In Vitro Düzenleyici T Hücrelerinin Fonksiyonel Analizi: Proliferasyon ve Farklılaşmaya Odaklanma

Laboratuvarımızda T hücresi alt kümesi farklılaşma, metabolizma ve etkileşim incelendi. Treg etkileri T hücresi çapraz sarkmasını sağlar, bağışıklık homeostazını korur ve bu da Treg araştırmalarını otoimmün ve inflamatuar hastalıkların tedavisinde kritik hale getirir. Geleneksel in vitro Treg baskılama testleri, Treg aracılı etkileri ve efektör T hücre farklılaşmasını göz ardı etmiştir.

Bu değiştirilmiş protokol, hem çoğalmayı hem de polarizasyonu aynı anda değerlendirir. Başlamak için, naif T hücreleri, düzenleyici T veya Treg zenginleştirilmiş hücreler ve antijen sunan hücre zenginleştirilmiş CD4 pozitif olmayan hücreler hazırlanır. Naif CD4-pozitif T hücresi süspansiyonunu 350G'de yedi dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjlenin ve süpernatantı atarak hücre pelletini elde edin.

Hücre proliferasyon boyası eFluor 450'yi PBS içinde seyreltirerek oda sıcaklığında 20 mikromolar konsantrasyon elde edin. Tüpteki yedi hücrenin gücüne her bir günde 0,5 mililitre PBS katı 10 çarpınca ekleyin. Tüpü yaklaşık 45 derece eğik tutun ve hücreleri 50 kez yukarı ve aşağı pipetle nazikçe yeniden süsleyin.

Sonra, hücre süspansiyonuna eşit hacimli hücre proliferasyon boyası çözeltisi ekleyerek nihai konsantrasyon 10 mikromolar elde edilir. Tüpü 45 derece açıyla tutun ve hücreleri hücre çoğalma boyasıyla iyice karıştırmak için pipetleyin. Aydın maruziyetini önlemek için santrifüj borusunu hemen alüminyum folyo ile sarın.

Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın ve hücrelerin toplanmasını önlemek için her beş dakikada bir nazikçe vorteks yapın. Sonra, santrifüj tüpüne 10 mililitre önceden soğutulmuş hücre kültürü ortamı ekleyin ve boyamayı sonlandırmak için hücreleri nazikçe girdablandırın. Sonra hücreleri santrifüj edin ve süpernatantı atın.

Hücreleri yıkamak için, hücre pelletine beş mililitre önceden soğutulmuş hücre kültürü ortamı ekleyin. Santrifüjasyonu tekrarlayın ve pelleti beş mililitre kültür ortamında tekrar askıya alın. Hücre sayımı tamamlandıktan sonra, hücreler santrifüj edilip uygun bir kültür ortamında yeniden süzülerek hücre konsantrasyonu iki kat 10 ile mililitrede altı hücre gücüne ulaşılır.

Tüpü buzda tutun. Hücre kültürü için gereken örnek sayısını hesaplayın. Mililitrede 2,5 mikrogram anti-fare CD3 antikoru veya uygun indüksiyon sitokinleri içeren uygun miktarda hücre kültürü ortamı hazırlayın.

Hazırlanmış naif T hücreleri ve Treg zenginleştirilmiş hücreleri alın ve vortex yapın. 48 kuyu tabakasına 100 mikrolitre CD45.2 pozitif, CD4 pozitif saf T hücresi ve 100 mikrolitre CD45.1 pozitif APC zenginleştirilmiş CD4 pozitif olmayan CD4 pozitif hücre ekleyin. CD45.1 pozitif, CD4 pozitif, CD25 pozitif Treg zenginleştirilmiş 100 mikrolitre hücreyi deneysel kuyulara ve 100 mikrolitre hücre kültürü ortamını kontrol kuyularına aktarın.

Daha sonra her kuyuya anti-fare CD3 antikoru içeren 100 mikrolitre kültür ortamı ve uygun indüksiyon sitokinleri içeren 100 mikrolitre kültür ortamı pipetleyin. Plakanın nemini korumak ve kenar etkilerini azaltmak için kalan boş kuyulara PBS ekleyin. 48 kuyu tabakasını %5 karbondioksit kuluçka makinesinde, 37 derece Celsius sıcaklıkta üç gün boyunca kuluçka yapın.

Kültürlenen hücreleri nazikçe pipetleyin, yeniden süspansiyon ve hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri santrifüjle yapın ve süpernatantı çıkarın. Her tüpte phorbol 12-mirisat 13-asetat, iyonomisin ve GolgiPlug protein taşıma inhibitörü içeren 500 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin.

