Name: İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin, kromatin immünopresipitasyonu ile insan beyninde histon metilasyonu ve epigenetik düzenleyicileri haritalamak için kullanılan bu yöntemi. Normal ve hastalıklı beyinlerde gen ifadesinin mekaniksel temelini anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (5R01MH071476) bir hibe ile desteklenmiştir.

Prosedür: 1. Gün 1. Tampon Douncing 50-500 mg donmuş post-mortem gri madde doku homojenize edilir. ! DİKKAT! İnsan doku sıkı güvenlik koşulları altında itina ile ele alınması gerekir. BSL-2 ya da daha yüksek güvenlik standartları ele alınmalıdır. <ol><li> Önceden disseke, post-mortem beyin alın -80 ° C Douncing Tampon 5X beyin hacmi Dounce, ve 2.0 mL mikrosantrifüj tüp yer. Örnek eşleştirilmiş ve kontrol çiftleri eş zamanlı olarak işlenir. </li></ol> 2. Micrococcal Nükleazlar (MN) Sindirim <ol><li> Örnek Micrococcal nuclease 5U/mL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirmeden önce yukarı ve aşağı pipetleme çözüm içinde karıştırın. * KRİTİK ADIM - MN hatta 4 hareket etme yeteneği bu yana hızlı bir şekilde bu adımı önemlidir ° C&#39;dir </li><li> 37 7 dakika inkübe örnekleri ° C. </li><li> 7 dakika inkübasyondan sonra, MNase faaliyeti durdurmak için 10mM bir konsantrasyonu 0,5 M EDTA ekleyin. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol><li> Yeri örnekleri 15 ml şahin tüpe. 0.2mm EDTA, 1 / 2000 numune hacmi 0,2 M benzamidine ve 1 / 1000 0.1M phenylmethanesulphonylfluoride örnek hacmi (PMSF) 10X numune hacmi ekleyin. Son iki bileşikler proteaz inhibitörleri olarak kullanılır. * KRİTİK ADIM - Tüm bu aşamalar sırasında buz örnekleri tutmak için önemlidir. </li><li> Her 10 dakikada bir vorteks ise, 1 saat için örnek inkübe edin. </li><li> Saat süren inkübasyon sonunda, 1 / 2000 3M DTT örnek hacmi, henüz başka bir proteaz inhibitörü ekleyin. </li><li> Vorteks örneği bir kez daha ve 4 ° C&#39;de 10 dakika için 3175 RCF santrifüj * OPSİYONEL ADIM - Protein G Agaroz Precleansing. <ol><li> Supernatant alın ve yeni 15 ml şahin tüp yerleştirilir. </li><li> Protein G Agaroz 500 mcL ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika çevirin. </li><li> 10 dakika 4000 rpm&#39;de Santrifüj 4 ° C </li></ol></li><li> 500 mcL Giriş kontrolü (tek genomik DNA içeren) olarak kullanılır supernatant dağıtın, böylece, geri kalan 1600 mcL içeren örnek her iki tüp bölünmüş - kromatin immunoprecipitation (ChIP) numuneler için. </li><li> Giriş kontrolü -80 yerleştirilir ° CO / N daha sonra kullanmak kadar. </li><li> ChIP örnekleri sonra antikor 10XFSB ve 4μg 01:10 hacmi, vorteks örnekleri ekleyin ve 4 ° C gecede onları döndürmek. ! DİKKAT! Antikor miktarı ve seyreltme optimizasyonu gerekebilir. </li></ol> 2. Gün ! DİKKAT! 2. Gün - nucleosomal DNA izole etmek için kullanılır olacak Protein G Agaroz yıkayarak başlayın. Agaroz boncuklar çok hassas olduğundan, agaroz boncuklar içeren herhangi bir çözüm pipetleme zaman ipuçları başlarını kesmek için gereklidir. 1. DNA Protein G Agaroz Boncuk problama <ol><li> 245 mcL protein, 2 ml mikrosantrifüj tüp içinde G-agaroz (4 tüpler için yeterli) (loop) 1.6 mL 1XFSB ekleyin. </li><li> Iki 2 ml tüpler ve dolum 1X FSB ile her 1.6 ml kadar çözüm ayırın. </li><li> RT 30 saniye çevirin ve 30 saniye için 0.1 RCF santrifüj. </li><li> Bir vakum kullanarak süpernatantı. </li><li> Tekrar 1.6 ml 1X FSB ekleyin. 