Gelişim Evrelerinde Özelleştirilebilir Genişletilebilir Bir Beyin Matrisi Üretimi

Gelişim Evrelerinde Özelleştirilebilir Genişletilebilir Beyin Matrisi İdamı, Chapman ve Kentucky Üniversitesi'nden Lexington, Kentucky'deki meslektaşları tarafından. Domuzcuk beyninin gelişimi, insan beyninkine birçok açıdan çok benzer. Fareler ve farelerle karşılaştırıldığında, domuzcuk beyninin doğumdan olgunluğa kadar olan oranı insanlara çok daha yakındır ve domuzcuk ile insan girusunun ve cephalik beyinlerinin fonksiyonel bölgeleri çok benzerdir.

Bu nedenlerle, domuzların ve diğer büyük memelilerin sinirbilim araştırmalarında kullanımı artmaktadır. Ancak, daha büyük memeliler için ticari beyin matrisleri pahalıdır ve seçenekler genellikle tek bir boyut veya kesitleme düzlemiyle sınırlıdır. Sonuç olarak, ticari matrisler hem erkek hem dişi ve farklı yaşlar için uygun olmayabilir.

Bu durum özellikle gelişimsel sinirbilim çalışmaları için sorunludur; çünkü beyin boyutları doğum sonrası büyümeyle belirgin şekilde değişir. Örneğin, domuz yavrusu beyinleri ilk üç ayda hızla büyür ve hacmi üç kattan fazla artar. Ticari domuz yavrusu beyin matrisleri, sadece iki haftalık olana kadar olan domuz yavrularının beyinlerine uyacak şekilde tasarlanmıştır.

Burada, bu soruna maliyet etkin ve kolay uygulanabilir bir çözüm olarak akrilik plaka bazlı, özelleştirilebilir bir matris yapım yöntemi sunuyoruz. Bu deney için dört naif dört günlük domuz elde edildi. Biri beyin toplama için beş günlükken, ikisi 32 günlükte, biri ise 38 günlük olarak kullanıldı.

Beyin kafatasından çıkarıldıktan sonra, beyin iki gün boyunca %10 tamponlu formalin ile sabitlendi ve kriyo-koruma için beş gün boyunca %30 sakaroz çözeltisine yerleştirildi. Sonrasında agaroz jeliyle beynin alçısını nasıl yapacağımızı sunacağız. Matrisi yapmanın ilk adımı beynin bir kalıbını yapmaktır.

Doğum sonrası beşinci gün domuz beyninin bir kalıbını oluşturma sürecini göstereceğiz; bu kalıp sagittal bir matris oluşturmak için kullanılacak. Cam kabın altına ağır hizmet plastik bir şerit yerleştirin, her iki ucu da kabın kenarlarından dışarı çıktığından emin olun. Bu şerit, agaroz bloğunun çıkarılmasını kolaylaştırır.

Kabı yarı yarıya kadar ıslak buz dolu bir kovaya batırın. Cam bir beakerde, 150 mililitre PBS'yi 90 derece dereceye ısıtın ve altı gram agaroz ekleyin, sürekli karıştırın. %4 agaroz çözeltisini yavaşça dökerek kabın dibine yarım ila bir santimetre kalınlığında bir tabaka oluşturun ve sertleşmesine izin verin.

Agarozun beyin yüzeyine bağlanmasını veya sulkuslarda sıkışmasını önlemek için beyni ince bir mineral yağ tabakasıyla tamamen kaplayın. Yağ ayrıca agaroz jelinden beynin çıkarılmasını çok daha kolay yönetilebilir hale getirir. Kaplamadan sonra, beyni ince agaroz tabakasına istenen yönde yerleştirin; böylece koronal veya sagital bir kalıp mümkün olduğunca düz ve dik hale getirilir.

Agararoz çözeltisinin 50 derece Celsius'a kadar soğumasına izin verin, dökülebilir viskozitesini korumak için sürekli karıştırın. Sonra agarose çözeltisini beynin üzerine tamamen gömülüp içine dökür. Agarozun oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.

