İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Merhaba, ben Amish Matan. UMass Tıp Fakültesi'nin psikiyatri bölümündeki Dr. Sha Mc Barian'ın laboratuvarındanım. Bugün sizlere postmortem insan beyin dokusunda kromatin immünopresipitasyon işlemi için bir prosedür göstereceğim. Takip eden prosedür çok karmaşık değildir.

En heyecan verici olan ise, yakın zamana kadar insan beynindeki ekspresyon çalışmalarının mRNA ve proteinin basit nicelendirilmesiyle sınırlı olmasıydı. Bu özel teknik, hem normal hem de hastalıklı insan beyninde gen ekspresyonunun mekanistik temeli hakkında bize daha iyi bir anlayış sağlayacaktır. Öyleyse kromatini immünopresipite etmek için başlayalım.

Çalışmaya, daha önce dondurulmuş postmortem insan beyin dokusundan diseke edilmiş örneklerle başladık. Güvenlik gözlüğü kullanmak ve insan dokusuyla çalışmak için belirlenmiş bir alanda çalışmak önemlidir. Bu örneklerin işlenmesi sırasında, beyin dokusu, beyin hacminin beş katı kadar down sink tamponu ile seyreltilir.

Çözelti içindeki tüm doku homojen hale geldiğinde, homojenize edilen dokuyu iki mililitrelik tüpe aktarabiliriz. Örneğe mililitre başına beş ünite mikrokokkal nükleaz ekleyin ve çözeltiyi pipetleme yoluyla karıştırın. Ardından örneği buz üzerine yerleştirin.

Bu adımın hızlıca gerçekleştirilmesi önemlidir; çünkü mikrokokal nükleaz 4 °C'de bile aktif olma özelliğine sahiptir. Tüm numuneler mikrokokal nükleaz ile işlendikten sonra, numuneler hızlıca 37 °C'lik su banyosuna aktarılır ve yedi dakika boyunca inkübe edilir.

Yedi dakikalık inkübasyonun ardından, mikrokokal nükleaz aktivitesini durdurmak için 10 milimol konsantrasyona ulaşacak şekilde 0.5 molar EDTA ekleriz. Böylece artık izolasyon adımına geçmeye hazırız. Mikrokokal nükleaz ile işlem görmüş ve nükleozomal DNA içeren örneklerimizin izolasyonuna başlanacaktır.

Nava, içine 4.5 ml 0.2 millimolar EDTA, 2.5 µl 0.2 molar benadine ve 4.5 µl 0.1 molar PMSF ekleyeceğimiz 15 ml'lik bir Falcon tüpü alacak. Örneğimizi bu tüpe aktaracağız. Ardından, örneğimizi her 10 dakikada bir vorteksleyerek buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edeceğiz.

Bir saatlik inkübasyonun sonunda, 2,5 µL 3 M DTT ekleyeceğiz. Örnek bir kez daha vortekslenir, ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca, sallanır kovalı bir rotorda 3.175 RCF'de santrifüj edilir. Santrifüj sonrası süpernatan dağıtılır; böylece sadece genomik DNA içerecek olan 500 µL giriş kontrolü olarak kullanılır, geri kalan kısım ise kromatin immünopresipitasyon örneklerimiz olacak şekilde her biri 1.600 µL örnek içeren iki tüpe bölünür.

Girdi kontrolü, daha sonra kullanılmak üzere gece boyunca -80 °C'de bekletilir. Ardından, örneğimizin hacminin onda biri kadar 160 µL 10 XFSB ekleriz. Bununla birlikte, dört µg antikor ekleriz.

Şimdi numuneleri vorteksleyin ve ardından dört °C'de gece boyunca döndürün. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, nükleozomal DNA'yı izole etmek için kullanılacak protein girolarını yıkayacağız. Bu agro boncuklar çok hassas olduğundan, onlarla çalışırken pipet uçlarının uçlarının kesilmesi gereklidir.

Bu, pipetleme sırasında boncukların daha fazla alana sahip olmasını sağlamak içindir. Şimdi, 2 ml'lik bir mikro santrifüj tüpüne 1.6 ml bir XFS boncuğu ile 245 µL protein jaguarlar ekleyin. Bu miktar dört tüp numune için yeterli olmalıdır.

Ardından, boncuk solüsyonunu iki adet 2 mL'lik tüpe ayırın ve her birini bir adet XFSB ile 1,6 mL'ye tamamlayın. Tüpleri oda sıcaklığında bir rotatör üzerinde 30 saniye boyunca döndürün ve ardından 0,1 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, ATE'yi vakum kullanarak uzaklaştırın.

1.6 ml 1X FSB ekleyin. Örnekleri bir rotatörde 30 saniye boyunca tekrar döndürün ve ardından 0.1 RCF'de 30 saniye boyunca yeniden santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatanı tekrar uzaklaştırın ve her iki tüpü 1.5 ml 1X FSB ile birleştirin.

Ayrıca 15 µL sperm DNA'sı ekleyin. Şimdi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döndürün ve ardından 0,1 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüj edin. Süpernatanı uzaklaştırın ve 200 µL bir XFSB ekleyin.

