Stereo-seq ile Türden Bağımsız Transkriptomların Kapsamlı Uzamsal Profili

Araştırmamız, öngörücü ve terapötik biyobelirteçleri belirlemek için yumurtalık tümörü mikro ortamını ayrıntılı olarak tanımlamaya odaklanmaktadır. Örneğin, kemoterapi yanıtı ve kemoterapi direncini tahmin edecek belirteçler veya ikinci hat tedaviler için yeni terapötik hedefler bulmak istiyoruz. Deneysel zorluklar arasında numune yönetimi, numunenin kalite değerlendirmesi ve bir numunenin işleme süresi yer alır.

Veri analizi tarafında ise zorluklar arasında verinin seyrekliği (diğer tek hücreli süreçlere benzer şekilde) ve özellikle tekrarlayan bölgelerin haritalanması yer alıyor. Ambalajından stereo dizileme N-Çipi çıkarıldıktan sonra, çip kimlik numarasını kaydedin. N-Chip yüzeyine dokunmadan cam sürgü kısmını %100 etanol ile temizleyin.

Mikro pipet kullanarak, stereo dizileme N-Chip'in kenarına dikkatlice 10 mikrolitre ultraviyole kürlenebilir seramik reçine uygulayın. Fazla reçineni çıkarmak için kapalı bir köpük sürüntü kullanın, çip kenarının etrafında sadece ince bir çizgi bırakın. Sürgünü ultraviyole kürleme cihazına yerleştirin, çip yüzeyine dokunmadığınızdan emin olun.

Şimdi reçine uygulanan çipi, 405 nanometrelik ultraviyole ışık kaynağına opak bir maskenin üzerine yerleştirerek slaytın arkasını aydınlatacak şekilde yerleştirin ve beş dakika boyunca kürleyin. Kürlemeden sonra, %100 moleküler derecede etanol, %70 etanol ve son olarak reçine uygulanan kenarın çevresini temizlemek için nükleaz içermeyen suyla ıslatılmış köpük sürünleri kullanın. Çipi 50 mililitrelik konik bir tüp kullanarak taze nükleaz içermeyen suya üç kez batırın.

Sıkıştırılmış hava kullanarak, çipi yaklaşık 60 ila 80 derece açıda, yüzey boyunca çapraz hareket ederek yaklaşık 60 ila 80 derece açıda kurutun. Sonra, 150 mikrolitre Poli-L-Lizin çözeltisi tüm çip yüzeyine eşit şekilde uygulanır ve çipi oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka altına alın. Sonra çipten Poli-Lizin çözeltisi çıkarılır.

İkinci yıkamadan sonra, sürgü kenarlarını çatma yüzeyine dokunmadan dikkatlice kurutun. Daha önce gösterildiği gibi çipi sıkıştırılmış hava ile sıkıca kurutun. FFPE dokusunu kesitlerken, çipe doğrudan dokunmayın ve çipin sadece %80'ini doku ile kaplayın.

SSC tamponunda iki mikrolitre tek zincirli DNA boyama çözeltisi hazırlamak için, Qubit tek zincirli DNA reaktifini 5X SSC tamponu ile seyreltirin. Ribonükleaz inhibitörü ile 1 ila 20 seyreltme ile boyama çözeltisi master karışımı oluşturulur; tek zincirli DNA çözeltisi 1'e 200 derece seyreltme ve kalan hacim 5X SSC tamponu ile kullanılır. Her çipe 150 mikrolitre boyama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta beş dakika kuluçka yapın.

Sonra her çipin köşesinden pipet kullanarak boyama çözeltisini nazikçe çıkarın. Çipi 0.1X SSC tamponuyla iki kez 10-15 saniye boyunca yıkaydıktan sonra, sürgü kenarlarını dikkatlice kurutun. Sürgüye yaklaşık üç-beş mikrolitre gliserol ekleyip montaj yapın.

Sürgü yüzeyinin yaklaşık bir santimetre yukarısından bir örtü kaydırarak düz tutun ve çip yüzeyine değmediğinden emin olun. Tek zincirli DNA boyalı dokunun floresan görüntülerini geniş alan mikroskopu kullanarak %10 örtüşmeyi garanti ederek görüntü panelleri arasında %10 örtüşme sağlanır. Elde edilen görüntüleri, ImageJ gibi görüntü işleme yazılımlarında önce teorik örtüşme kullanarak yaklaşık karo pozisyonları oluşturarak, ardından piksel eşleştirme hesaplamalı örtüşme uygulayarak döşemeyi ince ayar edin.

Eklemleri StereoMap yazılımında işleyin ve devam etmeden önce görüntü kalitesi kontrolünün geçtiğini doğrulayın. Stereo dizileme slaytını 30 mililitrelik 0.1X SSC tampon içinde batırın, ta ki kaplama çıkana kadar. FFPE decrosslink reaktifinin oda sıcaklığında olduğundan emin olun ve parçacık açısından kontrol edin.