Beynin üst üstündeki agaroz tabakasını cerrahi bir probla kesin, beyin konturunu takip edin. Beyin etrafında kesim tamamlandıktan sonra, agarozun üst katmanını nazikçe kaldırmak için ince bir spatula kullanın. Bu adımlarda beyni kesmemeye veya kesmemeye dikkat edin.

Beyni nazikçe kalıptan çıkarın. Daha önce yüzeye sürülen mineral yağ sayesinde nispeten kolay çıkmalıdır. İzlemeye düşmüş olabilecek küçük agaroz jel parçalarını mutlaka çıkar.

Bir bedekte 98 mililitre PBS'yi 9 derece Celsius'a ısıtın ve dört gram agaroz ile iki mililitre Hindistan mürekkebi ekleyin. İyi karıştır. Bu siyah agaroz çözeltiyi beynin oluşturduğu izlenimin içine dök, izlenimin taşmamasına dikkat edin.

Siyah jelin katılaşmasına izin verin. Plastik şeridin her iki ucunu tutun ve tüm agaroz bloğunu kaptan kaldırın. Şimdi matrisiniz için şablon plakalar nasıl oluşturulacağını göstereceğiz.

Beyin kalıbını kesmek için, iki 76 milimetrelik şeffaf akrilik plakanın arasına bir ölçekli kağıt parçası yerleştirin ve masanın kenarına yakın bir şekilde yerleştirin. Sonra dört köşe kare ve iki akrilik plaka ile agaroz bloklarını istenen konumda sıkıca tutacak iki duvar inşa etmek için kelepçelerle sabitlenin. İki metal köşe karesinin ön kenarları ve iki dikey akrilik plaka, ölçekli kağıdın bir tarafı boyunca hizalanmalıdır.

Agarose jel bloğunu, kesilecek kenarın ölçek kağıdı boyunca ve dikey akrilik plakalar ile köşe karelerinin kenarlarıyla hizalı olacak şekilde yerleştirin ve agarose bloğunun karşı tarafına bir ağırlık koyun, böylece blok yerinde tutulur. Hindistan mürekkep zekası kesilmek üzere olana kadar fazlalığı kesin. Agararoz bloğunu, örneğin altı ölçek kağıdındaki işaretlerin yardımıyla istenen adımlarda öne doğru hareket ettirin; örneğin, iki milimetre veya beş milimetre.

Bıçağı iki elinizle sıkıca tutup hem akrilik plakaların hem de köşe karelerinin ön kenarlarından aşağı doğru yönlendirerek bloğu kesin. Her dilimi ikinci bir ölçekli kağıda yerleştirin ve baskıyı kağıda geçirmek için sıkıca bastırın. Bir kalemle tüm dilimi çiz.

Dilimi çıkarın ve Hindistan mürekkebi ile tanımlanan beyin konturunu çizin. Ölçekli kağıttaki ilk dilimin yönünü not edin, örneğin sagital kesitler için arka ve ön kısımda ve süreç boyunca kağıda ek jel dilimleri eklendiğinde tutarlı kalın. Her birini sırayla numaralandırın.

Akrilik plakaları 10 x 8 1/2 santimetre kesin. Sonra üst üste koyup köşe kareleri ve kelepçelerle matkap makinesinin aşamasına sabitleyin. El yazmasında belirtilen koordinatlarla yığından üç delik açın.

Akrilik plakalardan koruyucu filmi çıkarın. Sonra ölçekli kağıda bir şablonun üzerine akrilik bir plaka yerleştirin ve akrilik plaka çizgilerinin üstünü şablonun üst kenarlarına hizalasın. Beynin konturunu kalıcı bir kalemle akrilik plakaya çizin.

Her plakayı şablonun numarasına veya beyin izine uygun şekilde etiketleyin. Bandtestereyi kullanarak, her plakayı kopyalanan şablon çizgileri boyunca kesin. Alternatif olarak, ahşap oyma uçlu döner bir alet istenmeyen bölgeleri kaldırmak için kullanılabilir.

Kesici kenarı, keskin kenarlar dilimlerde beyne zarar verebileceği için parlatıcı zımpara ucu olan döner bir alet ve parlatıcı zımpara ucu ile parlatın. Akrilik plakayı şablonun üzerine yerleştirerek kesim doğruluğunu tekrar kontrol edin. Gerektiğinde kesin ve cilalanın.

