İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Merhaba, ben Amish Matan; UMass Tıp Fakültesi'nin psikiyatri bölümündeki Dr. Sha Mc Barian'ın laboratuvarındayım. Bugün size postmortem insan beyin dokusunda kromatin immünopresipitasyon prosedürünü göstereceğim. Aşağıdaki prosedür çok karmaşık değildir.

En heyecan verici olan ise, yakın zamana kadar insan beynindeki ekspresyon çalışmalarının mRNA ve proteinin basit kantifikasyonu ile sınırlı olmasıydı. Bu özel teknik, hem normal hem de hastalıklı insan beyninde gen ekspresyonunun mekanistik temellerini daha iyi anlamamızı sağlayacaktır. Öyleyse, kromatin immünopresipitasyonuna başlayalım.

Çalışmaya, daha önce dondurulmuş postmortem insan beyin dokusu üzerinde gerçekleştirilen diseksiyonlar ile başladık. Güvenlik gözlükleri kullanmak ve insan dokusuyla çalışmak için belirlenmiş bir alanda çalışmak önemlidir. Bu örnekler işlenirken, beyin dokusu, beyin hacminin beş katı kadar down sink tamponu ile seyreltilir.

Tüm doku çözelti içinde homojen hale geldiğinde, doku homojenize edildikten sonra iki mililitrelik tüpe aktarılabilir. Örneğe mililitre başına beş ünite mikro kokal nükleaz ekleyin ve çözeltiyi pipetle yukarı aşağı çekerek karıştırın. Ardından buz üzerine yerleştirin.

Bu adımın hızlıca gerçekleştirilmesi önemlidir; çünkü mikrokokal nükleaz 4 °C'de bile etki gösterme yeteneğine sahiptir. Tüm örnekler mikrokokal nükleaz ile işlendikten sonra, örnekleri hızla 37 °C'lik su banyosuna aktarıyoruz ve yedi dakika boyunca inkübe ediyoruz.

Yedi dakikalık inkübasyonun ardından, mikrokokal nükleaz aktivitesini durdurmak için 10 milimol konsantrasyona ulaşacak şekilde 0,5 molar EDTA ekliyoruz. Böylece artık izolasyon adımına geçmeye hazırız. Nukleozomal DNA içeren örneklerimize mikrokokal nükleaz işlemi uyguladıktan sonra izolasyon işlemi başlayacaktır.

Nava, içerisine 4,5 ml 0,2 milimolar EDTA, 2,5 mikrolitre 0,2 molar benzonase ve 4,5 mikrolitre 0,1 molar PMSF ekleyeceğimiz 15 ml'lik bir Falcon tüpü alacaktır. Örneğimizi bu tüpe aktaracağız. Ardından, örneğimizi her 10 dakikada bir vorteksleyerek bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edeceğiz.

Bir saatlik inkübasyonun sonunda, 2,5 µL 3 M DTT ekleyeceğiz. Örnek bir kez daha vortekslenir, ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca, salınımlı kova rotorunda 3.175 RCF'de santrifüj edilir. Santrifüj işleminden sonra süpernatan dağıtılır; böylece sadece genomik DNA içeren 500 µL girdi kontrolü olarak kullanılır ve geri kalanı, her biri 1.600 µL örnek içeren ve kromatin immünopresipitasyon örneklerimiz olacak iki tüpe bölünür.

Giriş kontrolü, daha sonra kullanılana kadar gece boyunca -80 °C'de bekletilir. Ardından, numune hacminin onda biri kadar 160 µL 10 XFSB ekleriz. Bununla birlikte, dört µg antikor ekleriz.

Şimdi örnekleri vorteksleyin ve ardından dört °C'de gece boyunca döndürün. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, nükleozomal DNA'yı izole etmek için kullanılacak protein giroslarını yıkayacağız. Bu agro boncuklar çok hassas olduğundan, onlarla çalışırken pipet uçlarının uç kısımlarının kesilmesi gereklidir.

Bu, pipetleme sırasında boncukların daha fazla alana sahip olmasını sağlamak içindir. Şimdi, 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 1,6 ml 1X XFS boncuğu ile 245 µL protein jaguars ekleyin. Bu miktar, dört tüp numune için yeterli olmalıdır.

