İçsel Kontrast kullanarak DNA moleküllerinin spektroskopik süper çözünürlüklü görüntülemesi

Araştırmamız, DNA moleküllerinin içsel floresan spektrumlarının ölçülmesi için ilk protokolü sunar ve bu protokol, onların doğal optik özellikleri ve dizi doğrulama ile ilgili özelliklerinin araştırılmasını mümkün kılar. Bu protokol, DNA spektroskopik görüntüleme için endogen floresansı kullanır ve mevcut yöntemlerde etiketleme kaynaklı bozulma, bağlantı hatası ve tutarsız etiketlenmiş yoğunluktan kaçınır. Başlamak için, DNA örneğini nükleazsız deiyonize suda son konsantrasyona 100 milimolar olarak çözebilirsiniz.

Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini en aza indirmek için DNA stok çözeltisinden beş mikrolitre alikot hazırlayın. Stok çözelti içeren ekstra tüpleri 4 derece Celsius'ta sakla. Laboratuvar mendiliyle cam slaytı nazikçe temizleyin.

100 milimolar DNA çözeltisinden beş mikrolitre pipetleyin ve yeni temizlenmiş cam slayta alın ve numuneyi bir ila üç saat boyunca kurutarak DNA jeli oluşmasına izin verin. Bir duman davlumbazında, DNA moleküllerinin stokastik foto değişimini desteklemek için beta-merkaptoetanol tamponu veya DABCO görüntüleme tamponu hazırlanır. Görüntüleme tamponundan beş mikrolitre pipetleyin DNA jeline ve örneğin üzerine bir kapak kallağı yerleştirin.

Örtülü numunenin içinde baloncuklar varsa, onları çıkarmak için cımbız kullanın. 100 nanometre çapında delikler içeren, dört mikrometre aralıklı, sekiz sıra ve beş sütun halinde düzenlenmiş üretilmiş bir nanodelik dizisi elde edin. sSMLM sistemini açın ve kameranın önüne dar bant genişliği filtreleri yerleştirin.

Kalibrasyon örneğini mikroskop altına koyup mikroskop lambasını açıp örneği aydınlatın. Tüm filtreler için pozlama süresini 200 milisaniyeye ayarlayın, ancak 750 nanometre filtre için 2.000 milisaniyeye değiştirin. Her filtre için kare sayısını 10'a ayarlamak için hızlı zaman geçişi ve hızlı zaman geçişine gidin.

Kalibrasyondan sonra, DNA jel örneğini mikroskop aşamasına yükleyin, kapak tarafı objektîfe bakacak şekilde ve veri toplamak için kamera yazılımını açın. Otomatik odak takip sistemiyle uygun Z konumunu belirleyin ve net stokastik yanıp sönmeleri görünene kadar odaklığı ayarlayın. Objektifin kapak kayma kenarına dokunmadığından emin olun, böylece tamponun daldırma yağına sızmasını ve izleme ile ilgili müdahaleyi önleyin.

İstenilen aydınlatma gücü ve 30 milisaniye pozlama süresiyle yaklaşık 10.000 ila 30.000 kare elde edin. Veri edindikten sonra, yazılımın verileri varsayılan olarak nd2 formatında kaydetmesine izin verin. Cam kaydırağı, kırık cam veya keskin nesneler için belirlenmiş onaylı bir çöp kutusuna atın.

Kalan tüm tamponları kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak belirlenen kimyasal sıvı atık konteynerine attır. Fiji'yi açın ve DNA örneğinin alınan ham görüntü yığınını yüklemek için bio formatlar eklentisini kullanın. Image ve ardınca stacks, Z Project seçin ve ham görüntü yığının minimum projeksiyonunu oluşturmak için minimum yoğunluk türü olarak projeksiyon türü seçin.

Görüntü hesaplayıcısını seçin ve ham görüntü yığınından minimum projeksiyonu çıkarın. Arka planda çıkarılan veri setini spektral analiz için bir TIF dosyası olarak kaydedin. Sonra, ThunderSTORM eklentisi 1.3 sürümünü kullanarak sıfırıncı dereceden ham görüntü yığınında yerelleştirme tanımlaması gerçekleştirin.