Sonra, plakaların montajını göstereceğiz. Matrisi önceden monte ederek plakaları sıralı olarak üst üste koyup plakaların hizalanmasını kontrol edin. Matris montajı, üç uzun paslanmaz çelik cıvatanın ilk akrilik plakadan geçmesi ve ardından her vidaya bir yıkama makinesi yerleştirilmesiyle başlar.

İkinci plakayı yerleştirin ve her vidaya albay ekleyin. Alternatif olarak, her montaj sırasında tek tek eklemek zorunda kalmamak için süpürge deliklerinin etrafına süper yapıştırıcı ile çamaşır makineleri yapıştırılabilir. Bu işlemi tüm plakalar sürgülere sırayla eklenene kadar tekrarlayın.

Her cıvataya bir somun takarak her şeyi sıkın. Beyne bakan kenarların son cilalanmasını uygulayarak plakadan plakaya daha sorunsuz geçiş sağlanır. Akrilik plakaların üst kenarını farklı renklerle boyamak için farklı renkli markerler kullanın, böylece dilimleme çok daha kolay hale gelir.

Burada siyah, kırmızı ve işaretsiz plakaları dönüşümlü olarak kullandık. Son olarak, beynin koronal veya sagital düzlemde dilimlenmesi sürecini göstereceğiz. Beyni dilimlemek için, kalıplama sürecindeki yönelimde ve mümkün olduğunca düz bir şekilde matrise yerleştirin.

Beyni kesmek için geniş ve düz bir bıçağa ihtiyacınız olacak. Geniş bıçak, kesme sırasında bükülme veya bükülme potansiyelini sınırlar. Yüksek profilli bir kriyostat bıçağı öneriyoruz.

Güvenlik için, bıçağın bir ucunu yaklaşık iki santimetre uzunluğunda laboratuvar bandıyla sararak beyin dilimleme sırasında sarılmış ucunu güvenli bir şekilde tutacak bir boşluk oluşturun. Burada bir uyarı notu var. Formalin fiksasyonundan sonra beynin her bir bölümü farklı dokulara sahip olduğundan, bıçak üzerinde eşit baskı uygulamak için dikkatli olunmalıdır.

Ayrıca, domuz yavrusu beyni büyüktür, bu yüzden beyni kesmek için doğrudan aşağı iterek kesmektense daha iyidir. Bıçak, bir taraftan diğerine sürekli kuvvetle çekilmeli, beynin tamamını kesecek kadar aşağıya indiğinden emin olmalı. Tüm dilimleri PBS dolu altı kutulu bir tabağa veya paslanmaz tepsiye koyun.

Dilimleri dikkatlice tepsiye yerleştirin, dilim sırasını ve yönünü koruyun, gerekirse koruyun veya devam edin. Geometriyi ayarlamak veya beyne daha iyi uyum sağlamak için boşluğu genişletmek için, seçilmiş akrilik plakalar çıkarılabilir veya eklenerek matrisi farklı beyin boyutlarına uyarlayabilir. Burada, P5 domuzcuk beyni için inşa edilen sagittal matrisinin, matrisin orta kısmına mavi ve yeşil renklerde birkaç plaka ekleyerek genişletilmesini gösteriyoruz.

Matris, artık bir P38 domuzcukunun sagital kesitlenmesi için uygundur. Matris boyutunu genişletme veya küçültme yeteneği, matris esnekliğini büyük ölçüde artırır ve hem malzeme hem de çaba tasarrufu sağlar. Koronal kesmede olduğu gibi, beyni sabital düzlemde dikkatlice kesin ve bıçağı yönlendirmek için ardışık plakalar kullanın.

Renk kodlama sistemi, dilimler ince olduğunda zor olan bıçağın doğru sıralı yerleşimini belirlemeye yardımcı olur. Beyni matriksten çıkarın ve dilimleri nazikçe ayırın. Sonuç olarak, yenidoğan domuzcuklar için beyin matrisleri oluşturmak için kolay, maliyet dostu ve esnek bir yöntem geliştirdik.

Bu kavram, yaşlı domuzlara ve diğer büyük hayvan modellerine uygulanabilir.