Termosikleti açın ve denge için 30 dereceye, 30 dakikalık kuluçka için 95 dereceye ve dört derece Santi'de sonsuz tutmaya ayarlayın. Kaset contasını monte edin ve stereo dizileme çip sürgüsünü kasetin içine yerleştirin. Sonra stereo-dizileme kaydırma kasetinin kuyusuna FFPE decrosslink reagenti ekleyin, kasetin üzerine sızdırmazlık bandı uygulayın ve sıkıca kapalı olduğundan emin olun.

30 dakikalık kuluçkaya 95 derece Celsius'ta başlayın. 10 dakika sonra, 20 derece Celsius soğutulucuda 50 mililitrelik bir kaba 25 mililitre metanol koyun, her slayt başına yaklaşık bir mililitre hazırlayarak daha sonra kullanmak için hazırlanın. Çipi termosikliden çıkardıktan sonra, sürgü kaseti tezgaha aktarın ve sızdırmazlık bandını çıkarın.

Bir pipet kullanarak, kasetten FFPE çapraz bağlama reaktifini çıkarıp atabilirsiniz. Reaktif tamamen çıkarıldıktan sonra, kaseti ve contanı ayırın ve atın. Steril bir duman başlığı altında, sürgü kenarını kurutun ve gerekirse yeni bir silikon hazne uygulayın.

20 derece Santi-Santi'deki dondurucudan 500 mikrolitre soğutulmuş metanol ekleyin, böylece tüm bölüm su altında kaldığından emin olun. Kullanmadan önce 37 derece kuru blokta PR çözeltiyi 10 dakika önceden ısıtın. Fiksasyondan sonra, bir duman davlumonunda sürgüdeki fazla metanolünü silin ve çipteki kalan metanolün buharlaşmasını bekleyin.

Yeni bir kaset uç contası monte edin. Buharlaştırma tamamlandıktan sonra, stereo dizileme çipi slaytını kasetin içine yerleştirin. Çipe 200 mikrolitre önceden ısıtılmış permeabilizasyon reaktifi ekleyin.

Stereo dizileme kaydırma kasetine sıkı sıkıştırma bandı uygulayın ve sıkıca mühürlendiğinden emin olun. Burada gösterilen adımları takip ederek ters transkripsiyon ve ardından CDNA salınımı ve arındırma işlemi yapılacaktır. Nükleazsız suyu 37 derece Celsius'a kadar ısıtın.

Çipten mühürünü çıkarın. Her köşede ve çipin ortasında pipet koyun, dokuyu kazımadan veya dokunmadan sertçe yapın. Çipten tüm DNA salınım karışımını toplayıp 1.5 veya 2.0 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Çip yüzeyine doğrudan 350 mikrolitre önceden ısıtılmış nukleazsız su ekleyin. Daha küçük bir pipetle pipetle güçlü bir şekilde pipet yapın, ucunu eğip dokuya dokunmadan veya çipi kazımadan kuvvet uygulayın. Yıkamayı, daha önce toplanan 400 mikrolitre ücretsiz DNA salınım karışımıyla birleştirin, böylece sadece tek bir çipten alınan materyal birleştirilir.

Çipe 100 mikrolitre nukleazsız su yerleştirin. Stereo dizileme slaytını mühürleyin ve protokol sonuna kadar buzdolabında saklayın. SAW boru hattını kullanarak tek hücreli segmentasyon, FFPE bölümlerinde gerçekleştirildi ve bu da tRNA, TRDMT1 gibi poliadenillenmemiş RNA'lara eşlemeyi mümkün kılmıştır.

Etkileşimli mekansal görselleştirme, özel yazılım StereoMap kullanılarak varsayılan hücre tiplerini gösterdi; kümeler dokuda yakınlaştırılmış bir bölgede farklı renklerde gösterildi. Poladenillenmemiş RNA TRDMT1'in tüm doku ekspresyonu, StereoPi kullanılarak görselleştirildi. Protokolün uyarlamaları, yağlı ve kırılgan dokuların tam transkriptomik mekansal profillenmesinde yaşadığımız sorunları ele alarak doku yapışmasını, RNA erişilebilirliğini ve bu zor doku tiplerinde stereo-diziler için kullanımı iyileştirerek ele almaktadır.

Stereo-dizi, şu anda diğer mekansal transkriptomik yöntemlere göre daha yüksek çözünürlük sağlar ve iki mikron ile karşılaştırıldığında 500 nanometre çözünürlük sağlar. Ayrıca mikrobiyom, viral ve poliadenillenmemiş transkriptlerin incelenmesi için gereken tarafsız yakalamayı sağlar.