Akciğer Kanserinin Sinjeneik Ortotopik Fare Modelini Oluşturmak için Minimal İnvaziv Bir Yöntem

Mevcut araştırmalarımız, akciğer kanseri hastalığını anlamaya ve kemoterapi, radyasyon ve immünoterapi dahil standart bakım terapisiyle uyumlu yeni tedavi yöntemlerinin nasıl geliştirileceğine odaklanmaktadır. Erken evre akciğer kanserini özel olarak incelemek için kriterler belirleyen ortotopik akciğer kanseri modeli bulamadık. Bu protokolle bu boşluğu gidermek için açık ve tekrarlanabilir yönergeler sağlamaya çalışıyoruz.

Bu protokol minimal müdahaleci ve uygulanması kolaydır. Ayrıca, sağladığımız kriterlerle birlikte, bu protokol hassas tümör implantasyonunun taramasına olanak tanır ve biyolüminesans görüntüleme ile tümörün erken tespitini sağlar. Bu protokol, araştırmacıların ev sahibi dokuda erken evre akciğer kanserini incelemesini sağlar; böylece yeni kanser tedavilerinin preklinik ilerlemesi ve tümör mikro ortamının araştırılması sağlanır.

Bu tekniği, heyecan verici yeni akciğer kanseri tedavilerinin mekanizmalarını ve etkinliğini preklinik olarak değerlendirmek için kullanacağız ve bunun gelecekteki hasta bakımına yol açabileceğini umuyoruz. Başlamak için, anestezi altındaki fareyi burun konisine bir ısıtma cihazının üzerinde yatağa yerleştirin ve farenin her iki gözüne oftalm merhemi uygulayın. Anestezi doğrulandıktan sonra, farenin sol dorsal tarafındaki iki x üç santimetre dikdörtgen alandan tüyleri temizlemek için elektrikli makas makinesi kullanın.

Sırt sırtından medial, tabla yanlardan, son kaburga aşağıdan ve kürkü üst kenarından başa doğru tıraş olun, tüy görünmeyecek kadar alın. Fareyi ısıtıcı cihazın üzerindeki boş kafese yerleştirin. Fare uyanık olana kadar nefes alışkanlığını gözlemleyin ve ardından ameliyata kadar onu ev kafesine geri döndürün.

Hücre hasadı gününde, toplanmadan üç ila dört saat önce kültür plakasına mililitrede 50 miligram Gentamisin içeren taze ortam ekleyin. Kültür plakasından medyayı aspire edin ve bağlı hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Sonra hücreleri tripsin EDTA çözeltisiyle 37 derece Celsius'ta bir ila iki dakika kuluçka altına alın.

Tripsini nötralize etmek için taze ortam ekleyin. Hücreleri plakaya hafifçe vurarak veya pipetle dağıtın. Sonra hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe içine toplayın.

Şimdi, konik tüpü 1.200 G'de oda sıcaklığında üç dakika boyunca santrifüj yapın. Tabanda kompakt bir peletin bulunduğuna doğrulandıktan sonra, süpernatantı aspire edin ve pelleti PBS ile yıkayın. Yıkanmış hücre pelletini PBS ile yeniden askıya alın, böylece sayma için mililitrede yaklaşık 1 ila 2 milyon hücre konsantrasyonu elde edilir.

Devam etmeden önce süspansiyonu 40 mikrometrelik hücre süzgeciyle filtreleyin. Sonra, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitre tripan mavisi ile birleştirin. Boyalı örneği hemositometreye yükleyin ve hücreleri sayın.

Toplam hücre sayısını ve hücre yaşamlılığını hesaplayın. Hücreleri tekrar 1.200 G ile oda sıcaklığında üç dakika boyunca santrifüj edin ve peletten çıkan PBS'yi aspire edin. Hücre pelletini PBS içinde mililitre başına 0,5 miligram metra jel ile yeniden askıya alın.

Toplam enjeksiyon hacmi 50 mikrolitrede istenen hücre sayısına ayarlayın. Matrigel katılaşmasını önlemek için hücre süspansiyonunu buzda tutun. Anestezi altındaki hayvanın cerrahi bölgesini steril gazlı bezle üç kez temizleyin, Betadine ve %70 etanol arasında dönüşümlü olarak kullanın.

Fare üzerine üçe dört santimetre açıklıklı sterilize edilmiş fenestrasyonlu cerrahi perdeyi yerleştirir ve perdelerin üzerine otoklav cerrahi aletleri yerleştirir. Pens kullanarak, skapulanın kafa kenarını ve göğüs kaburgasının şımartma kenarını tespit edin. Deri, cerrahın başparmağı ile işaret parmağı arasında gergin tutulurken, 10 boyutlu bir skalpel bıçağı kullanarak skapulanın hemen altında yüzeysel beş milimetrelik bir deri kesisi yapın.

Sonra 115 milimetrelik düz makas kullanarak kaburga ve interkostal kaslardan deri altı yağları kesmeden keserek keserek kesin. Kapiller hasardan kaynaklanan hafif kanamayı önlemek için, sterilize edilmiş pamuk uçlu aplikatörü kanamaya hafifçe bastırın. Kesiyi mikro adlar ve forseps kullanarak açık tutun.

Yedinci gerçek kaburgadan başlayarak, yukarıya doğru saymak ve dördüncü ve beşinci kaburgaları bulmak için kavisli orta nokta forseps kullanın. Bu bölgeyi enjeksiyon yeri olarak işaretleyin. Şimdi, hücre süspansiyon borusunu nazikçe üç-dört kez ters çevirerek karıştırın.

Enjeksiyondan hemen önce, 50 mikrolitre süspansiyonu steril 300 mikrolitre 31 gauge sekiz milimetrelik insülin şırıngasına çekin, baloncuk olmadığından emin olun. Enjeksiyon derinliğini kontrol etmek ve durdurucu olarak görev yapmak için enjeksiyona dört milimetre kalınlığında sterilize edilmiş metal bant şeridi yerleştirin. 50 mikrolitrelik hücre süspansiyonunu dördüncü ve beşinci kaburgalar arasındaki interkostal boşluğa, dördüncü kaburganın hemen altındaki 90 derece açı ile enjekte edin ve iğneyi iki ila üç saniye boyunca yerinde tutun.

İğneyi yerleştirildiği açıyla yavaşça çekip keskin bir kapta atın. Son olarak, deri kesisini iki ila üç kare düğümlü dikişle kapatın ve dikişlerin üzerine veteriner cerrahi yapıştırıcısı uygulayarak yara kapanmasını güçlendirin. Biyolüminesans görüntüleme, deneysel farelerde enjeksiyondan bir gün sonra tümörle ilişkili sinyalleri tespit etti ve fare grubu başına 25.000 ve 50.000 hücre için zamanla parlaklık belirgin şekilde arttı; 50.000 hücre grubunda ise daha yoğun bir yoğunluk gözlemlendi.

Toplam tümör akışı hem 25.000 hem de 50.000 hücre grubunda üstel olarak arttı; 50.000 hücre grubunda 21. güne kadar saniyede sekiz foton gücüne 10 kat 10'dan fazla ulaştı. Sahte farelerde diseksiyon edilmiş akciğerlerde hiç lüminesans veya görünür tümör görülmemişken, deneysel farelerde akciğer dokusunda yüksek lüminesans ve kırmızı tümör kütleleri bulunmuştur. Enjeksiyondan 21 gün sonra, dahil edilen farelerde sol akciğer lobunda sınırlı tümörler görüldü ve çevre bölgelere invaziya yoktu.