Beyin Organoidleri Kullanılarak Mitokondriyal Hastalığın Modellenmesi: Mitokondriyal Ensefalomiyopati, Laktik Asidoz ve İnme Benzeri Epizodlara Odaklanma

Araştırmamızın kapsamı, mitokondriyal hastalık ölçerlerini anlamak ve bunu tedavi edecek ilaçlar bulmaktır. Zorluk, teknikte organoid oluşumu olmasına rağmen yüksek verimli testler kapasitesini korumaktır. Başlangıç olarak, ortamı yaklaşık %70 ila %80 birleştiğinde indüklenmiş pluripotent kök hücre kültür plakalarından çıkarın.

Hücreleri PBS ile yıkayın. Hücrelere 350 mikrolitre enzim çözeltisi ekleyin ve kuluçka yapın. Reaksiyonu durdurmak için 800 mikrolitre kök uyum malzemesi ekleyin.

Hücre süspansiyonunu yeni bir tüpe aktardıktan sonra, 190G'de 22 derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüj yapın. Sonra, pelleti bir mililitre farklılaştırma ortamında tekrar askıya alın. Hücreler sayıldıktan sonra, 3000 hücreyi 100 mikrolitre içinde U şeklindeki 96 kuyu düşük bağlantı plakasının her kuyusuna tohumlayın.

Altı gün boyunca 37 derece Celsius'ta, %5 karbondioksit ile kuluçka yapın. İnkubasyon sonrası, organoitleri 96 kuyu plakasından 10 santimetre bir tabağa aktarmak için geniş delikli pipet kullanın. Yeni bir 96 kuyruklu plakanın her kuyusuna 50 mikrolitre takviyeli DMEM/F12 ortamı pipetleyin.

Organoidleri iki mililitrelik tüplere toplayın. Organoidleri aspire etmeden ortamı dikkatlice çıkarın ve 1,5 mililitre takviyeli DMEM/F12 ortamı ekleyin. Son yıkamayı pipetledikten sonra 500 mikrolitre taze ortam ekleyin.

Sonra organoidleri 10 santimetrlik bir kaba aktarın. Her organoidi seçmeyi kolaylaştırmak için beş mililitre orta madde ekleyin. Tüm organoidleri 96 kuyuluğa ait bir plakanın her kuyusuna 50 mikrolitre ayarlanmış bir mikro pipet ile aktarın ve üç gün kuluçka yapın.

Dokuzuncu günde, organoid kutuları iki mililitrelik tüplere topla ve DMEM/F12 ile üç kez yıkayın. Sonra organoidleri diferensiya ortamında yeniden askıya alın. Her kuyu başına yaklaşık 10 organoidi altı kuyu bir plakaya aktarın ve her kuyudaki son ortam hacmini iki mililitre ayarlayın.

Plakayı %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta altı gün boyunca statik olarak kültürleyin. 15. günde, organoidleri 15 mililitrelik tüplere toplayın. Tüplerin yerleşmesini bekledikten sonra, süpernatantı pipetledikten sonra B27 ve A vitamini takviyesi olan taze farklılaşma ortamı ekleyin.

Her kuyu başına yaklaşık 10 organoidi altı delikli bir plakaya aktarın. Organoidi 15 gün boyunca 37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit ile statik olarak kültürleyin. Kültür plakalarını seyreltilmiş poli-L-Ornitin çözeltisi ile kaplayın.

Plakaları gece boyunca 37 derece Celsius'ta kuluçkaya geçirin. Ertesi gün, kuyuları üç kez, her biri beş dakika boyunca PBS ile yıkayın. Şimdi kuyulara seyreltilmiş laminin çözeltisi ekleyin.

Plakaları 37 derece Celsius'ta üç saat boyunca veya gece boyunca kuluçka edin. Organoid süspansiyonu 200G ile beş dakika boyunca santrifüjleyin. Üst maddeyi çıkarın ve bir mililitre enzim çözeltisi ekleyin.

İyi karıştırın ve santrifüjden önce 37 derece Celsius'ta beş dakika kuluçka yapın. Süpernatant çıkarıldıktan ve bir mililitre dispersyon çözeltisi eklendikten sonra, izolasyon çözeltisini dikkatlice süspansiyonun altına katmanlayın. Sonra süspansiyonu 200G ile beş dakika boyunca santrifüjlendirin.

Şimdi, bir mililitre nöronal ortamı tüpe pipetleyin. Çözeltiyi karıştırın ve süspansiyonu 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin ve 50 mililitrelik bir tüpe geçirin. Hücreler sayıldıktan sonra, hücre süspansiyonunu poli-L-Ornitin ve Laminin kaplamalı plakalar üzerine 100.000 hücre yoğunluğunda inceleyin.

60. güne kadar her dört ila yedi günde bir ortamı değiştirin. Organoidleri immünoflüoresans için sabitlemek için önce organoidleri mikro tüplere alın. Organoidleri PBS ile durulayın, sonra organoidleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4 Paraformaldehit ile sabitleyin.

Fiksasyondan sonra, sabit organoidleri PBS ile üç kez yıkayın. Organoidleri kullanılana kadar dört derece Celsius sıcaklığında sakla. 2D nöron kültürü için tohumlandıktan 30 gün sonra, kültür ortamını plakalardan çıkarın.

Sonra hücreleri PBS ile yıkayım. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 Paraformaldehit ile sabitleyin. Paraformaldehiti pipetleyin, ardından hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.

Sabit hücreleri dört derece Celsius sıcaklığında saklanır ve kullanılır. RTQPCR için organoidleri toplamak amacıyla, organoidleri mikro tüplere aktarın. Organoidleri yıkamak için tüplere PBS pipetle.

Şimdi, organoidlere 350 mikrolitre liz tamponu ekleyin, ardından sıvı azotta dondurun. Tüpleri kullanana kadar eksi 80 derece Celsius sıcaklıkta sakla. FOXG1 pozitif nöronlar içeren beyin organoidleri, sağlıklı kontrol IPSC hattı 414C2'den 30. günde başarıyla indükte edildi ve 60. günde 2D kültürlenmiş sinir ağları elde edildi.

M.3243A'dan G'ye kadar olan varyantın heteroplazmi seviyeleri QPCR tarafından doğrulandı. İkinci ile sekizinci hatlarda düşük heteroplazmi vardı, ikinci ile altıncı hatlarda ise yüksek heteroplazmi vardı. Düşük heteroplazmi çizgisi ikiden sekize kadar olan beyin organoidleri, sağlıklı kontrollere benzer boyutlar ve morfolojiler sergilemiştir.

Yüksek heteroplazmi çizgisi ikiden altıya kadar üretilen organoidler, 0,3 milimetrekare azalmış boyut ve düzensiz morfolojiye sahip, dairesellik değeri 0,82 göstermiştir. 414C2 hattından ve ikiden sekize kadar olan hatlardan indüklenen çoğu nöron 30 ve 60. günlerde FOXG1 pozitifti. FOXG1 pozitif nöronlar nadiren organoidlerde veya iki ila altı hattından türetilen 2D kültürlü nöronlarla tespit edildi.

Sonuçlarımız, hasta kaynaklı IPSC tabanlı organoid modellerin, aynaları, mekanizmaları incelemek ve ilaç taraması için faydalı bir platform oluşturduğunu göstermektedir. Kısa kültür süresi ve maliyet etkinliği ile geleneksel yöntemlerimiz, MELIS'in patofizyolojisini araştırmak için pratik araçlar sunar. Gelecekte organize edilen hasta teslimatlarıyla birlikte MELIS için potansiyel ilaçları aramak istiyoruz.