Spesifik Olmayan Doku Floresansını En Aza İndirmek için Spektral Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Pleks Görüntüleme
28 Ekim 2025
Spektral Yinelemeli Ağartma Çoklamayı Genişletir (IBEX), spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için heparin blokajı ekleyerek ve otofloresansı bastırmak için hesaplamalı karıştırma ile spektral algılamadan yararlanarak temel IBEX tekniğini temel alır. Bu yaklaşım, arka plan kaynaklarını azaltırken görüntü elde etmeyi hızlandırır ve sağlam, çok yönlü, yüksek parametreli uzamsal proteomik analizlere olanak tanır.
Eozinofil açısından zengin insan dokularında arka planı bastırmak için heparin bloklaması ve spektral algılamayı birleştiren bir IBEX iş akışını optimize ediyoruz. Otofloresans ve eozinofil granül bağlanması, gerçek sinyali belirsiz yapar. Her ikisini de temiz, yüksek plex haritalarını etkinleştirmek için hedefliyoruz.
Başlamak için, cam slaytın üzerine monte edilmiş dokunun etrafında bir daire çizerek bir pap kalem kullanarak hidrofobik bir bariyer oluşturun. Her dokuya yaklaşık 100 mikrolitre PBS ekleyerek onları yeniden nemlendirin ve slaytı oda sıcaklığında yaklaşık iki dakika kuluçka geçirerek optimal kesme sıcaklığı bileşiğini yıkayabilirsiniz. PBS'yi doku çevresinden aspire ile emici cam Pasteur pipeti ile alın.
Sonra her dokuya 100 mikrolitre bloklayıcı tampon ekleyin ve oda sıcaklığında bir nem odasında bir saat kuluçka yapın. Şimdi engelleme tamponunu pipet kullanarak aspire edin. her dokuya 100 mikrolitre boyama karıştırın ve slaytı gece boyunca dört derece Celsius sıcaklığında bir buzdolabında kapalı nem odasında kuluçka yapın.
Benzer şekilde, sadece bir florofor ile boyanmış ve negatif kontrol ile boyanmış bir bölüm hazırlanarak florofor spektrumunu ve doku otofloresansını tanımlayın. Boyama karışımını aspire ettikten sonra, mendiliyi PBS ile üç kez yıkayın, her yıkamadan sonra sıvıyı aspire edin. Örneği görüntüleme için mikroskopa monte edin.
Parlak alan veya diferansiyel girişim kontrast modunu kullanarak numuneye odaklanın. Sonra floresans moduna geçer ve deneysel gereksinimlere göre spektral alım parametrelerini yapılandırır. Deneyde kullanılan floroforlar için uygun lazerler atayın.
Seçilen lazer çizgilerine karşılık gelen bir ışın ayırıcıyı seçin. Tüm dedektörlerin tam emisyon spektrumunu yakalamasını ve görüntü alım çözünürlüğünü önceden tanımlanmış çözünürlüklerden birine ayarlaymasını mümkün kılın. Ya da maksimum çözünürlüğü seçin.
Optimum optik kesitleme için iğne deliği boyutunu tek bir alan birimine ayarlayın. Lazer ayarlarını satın almadan önce optimize edin. Tüm işaretleyicilerle boyanmış bir bölüm kullanarak, düşük lazer gücüyle sürekli tarama moduna başlayın.
Her dedektörün ana kazancını ve lazer yoğunluklarını ayarlayın, böylece tüm işaretleyiciler iyi bir sinyal-arka plan oranıyla tanımlanabilir. Lazer yoğunluklarını ince ayar edin ve tek boyalı ile çoklu boyalı kesitler arasında tekrar ederek geçiş yapın, ta ki tüm florofor sinyalleri aşırı doygunluk olmadan görünür hale gelsin. Satın alma yazılımında karo özelliğini etkinleştirin ve doku etrafındaki karo toplama bölgesini tanımlayarak tam görüntü kapsamasını sağlayın.
Dokunun merkezindeki karo edinme bölgesi için odak noktasını optimize edin. Sonraki görüntüleme turlarında hizalanma için referans olarak hizmet edecek tanınabilir bir düzende belirgin bir hücre seti gibi benzersiz bir yapısal özellik belirlemek. Şimdi Z-stack özelliğini etkinleştirin ve Z-stack sekmesine gidin.
Orta sekme altında, dilim sayısını en az altı olarak ayarlayın ve dilimler arasında en az bir mikrometre aralık bırakın. Önceki adımda belirlenen mevcut odak noktasını yığının orta dilimi olarak ayarlamak için orta butona tıklayın. Görüntü edinimi başlatmak için denemeye başla butonuna tıklayın.
