Glioblastoma hayvan modelinde interstisyel sıvının boylamasına koleksiyonu için beyin açık akışlı mikroperfüzyonun kullanımı

Beyin tümörü interstisyel sıvısı içindeki çözünür sinyal bileşenlerini karakterize ediyoruz; bu bileşenler hastalığın ilerlemesine ve tedavi yanıtına katkıda bulunuyor. Beyin tümörü interstisyel içindeki mutlak çözünen konsantrasyonlarının değerlendirilmesi, gelişmiş deneysel yöntemler gerektiren bir inceleme zorluğu olmaya devam etmektedir. Başlangıç olarak, steril bir skalpel ile kafatasının yüzeyi boyunca, gözler arasından başlayıp 8 ila 10 milimetre boyunca kaudal olarak uzanan sagittal orta hat kesisi yapın.

Sonra steril forseps kullanarak deriyi orta hat kesisinden yan tarafa geri çekin. Hem bregma hem de lambda'nın görünür olduğundan emin olun ve gerekirse kesiyi uzatın. Sonrasında, steril bir skarpel ile periostu kesin ve forsepsle dokuyu yanlara doğru geri çekin.

Kafatası yüzeyini temizlemek için steril pamuk uçlu aplikatör ile %1-3% hidrojen peroksit uygulayın. Şimdi 0,3 ila 1,0 mililitre insülin şırıngası kullanarak 20 ila 40 mikrolitre kendi kendine aşınan diş yapıştırıcısını kafatası yüzeyine eşit şekilde uygulayın. Sonra yapıştırıcıyı aşındırmak için diş kürleme ışığına maruz bırakın.

Sertleştikten sonra, fazla yapışkanı steril pamuk uçlu aplikatörler ve tuzlu su ile silin. Matkap ucunu cOFM kılavuz koordinatına yerleştirin. Matkapı dakikada 15.000 devire ayarlayın ve DV mikromanipülatör kadranını kullanarak burr deliği açın.

Sondaj sırasında sık sık kafatası kalınlığını izleyin ve kalıntıları temizlemek ve ısıyı azaltmak için fizyolojik tuzlu suyla temizleyin. Her ankraj vidasının koordinatında delme prosedürünü tekrarlayın. Şimdi steril forseps ve steril bir tornavida ile bir ila iki diş uzunluğunda derinliğe yerleştirilen ana kadar ankraj vidaları takın.

Sonra cOFM kılavuz ve sahte montajı kılavuz tutucuya monte edin ve tutucuyu stereotaktik çerçeveye takın. Kılavuz ucunu burr deliğinin üzerine yerleştirin ve yavaşça önceden belirlenen derinliğe dakikada 1 milimetre hızında indirin. Çimentolayıcı maddeyi ince, düz katmanlar halinde kafatasına uygulayın, cOFM kılavuzu ve vidalarının altındaki ve çevresini kaplayın.

Bir sonraki katmanı uygulamadan önce her katmanı sertleştirmek için diş kürleme ışığı kullanın. Çimento, kilitlenme kamasından kaçınırken bileşenler arasındaki tüm alanı kapladığından emin olun. Kılavuz tutucuyu cOFM kılavuzundan ayırın ve mikromanipülatörün DV düğmesiyle yavaşça kaldırın.

Forseps kullanarak, cOFM kılavuzundan ve dummy montajından kilitleme kamasını çıkarın. Kılavuzdan mankeni nazikçe çıkar. ML ve AP mikromanipülatör düğmelerini kullanarak şırınga infüzyon insert montajını cOFM kılavuzu üzerine hizalayın.

İnfuzyon girişini DV düğmesiyle indirin ve kilitleme kamasını forsepsle sıkıca tekrar takarak yerinde sabitleyin. Şimdi şırıngadan dakikada 1 mikrolitre ile 3 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin. cOFM kılavuzunun çevresini izleyerek hücre süspansiyon akışının montajdan çıkıp çıkmadığından emin olun.

Kilitleme kamasını kılavuzdan ve infüzyon insert montajından çıkarmak için forseps kullanın. Sonra DV ayar düğmesiyle infüzyon girişini kılavuzdan dikkatlice kaldırın. İt-çek boru hatlarını gaz geçirmez cam şırıngalarla yapay beyin omurilik sıvısı ile önceden doldurun.