30 saniye süreyle örnekleri çevirin ve 30 saniye için 0.1 RCF santrifüj sonra. </li><li> Süpernatantı tekrar çıkarın ve 1,5 mL 1XFSB ile her iki tüpte birleştirmek. </li><li> 15 mcL sonicated Salmon Sperm DNA (10mg/ml) ekleyin. ! DİKKAT! Bu adım, ilke olarak, boncuk immunoprecipitate non-spesifik bağlanma azaltmak gerekir. Ancak, bu da (insan) DNA dizilerinin bazı yanlış pozitif yol açabilir. </li><li> RT Döndür, 30 dakika sonra 30 saniye için 0.1 RCF santrifüj. </li><li> Süpernatantı. 1XFSB, 200 mcL ekleyin. </li><li> Her ChIP örnek agaroz boncuk 90 mcL ekleyin. 1 saat 4 ° C&#39;de döndürün. </li><li> Negatif kontrol olarak hizmet veren ve 4 döndürmek ° C 1 saat kalan agaroz boncuk haline 1XFSB 1 ml ekleyin. </li><li> Saat süren inkübasyondan sonra, 30 saniye için 0.1 RCF ve negatif kontrol örnekleri santrifüj. Süpernatantı atın. </li></ol> 2. Boncuk Yıkama ! DİKKAT! - Yıkama tamponlar 4 ° C kullanana kadar, eski bir aydan daha az olan, yalnızca kullanılmak üzere saklanmalıdır. <ol><li> Boncuklar her yıkama solüsyonu 1 ml ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika çevirin. </li><li> 30 saniye için 0.1 RCF santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant kullanarak vakum atın. </li></ol> * Her yıkama solüsyonu - Düşük tuz yıkama tamponu - Yüksek tuz yıkama tamponu </p&gt; - Lityum klorür solüsyonu - sadece 1 dakika boyunca RT döndürmek! - TE tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8) 3. Elüsyon * KRİTİK ADIM gününde her deney için kullanılacak taze Elüsyon Tampon olun. <ol><li> Her bir örnek için taze hazırlanmış elüsyon tampon 250 mcL ekleyin. </li><li> RT 15 dakika döndürün, ardından 1 dakika süreyle 0.4 RCF santrifüj. </li><li> Süpernatant, 2.0 ml mikrosantrifüj tüp (Loop) kaydedin. </li><li> Birkaç saniye için el ile her bir örnek ve vorteks elüsyon tampon 250 mcL ekleyin. Daha sonra, 15 dakika boyunca bir mulitvortexer vorteks örnekleri. </li><li> 4 dakika 16 RCF rpm&#39;de santrifüj ve aynı 2.0 ml tüp (Loop) supernatant kaydetmek. </li></ol> 4. Digest Protein <ol><li> Her ChIP örnek 10 ul 0,5 M EDTA, 25 ul 0.8M Tris-HCl, pH 6.5, 10 mg / ml proteinaz K (1 / 200 örnek). </li><li> Her giriş kontrol etmek için, proteinaz K sindirimi (örnek tampon 1 / 10) ve 10mg/ml Proteinaz K (örnek tampon 1 / 200) lizis tamponu ekleyin. </li><li> 52 ° C giriş ve ChIP örnekleri en az 3 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> 5. Kloroform / Fenol ekstraksiyonu ! DİKKAT! Deney fenol kloroform / gerektiren başlık altında yapılmalıdır. Kloroform / fenol işlerken nitril eldiven kullanın. <ol><li> 3 saat inkübasyondan sonra, her bir örnek için 500 ul fenol-kloroform ekleyin. </li><li> Vortex birkaç saniye için tüm örnekler, daha sonra 5 dakika boyunca 13 RCF rpm&#39;de santrifüj. </li><li> Bu noktada, iki aşamada olacak ve üst faz içeriği ilgilenen. Üst faz çıkarın ve 2 mL mikrosantrifüj tüpe koydu. </li><li> 1.375 mL% 100 Etanol ile birlikte her bir örnek, 3M sodyum asetat Glikojen ve 50μL 2μL karışımı ekleyin. </li><li> Tüm örnekler şiddetle Vortex. ° C gece -80 yerleştirin. </li></ol> 3. Gün <ol><li> Kaldır örnekleri formu -80 ° C ve onları Çözülme için buz üzerine koyun. </li><li> 10 dakika 15 RCF Santrifüj 4 ° C </li><li> Tüpün dibinde pelet rahatsız etmeden dikkatlice supernatant çıkarın. </li><li> Her bir örnek için 1 ml soğuk% 75 Etanol ekleyin, sonra onları 4-6 kez çevirin. </li><li> 4 5 dakika boyunca 18 RCF santrifüjleyin ° C </li><li> Bir kez daha süpernatantı ve pelet kurumaya bırakın. </li><li> -80 50 4mm Tris-HCl, pH8 mcL ve mağaza kuru pelet çözülür ° C daha sonra kullanmak kadar. </li></ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