Satın alma tamamlandıktan sonra, resim küçük resmine sağ tıklayın, Save As seçeneğini seçin. Bir dosya konumu seçin ve görseli adlandırın. Görüntü verilerini güvenli depolama için yedekleyin. Görüntüyü, döşeli bölge edinirken uygulanan aynı optimize edilmiş ayarlarla un-mix'i yapın.
Her tek boyalı kontrolden bir snap yakalayın ve gerçek sinyal spektrumunu elde etmek için lekelenmemiş kontrolden arka plan veya otofloresansı yakalamak için bir snap alın. Bu görüntüleri yalnızca spektral karıştırma için kullanın. Seçilen bölgenin gerçek bir sinyali temsil ettiğini, lekelenmemiş kontroldeki yoğunluk ve morfolojinin arka plan seviyelerine eşdeğer olup olmadığını ve belirteçin lokalizasyonunun beklenen hücresel desenle (örneğin membran, nükleer, sitoplazma veya salgılanan dağılım gibi) eşleştiğini kontrol ederek doğrulayın.
Yazılımda snap görüntüyü açın. Karıştırma sekmesine tıklayın ve karıştırmamış araçlar sekmesi altından bölge seçim araçlarından birini seçin, pozitif sinyalin etrafında ilgi alanı veya yatırım getirisi oluşturarak o bölgenin spektrumunu oluşturun. Her üretilen spektrumu ilgili floroforun teorik emisyon spektrumuyla karşılaştırın.
Bölgenin gerçek sinyali doğru şekilde temsil ettiğinden emin olun. Her spektrumu florofor kimliğine göre adlandırın ve spektral veritabanına kaydedin. Sonra, fayanslı görüntüyü yükleyin ve karıştırma aracını açın.
Plus tuşunu kullanarak her floroforun referans spektrumlarını karıştırma listesine ekleyin. Spektral sinyalleri ayırmak ve karıştırılmamış görüntüyü kaydetmek için doğrusal karıştırma düğmesine tıklayın. Ağartma çözeltisini bir buharlı davlumbazda hazırlayın.
Mikro spatula kullanarak, 10 miligram lityum borohidriti doğrudan kuru bir beaker'e tartın. Dikkatlice 10 mililitre ultra saf su ekleyin ve bileşik tamamen çözünene kadar karıştırın. Her doku bölümüne yaklaşık 100 mikrolitre yeni hazırlanmış ağartıcı çözeltiyi cam Pasteur pipeti ile ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında duman başlıkta 15 dakika kuluçka yapın.
Ağartıcı parlak menekşe ölürse, slaytı dikkatlice epifloresan mikroskopa taşıyın ve dappy filtreyi seçin. Örneği odakla ve tam güçle aydınlat. Şimdi daha büyük bir aydınlatma alanı elde etmek için 5X objektif kullanın ve kaydırak ile objektif veya gövde arasında herhangi bir temas önlemek için aşamayı tamamen indirin.
Son olarak, her kuyudan çıkan lityum borohidrid çözeltisini cam bir Pasteur pipeti ile boşaltın ve orijinal ağartıcı çözelti bebeklerine geri getirin. Slaytları üç kez seyreltme tamponu ile yıkayın ve her yıkama sırasında yaklaşık üç dakika kuluçka yapın. Antikor karışımını ekleyin ve numuneyi daha önce gösterildiği gibi boyayın.
Tedavi edilmemiş burun polip dokusu boyamasında CD3, CD4 ve CD20 ile boyama, eozinofil açısından zengin bölgelerde yoğun spesifik olmayan granül floresans göstermiştir. Gerçek membran lokalize sinyal ise daha düşük yoğunlukta mevcuttu. %5 yağsız sütle ön tedavi, özgün olmayan floresansı tamamen engelleyemedi ve ayrıca AF 532 gibi florofor için sinyal yoğunluğunu azalttı.
Dab ön tedavi CD20, CD3 ve CD4'teki spesifik olmayan floresansı azalttı, ancak DAPI ve AF 532 dahil olmak üzere birden fazla kanalda gerçek sinyal yoğunluğunu da azalttı. Heparinle ön tedavi, CD3, CD4, CD20 ve DAPI için yüksek sinyal yoğunluğunu korurken spesifik olmayan bağlanmayı etkili şekilde engellemiştir. Heparin, spesifik olmayan sinyali konsantrasyona bağlı olarak engelledi ve 10 birimde tam bastırma sağlandı ve yüksek konsantrasyonlarda zararlı bir etki gözlemlenmedi.