Eşiği standart sapma dalgasının 1,2 katına ayarlayın. F1, yarıçapı üçe ve sigma'yı 1.5'e uydurarak sıfırıncı dereceden görüntüyü yeniden inşa eder ve emisyon olayı koordinatlarını çıkarır. Kırpılmış sıfırıncı dereceden ham resim yığını için eklentiyi ve ardından ThunderSTORM'u seçin ve analizi çalıştırın.

Fiji ve açık kaynak yazılımı RainbowSTORM'u kullanarak kalibrasyon verilerini işleyip yatay ve dikey kaymalar ile dalga boyları arasındaki ilişkiyi elde edin. ThunderSTORM eklentisini kullanarak beş dalga boyunun kalibrasyon görüntülerinde yerelleştirme tanımlaması yapılabilir. Eşiği standart sapma dalgasının beş katına ayarlayın.

F1, yarıçapı üçe ve sigma'yı 1.5'e ayarlayarak sıfırıncı derecede nanodelik lokalizasyonlarını ve birinci derecedeki karşılık gelen spektral lokalizasyonları yeniden inşa eder. Her kalibrasyon verisinin ortalama bir görüntüsünü elde edin ve eşiği standart sapma dalgasının beş ila on katı aralığında ayarlayın. Her kalibrasyon görüntüsü için F1'den 80'e kadar lokalizasyon elde edilir.

RainbowSTORM'u çalıştırın ve her kalibrasyon dalga boyu için CSV dosyalarını yüklemek için spektral kalibrasyon altına tıklayın. Sonra kalibrasyon dosyasını kaydetme seçeneğine tıklayın ve kalibrasyon dosyasını kaydedin. Tam spektrum verilerini çıkarmak için özelleştirilmiş Python script sürüm 3.11.7 kullanın.

Sonra, önceki arka plan çıkarma adımından TIF formatında arka plan çıkarılmış resim yığını için Python betikinde doğru dosya yollarını ayarlayın. Yerelleştirme analiz aşamasından üretilen yerelleştirme CSV dosyası için dosya yolunu ve kalibrasyon aşamasından oluşturulan kalibrasyon dosyasını MAT formatında ayarlayın. Daha sonra, 532 nanometre DWP ile elde edilen 532 nanometre veri için yatay kaymayı 925 ila 984 piksele ayarlayın; bu veriler 525 ila 750 nanometre spektral pencereye karşılık gelir ve 590 ila 650 nanometre filtre aralığının ötesine geçer.

RainbowSTORM kullanılarak elde edilen spektral kalibrasyon eğrisine göre hem 488 nanometre hem de 532 nanometre veriler için hem 488 nanometre hem de 532 nanometre veri için dikey kaymayı 23 piksele ayarlayın. Son olarak, sonraki karşılaştırma ve sınıflandırma analizi için üçüncü dereceden polinom uyumu kullanarak doğrusal olmayan spektrumu doğrusal hale getirin. Spektral kalibrasyon gerçekleştirildi ve sıfırıncı derece ile birinci dereceden görüntüler arasındaki yatay ve dikey piksel kaymalarının ölçülmesini sağladı.

Bu, piksel konumu ile dalga boyu arasında bir kalibrasyon eğrisinin eşlenmesine olanak sağladı. 532 nanometre uyarımında doğrusal olmayan ve dönüştürülmüş lineer emisyon spektrumları, çift zincirli DNA molekülü türüne atıfta bulunan GC alter için elde edilmiştir. Yeşil eğri ortalama spektrumu temsil ediyordu.

A10C10'un doğrusal olmayan ve dönüştürülmüş doğrusal emisyon spektrumları, tek zincirli DNA molekülü türü, ortalama spektrumu temsil eden mavi eğri ile 488 nanometre uyarma altında elde edilmiştir. Bu protokol, araştırmacıların sentezlenmiş tek ve çift zincirli DNA moleküllerinin içsel floresan spektrumlarını spektroskopik süper çözünürlüklü görüntüleme ile ölçmelerine olanak tanır. Doğru Z konumunu tam olarak belirlemek kritik öneme sahiptir, çünkü DNA jel örnekleri yapısal bilgiye sahip değildir ve stokastik yanıpışmaları gözlemlemek için dikkatli odaklanma gerektirir.

Gelecekteki çalışmalar, RNA ve proteinin içsel floresansını ölçmekte, dizi tahmini için hesaplamalı modelleri entegre etmek ve etiketsiz kromatin görüntüleme için de genişletilebilir.