Bu protokol, burada özetlenen bu kromatin işaretler, postmortem eserler (histon) asetilasyonu ve fosforilasyon 1 de dahil olmak üzere diğer tür değişiklikler ile karşılaştırıldığında daha az eğilimli olabilir, çünkü insan beyninin histon ve / veya DNA metilasyon imzaları ilgilenen araştırmacılar için özellikle yararlı 2. Postmortem beyin mono-nucleosomal hazırlıkları çalışmaya müsait; aralığının tipik temsilcisi otoliz aralıklarla (ölüm ve donma / doku depolanması arasındaki zaman) ile en az örneklerinde DNA...

Çözümler: <ul><li> nChIP Douncing Tampon: 10 mM Tris, 4 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2 7.5 pH ayarı </li><li> 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl 7.5 pH ayarı </li><li> Düşük tuz yıkama tamponu:% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl </li><li> Yüksek tuz yıkama Tampon:% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl </li><li> Lityum Klorür Tampon:% 1 IGEPAL-CA 630,% 1 Deoxycholic asit, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl </li><li> TE tampon: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA </li><li> Elüsyon Tampon: 0.1M NaHCO 3,% 1 SDS </li><li> Proteinaz K sindirimi tampon (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA,% 2 SDS, 2M NaCl 8.0 pH ayarı </li><li> 3 M sodyum asetat: otoklavlanmış distile su 100 ml 24,61 g susuz sodyum asetat (MW = 82,03). PH 5.2 konsantre asetik asit kullanarak ayarlayın. </li></ul>

İnsan beyninin doku kromatin testi

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

, Şizofreni, bipolar hastalığı ve otizm gibi kronik nöropsikiyatrik hastalıklar, gen ekspresyonu ve diğer moleküler patoloji epigenetik değişikliklere neden olabilir genetik ve çevresel faktörlerin bir kombinasyonu sonucu olduğu düşünülmektedir. Geleneksel olarak, ancak, postmortem beyin ifade çalışmaları mRNA ya da protein ölçümü hapsedildi. Otoliz ve doku bütünlükleri içinde değişkenlikler gibi postmortem beyin araştırmalarında karşılaşılan sınırlamalar da yüksek mertebeden kromatin yapıların herhangi bir çalışma etkisi muhtemeldir. Ancak, DNA da dahil olmak üzere, genomik DNA nucleosomal kuruluş: bağlayıcı çekirdek histon -, çeşitli beyin bankaları tarafından sağlanan temsili numuneler büyük ölçüde korunmuş olması görünür. Bu nedenle, metilasyon desen ve postmortem beyin tanımlanan genomik lokusların çekirdek histon diğer kovalent modifikasyonlar incelemek mümkündür. Burada, dondurulmuş (sabit asla) insan beyninin örnekler için basitleştirilmiş yerli kromatin immunoprecipitation (NChIP) protokolü mevcut. Beyin homojenatlarında micrococcal nükleaz sindirim ile başlayarak, NChIP qPCR izleyen üç gün içinde tamamlanabilir. Burada sunulan metodoloji, normal ve hastalıklı insan beyninin gen ekspresyonunun epigenetik mekanizmaları aydınlatmak için yararlı olacaktır.

Yakın zamana kadar, insan beyni ifade çalışmaları RNA veya protein ölçümü ile sınırlı kalmıştır. Bu yazıda anlatılan kromatin immunoprecipitation teknikleri, postmortem beyin gen ekspresyonu histon metilasyon ve diğer epigenetik düzenleyiciler haritaya mümkün olacaktır.

İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Şizofreni, bipolar bozukluk ve otizm gibi kronik nöropsikiyatrik hastalıkların, genetik ve çevresel faktörlerin bir kombinasyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir...