Borunun peristaltik bölümünü mikroperfüzyon pompasının pompa başlığına takın. Perfüzyon torbasını Luer kilit konnektörü kullanarak itmeli boruya bağlayın. Sonra örnekleme insertini flanşlı konnektörlerle boruya bağlayın.

Daha uzun giriş milini itme borusunun çıkış ucuna, kısa çıkış milini ise çekme borusunun giriş ucuna bağlayın. Bağlı örnekleme insertini, 750 mikrolitre yapay beyinomurilik sıvısı içeren steril bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Fraksiyon toplayıcı iğnesini flanşlı boru konnektörü kullanarak çekme boru çıkış hattına bağlayın.

Sonra hava kabarcıklarını gidermek için dakikada 10 mikrolitre ile 20 dakika boyunca tüpü yıkama işlemi yapın. Sonra, gaz geçirmez şırıngalarla çekme boru hattını yapay beyin omurilik sıvısı ile önceden doldurun. Peristaltik boru mikroperfüzyon pompasının pompa kafasına yeniden takın.

Örnekleme insertini flanşlı boru konnektörleriyle tekrar bağlayın. Girişi çekme borusunun çıkış ucuna, çıkışı ise çekme borusunun giriş ucuna bağlayın. Inserti, 750 mikrolitre yapay beyinomurilik sıvı içeren steril bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.

Hava kabarcıklarını temizlemek için dakikada 10 mikrolitre hızında 20 dakikalık bir tüp sistemi yıkaması daha yapın. Anestezi altında bir hayvanı uygun boyutta bir cekete yerleştirin. Ön uzuvları kol deliklerinden tamamen geçirin ve ceketi hayvanın sırtına sıkıca sabitleyin.

Kılavuz ve sahte montajdan kilitleme kamasını çıkarmak için bir çift forseps kullanın. Sonra dikkatlice mantal inserti kılavuzdan çıkar. Örnekleme insertini kılavuza nazikçe takın ve kilitleme kamasını tekrar takın.

Hayvanı anesteziden çıkarıp döner kafes sistemine yerleştirin. Kafes trafını hayvan ceketine takın ve döner kafes sistemini aktive edin. cOFM örneklemesini tamamladıktan sonra, dönen kafes sistemini devre dışı bırakın ve kafes bağını hayvan ceketinden ayırın.

Şimdi forseps kullanarak kilitleme kamasını kılavuz ve örnekleme insert montajından çıkarabilirsiniz. Örnekleme insertini dikkatlice kılavuzdan çıkarın, sonra dummy insert'i nazikçe kılavuza geri yerleştirin ve kilitleme kamasını tekrar takın. Hayvan ceketinin arkasındaki bağlantı elemanlarını çıkarın ve ceketi hayvandan nazikçe çıkarın.

Biyolüminesans görüntüleme, cOFM rehberli tümör hücresi nakleti olan hayvanlarda tümör varlığını doğruladı. cOFM örneklenmiş interstisiel sıvının proteomik ana bileşen analizi, temozolomid ile işlenmiş ve dimetil sülfoksit ile işlenmiş hayvan grupları arasında belirgin bir ayrım olduğunu ortaya koydu. Küresel metabolom sinyal dağılımları, temozolomid ve dimetil sülfoksit örnekleri arasında neredeyse mükemmel şekilde örtüşüyordu.

Sinyal örtüşmesine rağmen, metabolomik volkan analizi belirgin bir temozolomid kaynaklı bir değişim ortaya koydu. Aynı hayvanlardan alınan metabolomik değerlerin nicel karşılaştırmaları, dolaşımda yapılan konfigürasyonların analit konsantrasyonlarını iyileştirirken göreceli metabolit oranlarını koruduğunu göstermiştir. Beyin tümörü mikroçevresindeki göreli besin bulunabilirliği hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır.

Bu protokol bu boşluğu kapatmak için kullanılıyor. Tümör mikro ortamında besin bulunabilirliği ve sinyalizasyonun karakterizasyonu, glioma ilerleme mekanizmalarını ve tedaviye adaptif direnç süreçlerini aydınlatabilir.