Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Araştırmamızın kapsamı, FFPE dokusunda mikroRNA'ları ve birden fazla proteini aynı anda tespit edip niceleyen bir test geliştirmek ve doğrulamak, böylece TME içinde her ikisi arasındaki ilişkiyi mekânsal olarak gözlemlemekti. Aslında mevcut moleküler dizileme ve geleneksel kısıtlamaların yaygın sınırlamalarını, doğrudan nicelik, kololokalizasyon ve mikroRNA'lar ile proteinlerin eşzamanlı mekansal tespitini sağlayarak aşıyor; tüm bunlar dokuyu yok etmeden ve hücre ile hücre alt-hücre lokalizasyonunu korumadan. Bu teknoloji, düzenleyici ağlar, hastalık mekanizmaları üzerine temel araştırmalar ve daha iyi biyobelirteçler ve terapötik hedefler arayan translasyonel veya klinik çalışmaların yolunu açabilir.

Gece boyunca 60 derece Celsius'ta tutulan formalin sabitli parafinli insan yumurtalık tümörü örneklerini alarak başlayın. RNAssız su kullanarak, tüm ekipman ve aletleri iyice temizleyin. Deparafinizasyon yapıldıktan sonra, örnekleri üç kez ksilene batırın, her biri beş dakika sürece.

Dokuları her biri üç dakika boyunca 10 tur ardışık seyreltilmiş etanol serisiyle yeniden nemlendirin. Sonra örnekleri TBS'de iki dakika boyunca bir kez yıkayın. Örneklere 10 dakika boyunca %3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulayın.

Örnekleri TBS ile iki kez iki dakika boyunca yıkayın. Sonra, 10 dakika boyunca %3,7 paraformaldehit çözeltisi uygulayın. Bundan sonra, kolay retriever kızılötesi sistemiyle ilk antijen toplama turuna başlayın.

Slaytları taze EZ-AR 1 tamponuna batırın ve mikrodalgada 95 derece Celsius'ta 15 dakika pişirin. Sonra örnekleri TBS'de iki dakika durulayın, ardından TBST'de iki iki dakika yıkama yapın. Başlamak için, hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak her doku kesitinin etrafına bir bariyer çizin.

Antikor engelleyici çözelti ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında bir nem odasında 30 dakika kuluçka yapın. Şimdi, aynı blokaj çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikoru doku kesitini tamamen kaplayarak oda sıcaklığında bir saat boyunca nem odasında inkübe yapın. Slaytları TBST'de üç kez yıkandıktan sonra, anti-fare ve tavşan yadağı peroksidaz çözeltisi ekleyerek dokunun üstünü örtün ve nem odasında 10 dakika kuluçka yapın.

Şimdi, ilk floro-4'ü 1:100 oranında amplifikasyon dilutantıyla seyreltin. Bu karışımı dokuya uygulayın ve doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçınarak oda sıcaklığında bir nem odasında 10 dakika kuluçka yapın. Daha önce gösterildiği gibi ikinci antijen alma ve bloklama turunu yaptıktan sonra, ikinci birincil antikoru aynı blokaj çözeltisiyle seyreltin.

Sulandırılmış antikoru tüm doku kesitini kaplayacak şekilde uygulayın ve en az 16 saat boyunca dört derece Celsius sıcaklığında bir nem odasında kuluçka yapın. Ertesi gün, slaytları TBST'de her biri iki dakika boyunca üç kez yıkayın ve daha önce gösterildiği gibi anti-fare ve yaban turpu peroksidaz çözeltisiyle kuluçka yapın. Sonra, seyreltilmiş ikinci floro-4'ü slaytlara uygulayın ve nem odasında oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.

Prob uygulaması için, slaytları üç kez, her biri iki dakika boyunca TBST'de yıkayın. Üçüncü ve son antijen alımına başlamak için, slaytları EZ-AR 1 Elegance tamponu altına batırın ve 107 derece Celsius'ta 15 dakika mikrodalgada pişirin. Slaytları oda sıcaklığında 20 dakika soğutun, ardından TBS'de bir kez üç dakika yıkayın.