Üç kanallı görüntüleme sistemi alım süresini kısalttı, ancak AF 594'ün PE kanalına sızması ve çoklu lazer uyarımları nedeniyle geliştirilmiş doku otofloresansı dahil çapraz konuşma getirdi. Spektral görüntüleme, neredeyse tüm arka plan ve çapraz konuşmayı ortadan kaldırırken, alım süresini azaltmış ve sinyal-arka oranını iyileştirmiştir. İnsan burun polipinin spektral IBEX görüntülemesi, EpCAM ile işaretlenmiş epitel yapılarını ortaya çıkardı.
CD3 pozitif ve CD20 pozitif lenfositler gibi bağışıklık hücreleri ile CD31 ve CD34 ifade eden damarlar. Heparin tedavisi, sinyali azaltmadan granül bağlanmasını ortadan kaldırdı ve IBEX döngüleri boyunca güçlü arka plan baskısını sürdürdü. Spektral karışıklama, sızmayı en aza indirir ve otofloresans ile arka plana sinyal artışı sağlar ve çoklu panel alımı çok kanallı konfokal ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde hızlandırır.
Bu, doğru hücre durumu haritalaması ve komşuluk düzeyinde analizi destekleyen sağlam mekansal proteomikler ve zorlu dokular sağlar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, eozinofil açısından zengin insan dokularında sinyal netliğini artırmak için heparin blokajını ve spektral tespiti entegre ederek IBEX iş akışını optimize ediyor. Yaklaşım, otofloresansı ve spesifik olmayan bağlanmayı baskılamayı amaçlamakta, yüksek parametreli uzamsal proteomik analizlerin kolaylaştırılmasını sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Proteomik
Arka Plan
- IBEX tekniği, yüksek parametreli görüntüleme için tasarlanmıştır.
- Heparin blokajı, spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirir.
- Otofloresans, görüntülemede gerçek sinyalleri gizleyebilir.
- İş akışlarının optimize edilmesi, doğru uzamsal proteomik için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- IBEX tekniğini daha net görüntüleme sonuçları için geliştirmek.
- Eozinofil açısından zengin dokularda arka plan gürültüsünü azaltmak.
- Sağlam çok turlu uzamsal proteomik analizleri mümkün kılmak.
Kullanılan Yöntemler
- Spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için heparin blokajı.
- Hesaplamalı karışım ayrıştırma ile spektral tespit.
- Rehidrasyon için PBS ile doku örneklerinin hazırlanması.
- Doku örneklerini izole etmek için hidrofobik bariyerlerin kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Görüntülemede otofloresansın başarılı bir şekilde bastırılması.
- Yüksek parametreli uzamsal proteomik haritaların netliğinde iyileşme.
- Görüntü alma süreçlerinde hızlanma.
- Optimize edilmiş IBEX iş akışının sağlamlığının gösterilmesi.
Sonuçlar
- Optimize edilmiş IBEX tekniği, görüntüleme kalitesini önemli ölçüde artırır.
- Heparin blokajı, spesifik olmayan bağlanmayı azaltmada etkilidir.
- Spektral tespit yöntemleri, proteomik analizlerin doğruluğunu artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-plex spectral confocal imaging with IBEX enables robust spatial proteomics in tissue environments where autofluorescence and non-specific staining have previously limited data quality. By integrating heparin blocking and spectral unmixing, this workflow delivers high-dimensional, single-cell resolution maps critical for target validation and mechanistic de-risking in complex human tissues. The approach accelerates early discovery and supports confident advancement decisions in translational and preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise mapping of cell clusters and their microenvironments for functional target validation.
- Reduces biological ambiguity by distinguishing true marker expression from background fluorescence.
- Supports mechanistic de-risking through high-content, spatially resolved proteomic data.
- Facilitates portfolio triage by providing robust evidence of target engagement in native tissue contexts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream multiplexed imaging workflows.
- Standardizes assay conditions to minimize bleed-through and non-specific signal.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-throughput screening platforms.
- Enables reliable evaluation of compound effects on diverse cell populations within intact tissue.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomic readouts with disease-relevant tissue models for translational continuity.
- Supports biomarker discovery and validation in challenging, autofluorescent tissues.
- Provides risk-adjusted data for preclinical advancement decisions.
- Enhances predictive confidence in tissue-level pharmacodynamics and mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
This optimized spectral IBEX workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling high-content, spatially resolved analysis in complex tissue systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving true marker localization at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-dimensional, spatially resolved proteomic data for robust statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery through preclinical validation in disease-relevant tissue models.
- Enterprise Reuse: Establishes a broadly applicable imaging capability for diverse tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based studies.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows, improves reproducibility, and accelerates acquisition time.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through robust spatial data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in spectral confocal microscopy and computational unmixing.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and secure data storage infrastructure.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptation may be necessary for tissues with unique autofluorescence or binding properties.
- Practical limitations include the need for validated controls and careful optimization of blocking and acquisition parameters.