Merhaba, ben Amish Matan. UMass Tıp Fakültesi'nin psikiyatri bölümündeki Dr. Sha Mc Barian'ın laboratuvarındanım. Bugün sizlere postmortem insan beyin dokusunda kromatin immünopresipitasyon işlemi için bir prosedür göstereceğim. Takip eden prosedür çok karmaşık değildir.En heyecan verici olan ise, yakın zamana kadar insan beynindeki ekspresyon çalışmalarının mRNA ve proteinin basit nicelendirilmesiyle sınırlı olmasıydı. Bu özel teknik, hem normal hem de hastalıklı insan beyninde gen ekspresyonunun mekanistik temeli hakkında bize daha iyi bir anlayış sağlayacaktır. Öyleyse kromatini immünopresipite etmek için başlayalım.Çalışmaya, daha önce dondurulmuş postmortem insan beyin dokusundan diseke edilmiş örneklerle başladık. Güvenlik gözlüğü kullanmak ve insan dokusuyla çalışmak için belirlenmiş bir alanda çalışmak önemlidir. Bu örneklerin işlenmesi sırasında, beyin dokusu, beyin hacminin beş katı kadar down sink tamponu ile seyreltilir.Çözelti içindeki tüm doku homojen hale geldiğinde, homojenize edilen dokuyu iki mililitrelik tüpe aktarabiliriz. Örneğe mililitre başına beş ünite mikrokokkal nükleaz ekleyin ve çözeltiyi pipetleme yoluyla karıştırın. Ardından örneği buz üzerine yerleştirin.Bu adımın hızlıca gerçekleştirilmesi önemlidir; çünkü mikrokokal nükleaz 4 °C'de bile aktif olma özelliğine sahiptir. Tüm numuneler mikrokokal nükleaz ile işlendikten sonra, numuneler hızlıca 37 °C'lik su banyosuna aktarılır ve yedi dakika boyunca inkübe edilir.Yedi dakikalık inkübasyonun ardından, mikrokokal nükleaz aktivitesini durdurmak için 10 milimol konsantrasyona ulaşacak şekilde 0.5 molar EDTA ekleriz. Böylece artık izolasyon adımına geçmeye hazırız. Mikrokokal nükleaz ile işlem görmüş ve nükleozomal DNA içeren örneklerimizin izolasyonuna başlanacaktır.Nava, içine 4.5 ml 0.2 millimolar EDTA, 2.5 µl 0.2 molar benadine ve 4.5 µl 0.1 molar PMSF ekleyeceğimiz 15 ml'lik bir Falcon tüpü alacak. Örneğimizi bu tüpe aktaracağız. Ardından, örneğimizi her 10 dakikada bir vorteksleyerek buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edeceğiz.Bir saatlik inkübasyonun sonunda, 2,5 µL 3 M DTT ekleyeceğiz. Örnek bir kez daha vortekslenir, ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca, sallanır kovalı bir rotorda 3.175 RCF'de santrifüj edilir. Santrifüj sonrası süpernatan dağıtılır; böylece sadece genomik DNA içerecek olan 500 µL giriş kontrolü olarak kullanılır, geri kalan kısım ise kromatin immünopresipitasyon örneklerimiz olacak şekilde her biri 1.600 µL örnek içeren iki tüpe bölünür.Girdi kontrolü, daha sonra kullanılmak üzere gece boyunca -80 °C'de bekletilir. Ardından, örneğimizin hacminin onda biri kadar 160 µL 10 XFSB ekleriz. Bununla birlikte, dört µg antikor ekleriz.Şimdi numuneleri vorteksleyin ve ardından dört °C'de gece boyunca döndürün. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, nükleozomal DNA'yı izole etmek için kullanılacak protein girolarını yıkayacağız. Bu agro boncuklar çok hassas olduğundan, onlarla çalışırken pipet uçlarının uçlarının kesilmesi gereklidir.Bu, pipetleme sırasında boncukların daha fazla alana sahip olmasını sağlamak içindir. Şimdi, 2 ml'lik bir mikro santrifüj tüpüne 1.6 ml bir XFS boncuğu ile 245 µL protein jaguarlar ekleyin. Bu miktar dört tüp numune için yeterli olmalıdır.Ardından, boncuk solüsyonunu iki adet 2 mL'lik tüpe ayırın ve her birini bir adet XFSB ile 1,6 mL'ye tamamlayın. Tüpleri oda sıcaklığında bir rotatör üzerinde 30 saniye boyunca döndürün ve ardından 0,1 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, ATE'yi vakum kullanarak uzaklaştırın.1.6 ml 1X FSB ekleyin. Örnekleri bir rotatörde 30 saniye boyunca tekrar döndürün ve ardından 0.1 RCF'de 30 saniye boyunca yeniden santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatanı tekrar uzaklaştırın ve her iki tüpü 1.5 ml 1X FSB ile birleştirin.Ayrıca 15 µL sperm DNA'sı ekleyin. Şimdi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döndürün ve ardından 0,1 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüj edin. Süpernatanı uzaklaştırın ve 200 µL bir XFSB ekleyin.