CD63-GFP Raporlayıcı Fare Modeli Kullanılarak Adipositten Türetilen Ekstraselüler Vezikül Salgısının Karakterizasyonu In Vivo ve In Vitro

Adipositten türetilen ekstraselüsel veziküller olan EV'leri, özellikle olgun adipositler ile öncül hücreleri arasındaki çapraz iletişimi nasıl düzenlediklerini tanımlamak için inceliyoruz. Şu anda adiposit EV salgılarını inceleyecek in vivo sistemler yoktur ve mevcut arıtma protokolleri henüz tam olarak optimize edilmemiştir. Başlamak için, ötenanize edilmiş farelerden inguinal yağ dokusunu steril bir yöntemle çıkarabilirsiniz.

Bir gram doku, içinde 0,5 mililitre sindirim tamponu içeren iki mililitre tüpe yerleştirin. Steril makas kullanarak, dokuyu bir milimetreden büyük olmayan parçalara indirin. Kıyılmış dokuyu mililitrede 0,5 miligram Liberaz ve 50 birim DNaz içeren 10 mililitre sindirim tamponu içinde askıya alın. Örneği 37 derece Celsius sıcaklığında bir orbital sallayıcıda kuluçka yapın.

İnkubasyon sırasında tüpü birkaç kez nazikçe ters çevirin. Çözelti bulanık göründüğünde ve görünür doku parçaları kalmadığında, sindirim tamamlanmış olur. Stromal vasküler fraksiyonu (SVF) izole etmek için, sindirilmiş süspansiyonu iki hacim sindirim tamponu ile seyreltirin.

Tüpü nazikçe üç-dört kez ters çevirerek iyi karıştırın. Süspansiyonu steril bir 100 mikrometrelik filtreden geçirerek sindirilmemiş dokuyu çıkarın, ardından filtratı 300g ile beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Pelleti SVF olarak etiketleyin.

Stromal damar fraksiyonunu taze hazırlanmış kırmızı kan hücresi lizis tamponu içinde buz üzerinde, ışıktan korunarak beş dakika boyunca kuluçka edin. İki hacim yıkama tamponu ekleyin ve 400g sıcaklığında dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüj yapın. Stromal damar fraksiyonunu doku başına 80 mikrolitre tampon ile yeniden süzülün ve içeriği yeni bir tüpe aktarın.

Her gram doku için 20 mikrolitre adiposit olmayan öncül deplasyon kokteyli ekleyin. Örneği karanlıkta iki ila sekiz derece Celsius sıcaklığında 15 dakika kuluçka edin. Örneği bir LS sütunundan geçirin ve soy negatif hücre fraksiyonunu içeren akışı toplayın.

Akışı 300g sıcaklığında beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjle ederek adiposit öncül hücreleri elde edilir. İzole fare adiposit öncü hücrelerinden 250 mikrolitreyi kollajen kaplı sekiz delikli slaytlara altı saat boyunca kuluçka yapın. Hücreleri görüntüleme için hücresel ve ekstraselüler vezikül yapılarını korumak amacıyla 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin.

Sonrasında slaytları PBS ile üç kez yıkayıp anti-fade ortamla monte edin. Sonra, adiposit öncül hücreleri sayıldıktan sonra onları askıya alın ve canlılık boyasını seyreltin. Buz üzerinde 20 dakika kuluçka, ışıktan korunarak inkubasyon yapın.

Hücreleri yıkama tamponu ve santrifüj ile bir kez yıkayın. Hücreleri parlak boyama tamponunda askıya alın, böylece nihai konsantrasyon 100 mikrolitre 1 milyon hücre olur. Spesifik olmayan bağlanmayı bire 100 oranında Fc reseptör bloklayıcı reaktif ekleyerek engelleyin ve inkübe yapın.

SCA-1 antikorunu 6000g boyunca 10 dakika boyunca dört derece Celsius'ta serbest spin yapın. SCA-1 antikorunu APC tüpüne 1-100 seyreltme ile ekleyin, ardından tüpü ışıktan korunarak buz üzerine koyun. Hücreleri bir mililitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, ardından 300g üzerinde beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın.

Hücreleri akış sitometrisi sıralaması için yıkama tamponunda askıya alın, ardından SCA-1 pozitif ve GFP pozitif hücreler için verileri mor ve mavi lazerle donatılmış spektral akış sitometresinde alın. Farklılaştırmaya başlamak için, yemekleri %0,2 jelatinle kaplayın, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca. Taze izole edilmiş APC'leri takviyeli DMEM/F12 ortamında tohumlayın ve birleşene kadar kuluçka yapın.