Hücreleri nazikçe girdabla yeniden süspansiyona alın ve hücreleri 37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit kuluçka makinesinde üç saat boyunca inkubasyon yapın. Santrifüjlemeden sonra, pellete bir zombi sarı boya testi ve 1:100 seyreltilmiş anti-fare CD16 veya 32 antikor içeren 50 mikrolitre PBS ekleyin. Örnekleri girdabla soluk ve oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka geçirerek ölü hücreleri etiketleyin ve FC reseptörlerini blokleyin.

Hücreleri santrifüjle yapın, sonra süpernatantı atın. Numuneye 50 mikrolitre yüzey antikor kokteyli ekleyin, vortex yapın ve 20 dakika boyunca dört derece Celsius sıcaklıkta inkübe yapın. Sonra her santrifüj tüpüne bir mililitre floresansla aktive edilmiş hücre ayırma veya FACS tamponu ekleyin.

Santrifüj ve süpernatan çıkardıktan sonra, her santrifüj tüpüne 300 mikrolitre fiksasyon ve permeabilizasyon çözeltisi ekleyin ve örnekleri girdablandırın. Örnekleri karanlıkta dört derece Celsius sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın. Her santrifüj tüpüne mililitre permeabilizasyon ve yıkama tamponu aktarılır, ardından santrifüj ve süpernatant çıkarımı yapılır.

Yıkamayı tekrarladıktan sonra, her numuneye 50 mikrolitre sitokin antikor kokteyli ekleyin ve örnekleri vortex yapın. Örnekleri dört derece Celsius sıcaklığında karanlıkta 40 dakika kuluçka edin. Her örneği bir mililitre geçirimlilik ve yıkama tamponu ile yıkayın.

Hücreleri santrifüjle yapın ve süpernatantı çıkarın. Hücre pelletini 300 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süzülür. Yanıt veren T hücrelerinin proliferasyonunu ve farklılaşmasını akış sitometrisi ile ölçün.

Lenfosit popülasyonunu toplam hücreler arasında kaptallayarak hücre kalıntılarını ve safsızlıklarını dışlayın. Lenfositler arasında tek hücre popülasyonunu saçılma sinyallerine göre seçin. Daha sonra tek hücreler arasında canlı hücre popülasyonunu, ardından canlı hücreler arasında CD4 pozitif T hücre popülasyonunu belirler.

Sonra, CD45.1 pozitif düzenleyici T hücresi zenginleştirilmiş popülasyonu ve CD45.2 pozitif efektör T hücre popülasyonunu CD4 pozitif T hücreleri arasında kapta alın. Daha sonra CD45.2 pozitif CD4 pozitif interferon gamma pozitif T yardımcı 1 hücreleri, CD45.2 pozitif CD4 pozitif interleukin-17A pozitif T yardımçı 17 hücreleri ve CD45.2 pozitif CD4 pozitif T hücreleri arasında CD45.2 pozitif CD4 pozitif T hücreleri seçilir. Tüm örnekler için akış sitometrisi veri toplama işlemi yapılacak.

Son olarak, akış sitometrisi verilerini, akış sitometrisi veri toplama yöntemiyle aynı geçiş stratejisini kullanarak FlowJo yazılımı ile analiz edin. Proliferasyonsuz yanıt veren T hücrelerinin sıklığı, düzenleyici T hücresi zenginleştirilmiş hücrelerle birlikte kültürlendikten sonra hem T yardımcı 1 hem de T yardımcı 17 indüksiyon koşullarında anlamlı şekilde artmıştır. CD45.2 pozitif, CD4 pozitif interferon gamma, pozitif T yardımcı 1 hücrelerinin farklılaşması, düzenleyici T hücresi zenginleştirilmiş hücrelerle birlikte kültür yapıldıktan sonra anlamlı şekilde bastırıldı.

CD45.2 pozitif, CD4 pozitif interleukin-17A pozitif T yardımcı 17 hücrelerinin sıklığı, yanıt veren T hücreleri düzenleyici T hücresi zenginleştirilmiş hücrelerle kültürlendiğinde arttı. Treg hücrelerinin in vitro fonksiyonel analizi, Treg ve efektör T hücreleri arasındaki biyoyönlü etkilerin proliferasyon ve polarizasyon üzerindeki incelenmesini sağlar. Bu protokolü uygularken en büyük zorluk, hücre canlılığını koruyarak Treg ve naif T hücrelerinin saflığını nasıl sağlamaktır.

Bu sürecin ardından ELISA ve diğer biyomedikal testler, sitokin ve metabolik efektör üretimini değerlendirebilirken, FACS sıralanmış hücreler ise aşağı akış RNA-dizisi ve proteomik analizini mümkün kılar.