Şimdi her bir kromatin çöktürme örneğine 90 µL agro speeds ekleyin ve ardından bunları 4 °C'de bir saat boyunca döndürün. Negatif kontrol için, kalan agro speeds'lere 1 mL 1X FSB ekleyin ve bunu kromatin immünopresipitasyon örneği ile birlikte 4 °C'de bir saat boyunca döndürün. Bir saatlik inkübasyon sırasında, taze çözünürlük tamponu hazırlama fırsatını değerlendirebiliriz.Bu, deneyin ilerleyen aşamalarında, bir saatlik inkübasyonun ardından kullanılacaktır. Örnekleri ve negatif kontrolü 0,1 CFS'de 30 saniye boyunca santrifüj edin ve süpernatanatı atın. Ardından, boncukları dört farklı yıkama çözeltisi ile yıkayacağız: düşük tuzlu yıkama tamponu, yüksek tuzlu yıkama tamponu, lityum klorür çözeltisi ve son olarak pH sekiz'de TE tamponu.Lityum klorür çözeltisi dışındaki her bir tampon için, örnekleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca döndüreceğiz ve ardından 0.1 R Cs'de 30 saniye boyunca santrifüj edeceğiz. Lityum klorür yıkaması için, örnekleri oda sıcaklığında sadece bir dakika döndürün. Her yıkamadan sonra, süpernatantı vakum kullanarak atın.Şimdi örneklerimizi elüye etme aşamasına geçmeye hazırız. Elüsyon adımına başlamak için, her örneğe taze hazırlanmış 250 µL elüsyon tamponu ekleriz. Örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca rotasyona tabi tutun, ardından 0,4 RCF hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin.Şimdi süpernatanı iki ml'lik turuncu bir tüpe kaydedin. Ardından, her örneğe 250 µL elüsyon tamponu ekleyin. Tüm örnekleri bir kez daha, birkaç saniye boyunca elle vorteksleyin.Ardından örnekleri 15 dakika boyunca vorteksleyin, 15 dakika vorteksledikten sonra tüpleri santrifüjden geçirin. Dört dakika boyunca 16 RCF uygulayın ve süpernatantı aynı 2 mL'lik tüpte saklayın. Örneklerimizdeki proteini sindirmek için, her bir kromatin immünopresipitasyon örneğine önce 10 µL 0,5 M DTT, 25 µL pH 6,5'te 0,8 M Tris-HCl ve 2,5 µL 10 mg/mL proteinaz K ekleyin.Her bir girdi kontrolünün yanına 15 µL lizis tamponu ve 2,5 µL 10 mg/mL Proteinaz K ekleyin; hem girdi hem de kromatin immünopresipitasyon örneklerini 52 °C'de en az üç saat inkübe edin. Üç saatlik inkübasyon süresi tamamlandığında, fenil kloroform ekstraksiyonuna başlayabiliriz.Üç saatlik inkübasyonun ardından, her örneğe 500 µL fenil kloroform ekleriz. Fenil kloroform, hem ciltle temas ettiğinde hem de solunduğunda zararlı olan organik bir kimyasal olduğu için bu işlem çeker ocak altında gerçekleştirilir. Ardından, tüm örnekleri birkaç saniye boyunca vorteksleri ve 13 RCF'de beş dakika boyunca santrifüj ederiz.Tüplerde iki faz bulunmalıdır. Üst fazın içeriğiyle ilgilendiğimiz için, üst fazı alıp iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktaracağız. Ardından, her örneğe iki µL glikojen ve 50 µL 3 M sodyum asetat karışımının yanı sıra 1,375 mL %100 etanol eklenir.Tüm örnekler kuvvetlice vortekslenir ve gece boyunca -80 °C'de bekletilir. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, örneklerin çözülmesi için buz üzerine yerleştirilmeleri sağlanır. Örnekler, 4 °C'de 10 dakika boyunca 15 RCF'de yüksek hızda santrifüj edilir.Santrifüj işleminden sonra, tüpün dibindeki peleti yerinden oynatmadan süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, her örneğe 1 mL soğuk %75 etanol ekleyin ve hepsini dört ila altı kez altüst ederek karıştırın. Tüpler daha sonra 4 °C'de, 18 RCF'de beş dakika boyunca tekrar santrifüj edilir.Süpernatan tekrar uzaklaştırılır ve peletlerin havada kuruması beklenir. Peletler kuruduğunda, pH sekiz değerinde 50 µL 4 mM eser HCl içinde çözülür ve -80 °C'de saklanır. Böylece, dondurulmuş insan postmortem beyin dokusunda kromatin immünopresipitasyonunun nasıl yapılacağını göstermiş oldum.Ve unutmayın, bu prosedürü uygularken insan beyin dokusuyla çalışırken gerekli tüm önlemleri almak önemlidir; kromatin immünopresipitasyon analizleri, hem normal hem de hastalıklı insan beynindeki gen ekspresyonuna dair ek bir anlayış katmanı eklemek için kullanılabilir. İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Beyin dokusunda hücresel heterojenite testlerin çoğu tek hücreli çözünürlük eksikliği nedeniyle kromatin epigenetik işaretlerin çalışma için önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Nöronlar genellikle glia ve diğer non-nöronal hücreler ile iç içe. Biz özü ve insan beyninin nöron çekirdekleri toplamak için bir protokol sağlar.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Bu protokol, kromatin immunoprecipitation (ChIP) bir sinyal iletim yolu ile indüklenen transkripsiyonu düzenleyen kromatin şablon dinamik değişiklikleri incelemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, analiz etmek ve SPE larındaki lokus içinde 5-methylcytosine ve 5-hydroxymethylcytosine ölçmek için kullanılabilir. Kiti, 5-HMC hidroksil grubu β-glukoziltransferaz (T4-BGT) kullanan bir enzimatik reaksiyon ile glikoz eklenmesiyle 5-5-HMC mC ayırır. 5-HMC CCGG bağlamında oluştuğunda, bu değişikliği olmayan bir cleavable sitesine cleavable MspI sitesi dönüştürür.