Birinci günden sekizinci güne kadar olan ortamı MesenCult adipojenik farklılaştırma ortamı ile değiştirin. Dokuzuncu günde, adipositleri iki kez PBS ile yıkayın, ardından ortamı DMEM, %1BSA ve %0,2 Primosin içeren olgun adiposit kültür ortamı ile değiştirin. Adiposit salgılanan ekstrasellüler vezikülleri izole etmek için önce 15 mililitre kültür ortamını 40 mikrometrelik filtreden geçirin, ardından 30 mikrometrelik bir filtre ile geçirilir.

Filtratı 500g ile beş dakika santrifüjleyin, ardından 2000g ile süpernatantı 10 dakika santrifüjle ederek kalan hücreleri ve kalıntıları çıkarabilirsiniz. Ortaya çıkan süpernatantı 0,8 mikrometrelik bir filtreden geçirip filtratı 15 mililitrelik bir ultrafiltrasyon ünitesine aktardıktan sonra, ortamın konsantre olması için 4000g üzerinde 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Konsantre örneği, otomatik fraksiyon toplayıcıya bağlı bir boyut dışlama kromatografi kolonuna yükleyin ve F1'den F8.To'e kadar olan fraksiyonları toplayın, Western blot analizi yapın, her fraksiyonu 400 mikrolitre kadar 25 mikrolitre kadar yoğunlaştırın.

Konsantreye 50 mikrolitre radyo immünopresipitasyon testi tamponu ve proteaz ile fosfataz inhibitörleriyle desteklenerek pipetleyin. Numuneyi denatüre etmek ve proteinleri çözmek için 75 mikrolitre iki adet 2X SDS yükleme tamponu ekleyin; bu da %4 ila %12 Tris-Glisin jelinde proteinleri çözer. Nanopartikül takip analizi için, hücre dışı vezikül örneklerini 0.1 mikrometre filtrelenmiş steril PBS ile seyreldin ve nazikçe karıştırın.

Sulandırılmış örneği, yüksek hassasiyetli bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera ve 532 nanometrelik yeşil lazerle donatılmış NTA cihazına yükleyin. 10 nanometre ile 1.000 nanometre arasındaki parçacıklar için tespit ayarlanır ve 10 konsantrasyon ile 6 ila 10 ile 9 partikül mililitre gücünde bir konsantrasyon için. Stop-flock-flock/CD63GFP farelerinden alınan yağlı progenitor hücrelerde, konfokal mikroskopide tespit edilebilir yeşil floresan protein puncta bulunmamıştır.

AdipCD63 farelerinden alınan hücreler ise sitoplazma boyunca çok sayıda belirgin yeşil floresan protein noktası gösterdi. Akış sitometrisi analizi, raporlayıcı farelerde kafatası 1 pozitif hücrelerin %1,2'sinin yeşil floresan protein ifade ettiğini, AdipCD63-GFP farelerinde ise %12,6'nın olduğunu gösterdi. Boyut dışlama kromatografi fraksiyonlarının Western blotlaması, ekstraselülük vezikül belirteçleri CD63 ve HSP70'in F1 ve F2 fraksiyonlarıyla zenginleştiğini gösterdi. Endoplazmik retikülum ve mitokondri belirteçleri yoktu, bu da vesik saflığı doğruladı.

Nanopartikül takip analizi, adipositten türetilen hücre dışı veziküllerin boyutlarının 50 nanometreden 500 nanometreye kadar değiştiğini ortaya koydu ve iletim elektron mikroskobu veziküllerin sağlam çift zar yapıları sergilediğini doğruladı. Western blot, adipositlerde STX4'ün nakavt olduğunu doğruladı. Konfokal mikroskopi, CD63-GFP pozitif veziküllerin vahşi tip adipositlerde sitozol boyunca dağıldığını, ancak STX4 knockout adipositlerinde plazma zarının yakınında biriktiğini gösterdi.

STX4 nakatlantlı adipositlerde salgılanan adiposit dışı veziküllerin konsantrasyonu, yabani tipe kıyasla anlamlı şekilde azalmıştır. Hücre içi veziküllerin eşit protein miktarlarının western blot'u, STX4 nakatlant adipositlerde CD63 ve CD81'in vahşi tipe kıyasla daha düşük ekspresyonunu gösterdi. Protokol, adiposit EV salgılanmasını in vivo ve in vitro incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir sistem ile optimize edilmiş bir adiposit EV arıtma yöntemi sağlar.

Protokol, olgun adipositlerden türetilen EV'lerin arındırılması için seri düşük hızlı santrifüjlerin boyut dışlama kromatografisi ile birleştirilmesini ilk kez tanımlıyor ve doğrulamaktadır. Bulgularımız, adipositlerin fizyolojik ve patolojik koşullarda diğer hücre tipleriyle iletişim kurmak için ekstraselük vezikülleri nasıl kullandığına dair yeni sorular sormamıza olanak tanıyor.