Erken Kanser Tespitinde Kişiselleştirilmiş Protein Korona Profilleme için Standartlaştırılmış SDS-PAGE İş Akışı

Nanopartiküllerin kanla nasıl etkileşime girip erken kanser belirtilerini ortaya çıkarmasını inceleyerek basit tekrarlanabilir ve öncelikle invaziv olmayan bir tanı testi hedefliyoruz. Başlangıç olarak, grafen oksit nano tabakalarının mililitrede dört miligramlık stok çözeltisini ultrasaf suda istenen konsantrasyona seyreltin. Sulandırılmış çözeltiyi %28 genlikte iki dakika boyunca sekiz saniye açık ve altı saniye kapalı darbe ayarıyla sonikle yapın; böylece eşit dispersiya sağlanır.

Dağılmış çözeltinin konsantrasyonunu ultraviyole görünür spektroskopiyle nicelikle ölçün. Daha sonra 633 nanometrelik helyum neon lazeriyle dinamik ışık saçılması kullanarak çözeltinin hidrodinamik boyutunu ve zeta potansiyelini ölçün. Örneği QVet tespit sınırlarına göre ultra saf suya salın.

Sonra, ticari liyofilize insan plazmasını gerektiği gibi ultrasaf suyla seyreltin. Yeniden oluşturulmuş plazmayı 18.620 G'de 15 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Üstten toplayın ve daha fazla kullanana kadar eksi 80 derece Celsius sıcaklığında saklayın.

Şimdi, protein konsantrasyonunu bicinchoninic asit testiyle niceleştirerek plazma seyreltmesini ayarlayın ve optimal nanopartikül/plazma oranını belirleyin. Seçilen nanopartikül hacmini plazmayla karıştırarak ikisi arasındaki hedef oranı elde edin. Karışımı 37 derece Celsius'ta bir saat kuluçka yapın.

Protein koronasını izole etmek için, nanopartikül plazma örneklerini 18.620 G'de dört derece Celsius'ta 15 dakika boyunca santrifüjlendirin. Ortaya çıkan peleti 200 mikrolitre ultra saf suyla yıkayın. Sonra tekrar askıya alın ve tekrar santrifüj yapın.

Son yıkamadan sonra, nanopartikül protein kompleksi izolasyonunun kanıtı olarak kompakt bir peletin varlığını doğrulayın. Sonra, indirgenç madde, yükleme tamponu ve suyu karıştırarak hesaplanan yükleme tamponu hacmine ulaşın. Pelleti hazırlanmış yükleme tamponu içinde yeniden askıya alın.

Sonra süspansiyonu 100 derece Celsius'ta 10 dakika kaynatın. Kaynatılmış örneği 18.620 G'de dört derece Celsius'ta 15 dakika boyunca santrifüjlendirin. Süpernatantı yeni bir tüpte toplayın.

Şimdi, lekelenmemiş tampon ile moleküler ağırlık standardını seyrelerek protein merdiveni hazırlayın. 10 x Tris-Glycine-SDS koşarak tampon bir x konsantrasyona kadar seyreltin. Elektroforez odasını dört ila %20 leke serbest gradyan jel kullanarak monte edin.

Sonra üreticinin belirttiği seviyeye ulaşana kadar çalıştırılan tamponu döker. Her kuyuya 10 mikrolitre örnek yükleyin. Sonra her kuyuya yedi mikrolitre merdiven pipetleyin.

Jeli oda sıcaklığında yaklaşık 90 dakika boyunca 150 voltta çalıştırın. Jel görselini scriptlerle aynı klasörde bir tiff dosyası olarak sakla. Sonra açık jel işleme.

MATLAB'dayım. Jel görselinin adını görsel adı olarak girin. Sonra bir merdiven yolunun indeksini işaret olarak girin.

Senaryoyu çalıştır. Adımların tamamlandığı komut penceresinde gösterilecek ve ekranda dört pencere açılacak. Şimdi, üst kısımda orijinal jel görüntüsünü ve alt kısımda eğik şerit etkisini düzeltmesini içeren şekil bir'i açın.

Düzeltme parametrelerini ayarlamak için sol düzeltme ve sağ düzeltme değerlerini değiştirin. Açık Şekil İki. Üstte eğik şerit efekti için düzeltilmiş görüntü ve altta arka plan çıkarılmış görüntü yer alır.

Arka plan kaldırma ayarları için scriptte BKG par X değerini ayarlayın. Tanımlanan tüm şeritlerin Şekil İki'de dikey beyaz çizgiler olarak gösterildiğini gözlemleyin. Şimdi, sol tarafta tespit edilen zirvelerle ve sağda R kare değeri olan doğrusal olmayan uyum içeren marker şeridinin yoğunluk profilini içeren Şekil Üç'ü açın.