Balb / C Beyin Dokusu Yüksek Hassasiyet 5-hydroxymethylcytosine Algılama

Kaynak: Mendez, F. M.  et al., Murin Beyin Tümörü Nörosferleri Kullanılarak Doğal Kromatin İmmünopresipitasyonu. J. Vis. Uzm. (2018). Bu video, doğal kromatin immünopresipitasyonu kullanılarak bir fare beyin tümöründen türetilen nörosfer hücrelerinden protein-DNA komplekslerinin izolasyonunu göstermektedir. Aşağı akış analizi için DNA'yı serbest bırakmak için kromatin hazırlama, immünopresipitasyon, yıkama ve protein sindirimi adımlarını detaylandırır.

Nörosfer Hücrelerinin Doğal Kromatin İmmünopresipitasyonu

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Burada, peroksidaz konjuge ikincil antikorların ve tiramid sinyal amplifikasyonunun kullanımına dayalı olarak 5mC oksidasyon türevlerinin uzamsal dağılımını haritalamak için hassas bir immünokimyasal yöntemi açıklıyoruz.

Hassas immünohistokimyasal sitozin Modifiye Formlar Algılama

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Epigenetik mekanizmalar sık tümörü değişmiş. Kromatin immunoprecipitation Kromatin yapısı ve gen transkripsiyonu düzenleyen Histon modifikasyonlar değişimler sonucu genetik değişiklikler gliyom içinde sonuçlarını incelemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı yerel Kromatin immunoprecipitation fare Beyin tümör neurospheres üzerinde açıklar.

Fare Beyin tümör Neurospheres kullanarak yerel Kromatin Immunoprecipitation

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Burada, immünororesans boyama ve DNA nokta-leke yöntemleri kullanarak, hücre ve beyin dokularında 5-hidroksimetilitozin tespit etmek için bir protokol salıyoruz.

Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Öğrenin, kromatin immünopresipitasyonu ile insan beyninde histon metilasyonu ve epigenetik düzenleyicileri haritalamak için kullanılan bu yöntemi. Normal ve hastalıklı beyinlerde gen ifadesinin mekaniksel temelini anlamanıza yardımcı olur.

İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Daha fazla video keşfet