Şimdi her bir kromatin çöktürme örneğine 90 µL agro speeds ekleyin ve ardından bunları 4 °C'de bir saat boyunca döndürün. Negatif kontrol için, kalan agro speeds'lere 1 mL 1X FSB ekleyin ve bunu kromatin immünopresipitasyon örneği ile birlikte 4 °C'de bir saat boyunca döndürün. Bir saatlik inkübasyon sırasında, taze çözünürlük tamponu hazırlama fırsatını değerlendirebiliriz.

Bu, deneyin ilerleyen aşamalarında, bir saatlik inkübasyonun ardından kullanılacaktır. Örnekleri ve negatif kontrolü 0,1 CFS'de 30 saniye boyunca santrifüj edin ve süpernatanatı atın. Ardından, boncukları dört farklı yıkama çözeltisi ile yıkayacağız: düşük tuzlu yıkama tamponu, yüksek tuzlu yıkama tamponu, lityum klorür çözeltisi ve son olarak pH sekiz'de TE tamponu.

Lityum klorür çözeltisi dışındaki her bir tampon için, örnekleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca döndüreceğiz ve ardından 0.1 R Cs'de 30 saniye boyunca santrifüj edeceğiz. Lityum klorür yıkaması için, örnekleri oda sıcaklığında sadece bir dakika döndürün. Her yıkamadan sonra, süpernatantı vakum kullanarak atın.

Şimdi örneklerimizi elüye etme aşamasına geçmeye hazırız. Elüsyon adımına başlamak için, her örneğe taze hazırlanmış 250 µL elüsyon tamponu ekleriz. Örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca rotasyona tabi tutun, ardından 0,4 RCF hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Şimdi süpernatanı iki ml'lik turuncu bir tüpe kaydedin. Ardından, her örneğe 250 µL elüsyon tamponu ekleyin. Tüm örnekleri bir kez daha, birkaç saniye boyunca elle vorteksleyin.

Ardından örnekleri 15 dakika boyunca vorteksleyin, 15 dakika vorteksledikten sonra tüpleri santrifüjden geçirin. Dört dakika boyunca 16 RCF uygulayın ve süpernatantı aynı 2 mL'lik tüpte saklayın. Örneklerimizdeki proteini sindirmek için, her bir kromatin immünopresipitasyon örneğine önce 10 µL 0,5 M DTT, 25 µL pH 6,5'te 0,8 M Tris-HCl ve 2,5 µL 10 mg/mL proteinaz K ekleyin.

Her bir girdi kontrolünün yanına 15 µL lizis tamponu ve 2,5 µL 10 mg/mL Proteinaz K ekleyin; hem girdi hem de kromatin immünopresipitasyon örneklerini 52 °C'de en az üç saat inkübe edin. Üç saatlik inkübasyon süresi tamamlandığında, fenil kloroform ekstraksiyonuna başlayabiliriz.

Üç saatlik inkübasyonun ardından, her örneğe 500 µL fenil kloroform ekleriz. Fenil kloroform, hem ciltle temas ettiğinde hem de solunduğunda zararlı olan organik bir kimyasal olduğu için bu işlem çeker ocak altında gerçekleştirilir. Ardından, tüm örnekleri birkaç saniye boyunca vorteksleri ve 13 RCF'de beş dakika boyunca santrifüj ederiz.

Tüplerde iki faz bulunmalıdır. Üst fazın içeriğiyle ilgilendiğimiz için, üst fazı alıp iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktaracağız. Ardından, her örneğe iki µL glikojen ve 50 µL 3 M sodyum asetat karışımının yanı sıra 1,375 mL %100 etanol eklenir.

Tüm örnekler kuvvetlice vortekslenir ve gece boyunca -80 °C'de bekletilir. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, örneklerin çözülmesi için buz üzerine yerleştirilmeleri sağlanır. Örnekler, 4 °C'de 10 dakika boyunca 15 RCF'de yüksek hızda santrifüj edilir.

Santrifüj işleminden sonra, tüpün dibindeki peleti yerinden oynatmadan süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, her örneğe 1 mL soğuk %75 etanol ekleyin ve hepsini dört ila altı kez altüst ederek karıştırın. Tüpler daha sonra 4 °C'de, 18 RCF'de beş dakika boyunca tekrar santrifüj edilir.

Süpernatan tekrar uzaklaştırılır ve peletlerin havada kuruması beklenir. Peletler kuruduğunda, pH sekiz değerinde 50 µL 4 mM eser HCl içinde çözülür ve -80 °C'de saklanır. Böylece, dondurulmuş insan postmortem beyin dokusunda kromatin immünopresipitasyonunun nasıl yapılacağını göstermiş oldum.

Ve unutmayın, bu prosedürü uygularken insan beyin dokusuyla çalışırken gerekli tüm önlemleri almak önemlidir; kromatin immünopresipitasyon analizleri, hem normal hem de hastalıklı insan beynindeki gen ekspresyonuna dair ek bir anlayış katmanı eklemek için kullanılabilir. İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.