Doku alanını kaplayacak kadar RNAscope Proteaz Plus uygulayın ve 40 derece Celsius'ta 30 dakika boyunca fırında kuluçka yapın. Sonra, mikroRNA kilitli nükleik asit probunu dört dakika boyunca 90 derece Celsius'a kadar ısıtarak denatüre olun. Denatüre edilmiş probu hemen yerinde mikroRNA ile seyreltin.

Hazırlanan probu vortex yapıp döndürdükten sonra, tüm doku alanını kaplayacak şekilde ekleyip fırında 60 derece Celsius sıcaklıkta bir saat kuluçka yapın. Slaytları 5x SSC Buffer ile beş dakika boyunca bir kez yıkayın. SSC Buffer ile 60 derece Celsius'ta beş sıkı yıkama yaparak her biri beş dakika boyunca yapıldı.

Sonra, slaytları oda sıcaklığında 0,2 kat SSC ile beş dakika boyunca bir kez yıkayın. Bloklama tamponunu hazırlamak için TBS ve %0,5 engelleyici reaktif tozunu birleştirin. Bloklayıcı tamponu uygulayın ve nemli bir odada oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın.

Sonra, anti-digoksin ve fare yagar turpu peroksidaz konjugatı uygulayın ve nemli bir odada oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın. Üç TBST yıkamadan sonra, tiramid sinyal güçlendirme ve siyanin 3'ü 1:50 seyreltme ile slaytlara oda sıcaklığında nem odasında 10 dakika uygulayın. Slaytları TBST'de beş dakika boyunca üç kez daha yıkayın.

Doku kesitini tamamen kaplamak için TBS'de 1:1000 derecesinde seyreltilmiş DAPI çalışma çözeltisi uygulayın. Slaytları oda sıcaklığında, ortam nemi olan nemli bir odada beş dakika kuluçka altına alın. Slaytları TBST'de her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Kaplama örtülerini montaj ortamı ile uygulayın ve sürgüleri oda sıcaklığında 10 dakika kurutun. Kurumuş slaytları görüntülemeden önce 24 ila 72 saat karanlıkta veya uzun süreli depolama için üç aya kadar saklayabilirsiniz. miR-181c-3p'nin miRNA ekspresyonu, hem kontrol hem de antikor boyalı slaytlarda tutarlı olarak tespit edildi ve tümör hücre bölgelerinde belirgin şekilde daha güçlü sinyaller yoğunlaştı.

Anti-EpCAM antikorun 620 nanometre emisyonlu florofor ile uygulanması, HGSC örneğindeki tümör hücrelerini boyadı. Anti-CD8 antikorun 620 nanometre emisyonlu floroforlarla uygulanması, CD8 pozitif T hücresini belirgin şekilde işaretledi. Birleşik protein ve miRNA tespiti, miR-181c-3p'nin EpCAM pozitif tümör hücreleri ve CD8 pozitif bağışıklık hücrelerine göre mekânsal lokalizasyonunu sağladı.

U6 küçük nükleer RNA'yı hedefleyen pozitif kontrol probu, tüm doku tiplerinde güçlü floresan sinyaller üreterek probun etkinliğini ve doku bütünlüğünü doğruladı. Karıştırılmış miRNA dizisi kullanan negatif kontrol probu, herhangi bir doku tipinde tespit edilebilir sinyal göstermedi ve bu da spesifik olmayan bir bağlanma olmadığını gösteriyordu. miR-181c-3p için hedef prob, normal yumurtalık dokusu veya normal fallop tüpü dokusunda sinyal olmadan, yüksek dereceli seroz karsinom dokusunda güçlü bir ifade gösterdi ve prob ile testin özgüllüğünü ve doğruluğunu gösterdi.