çalkalama ile beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Sonra, TBS'nin dokuda tuz kristalleşmesini önlemek için slaytları hızlıca çift damıtılmış suya batırın. Slaytları kimyasal bir başlık altında 10 dakika kurutun ve görüntü alınana kadar dört derece Celsius'ta saklayın.

Hazırlanan slaytı görüntüleme kütle sitometri sisteminin ablasyon odasına yükleyin. İlgi alanını belirlemek için slaytın panoraması görüntüsü alın. Görüntü alma yazılımı kullanılarak, panorama görüntüsünde istenen ilgi alanlarını işaretleyin.

Fotoğraf edinim yazılımında satın alma şablonunu uygulayın. Ve örnek türüne göre lazer gücünü ayarlayın. Şimdi, lazer ablasyon sürecine başlayın.

Her izotopun miktarını dedektör kullanarak ölçün; bu dedektör verileri analiz için dijital forma dönüştürür. CD8 T hücrelerinin aktivasyon durumu, granzim B'nin hem mRNA hem de protein seviyelerinde ortak tespiti ve interferon-gamma pozitifliği kullanılarak değerlendirildi. Kanserle ilişkili bir fibroblastın, kanserle ilişkili fibroblast agresifliğinin her ikisi de MFAP5 proteini ve POSTN mRNA'sını eksprese ettiği gösterildi.

Bir CD4 T hücresinin IL17A ve IL6 mRNA'yı birlikte eksprese ettiği gösterildi; bu, TH17 hücre kimliğiyle uyumludur. CD4 T hücrelerinin IL13 mRNA'yı eksprese ettiği gözlemlendi. Keratin pozitif CD47 pozitif tümör hücreleri, CD8 T hücresinin yakınında gösterildi.

Aktive edilmiş bir CD8 T hücresinin CD25 proteinini ifade ettiği gösterildi. THBS2 ve CD47'nin karşılaştırılabilir mRNA boyaması, metal konjuge ve floresan etiketli protokoller arasında gözlemlendi.