Merdiven şeridindeki beklenen bant sayısının, montaj prosedürü için kullanılan tespit edilen zirvelerin sayısıyla eşleşip eşleşmediğini iki kez kontrol edin. Sonra, jelde tespit edilen tüm şeritlerin normalleştirilmiş yoğunluk profillerini içeren Şekil Dört'ü açın. Bir Excel dosyasındaki moleküler ağırlıkların fonksiyonları olarak yoğunluk profillerini dışa aktarmak için ihracat parametresini bir olarak ayarlayın.

Senaryoyu çalıştır. Tamamlandıktan sonra, çalışma klasöründe mutlak ve normalize profilleri moleküler ağırlık fonksiyonları olarak ilk sütunda içeren bir Excel tablosu oluşturulur. Sonra gel profillerini aç ve script'i çalıştır.

Ekranda dört pencere açılacak. Her şerit için üstteki mutlak yoğunluk profillerini ve alttaki karşılık gelen toplam yoğunlukları içeren Açık Şekil Beş. Ve her şerit için normalleştirilmiş yoğunluk profillerini içeren Şekil Altıncı.

Moleküler ağırlık ekseni, alfabede reg olarak belirtilen aralıklara göre alt bölünmüştür. Mutlak ve normalleştirilmiş integral alanları dışa aktarmak için ihracat verisini bire ayarlayın. Senaryoyu çalıştır.

Tamamlandıktan sonra, çalışma klasöründe belirtilen moleküler ağırlık aralıklarında dışa aktarılan mutlak ve normalize edilmiş alanları içeren bir tablo oluşturulur. Son olarak, Figure Seven ve Eight'i açın. Her şerit için mutlak ve normalleştirilmiş alanların histogramını, sırasıyla şerit ve alana göre gruplanmış olarak içerirler.

Burada sunulan protokol, plazma ile kuluçkadan sonra nanopartiküller üzerinde oluşan protein koronasının izole edilmesi ve karakterizelenmesi için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir iş akışı oluşturur. Bu yöntem, her kişiselleştirilmiş koronanın biyolojik anlamlı ve tanısal olarak ilgili özelliklerini yakalayabilen son derece tutarlı SDS sayfa profilleri sunar. Tüm koşullar için elde edilen SDS sayfa profilleri oldukça tekrarlanabilirdi.

Plazma konsantrasyonlarının %50'den %50'ye yükselmesi, SDS sayfa profillerinin 30 ila 80 kilodalton bölgesinde daha güçlü sinyal yoğunluklarına yol açtı. Otomatik pipetleme iş akışı neredeyse aynı elektroforetik profiller sağladı. Grafen oksit, yüksek yüzey alanı ve yüklü özellikleri nedeniyle tutarlı olarak iyi çözülmüş stabil korona profilleri üretmiştir.

Küçük, orta ve büyük Grafen oksit örneklerinin boyut dağılımları dar, örtüşmemiş ve sırasıyla 100, 300 ve 750 nanometre civarında yoğunlaşmıştır. Grafen oksit üzerinde oluşan protein Corona'ların SDS sayfa profilleri boyutlar arasında benzerdi. Farklı seyreltmeler arasında belirgin farklılıklar gözlemlense de, düşük plazma konsantrasyonları belirli moleküler ağırlık aralıklarında daha yoğun bantlar oluşturdu ve bu da seçici protein zenginleşmesini gösteriyordu.

Ara plazma seyreltmelerinde, yoğunluk metrik profilleri, özellikle PDAC örneklerinin sinyal yoğunluğunun azaldığı 20 ila 30 kilodalton bölgesinde hastalık spesifik farklılıkları ortaya koydu. SDS sayfa tabanlı profilleme modeli tek başına hem PDAC hem de kontrol örneklerini %83 doğrulukla ve dengeli hassasiyet ile özgüllükle tanımladı. SDS sayfa korona profillerini ve CA 19 ile dokuz seviyeleri içeren birleşik tanı modeli, PDAC hastalarını sınıflandırmada en yüksek doğruluk, hassasiyet ve özgüllüğü sağlar.

Kanser tanı araştırmalarını ilerletmek için otomatik iş akışı, teknoloji tabanlı olmayan teknikler ve yapay zeka odaklı araçlar kullanıyoruz. Protokolümüz hızlı, kullanıcı dostu ve WHO uyumlu olup, güçlü tanısal önemi olan standartlaştırılmış tekrarlanabilir protein korona parmak izlerini garanti altına almaktadır.