Ardından, boncuk çözeltisini iki adet 2 ml'lik tüpe ayırın ve her birini bir adet XFSB ile 1,6 ml'ye tamamlayın. Tüpleri oda sıcaklığında, bir rotatör üzerinde 30 saniye boyunca döndürün ve ardından 0,1 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, ATE'yi vakum kullanarak uzaklaştırın.

1.6 mL 1X FSB ekleyin. Örnekleri bir rotatörde tekrar 30 saniye boyunca döndürün ve ardından tekrar 0.1 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatantı tekrar uzaklaştırın ve her iki tüpü 1.5 mL 1X FSB ile birleştirin.

Ayrıca 15 µL sperm DNA'sı ekleyin. Şimdi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döndürün ve ardından 0.1 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüj edin. Süpernatanı uzaklaştırın ve 200 µL 1X FSB ekleyin.

Şimdi her bir kromatin çöktürme örneğine 90 µL agro speeds ekleyin ve ardından örnekleri 4 °C'de bir saat boyunca döndürün. Negatif kontrol için, kalan agro speeds'e 1 mL 1X FSB ekleyin ve bunu kromatin immünopresipitasyon örneği ile birlikte 4 °C'de bir saat boyunca döndürün. Bir saat süren inkübasyon sırasında, taze çözünürlük tamponu hazırlama fırsatını değerlendirebiliriz.

Bu, deneyin ilerleyen aşamalarında, bir saatlik inkübasyonun ardından kullanılacaktır. Örnekleri ve negatif kontrolü 0.1 CFS'de 30 saniye boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın. Ardından, boncukları dört farklı yıkama çözeltisiyle yıkayacağız: düşük tuzlu yıkama tamponu, yüksek tuzlu yıkama tamponu, lityum klorür çözeltisi ve son olarak pH 8'de TE tamponu.

Lityum klorür çözeltisi dışındaki her bir tampon için, numuneleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca rotasyona tabi tutacağız ve ardından 0.1 R Cs'de 30 saniye boyunca santrifüj edeceğiz. Lityum klorür yıkaması için numuneleri oda sıcaklığında sadece bir dakika boyunca rotasyona tabi tutun. Her yıkamadan sonra, süpernatantı bir vakum kullanarak uzaklaştırın.

Şimdi örneklerimizi elüe etme aşamasına geçmeye hazırız. Elüsyon adımına başlamak için, her örneğe taze hazırlanmış 250 µL elüsyon tamponu ekliyoruz. Örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca döndürün, ardından 0,4 RCF'de bir dakika boyunca santrifüj edin.

Şimdi süpernatanı 2 ml'lik turuncu bir tüpe aktarın. Ardından her örneğe 250 µL elüsyon tamponu ekleyin. Tüm örnekleri bir kez daha birkaç saniye boyunca elle vorteksleyin.

Ardından numuneleri 15 dakika boyunca vorteksleyin; 15 dakikalık vorteksleme işleminden sonra tüpleri santrifüjleyin. 16 RCF ile dört dakika boyunca döndürün ve süpernatantı aynı 2 mL'lik eppendorf tüpünde saklayın. Numunelerimizdeki proteini sindirmek için, her bir kromatin immünopresipitasyon numunesine önce 10 µL 0,5 M DTT, 25 µL pH 6,5'te 0,8 M Tris-HCl ve 2,5 µL 10 mg/mL proteinaz K ekleyin.

Her bir girdi kontrolünün yanına 15 µL lizis tamponu ve 2,5 µL 10 mg/mL Proteinaz K ekleyin; hem girdi hem de kromatin immünopresipitasyon örneklerini 52 °C'de en az üç saat boyunca inkübe edin. Üç saatlik inkübasyon tamamlandığında, fenil kloroform ekstraksiyonuna başlayabiliriz.

Üç saatlik inkübasyonun ardından, her örneğe 500 µL fenil kloroform ekliyoruz. Fenil kloroformun hem ciltle temas ettiğinde hem de solunduğunda zararlı bir organik kimyasal olması nedeniyle bu işlem çeker ocakta gerçekleştirilir. Ardından, tüm örnekleri birkaç saniye boyunca vorteksliyoruz ve beş dakika boyunca 13 RCF'de santrifüj ediyoruz.

Tüplerde iki faz bulunmalıdır. Üst fazın içeriğiyle ilgilendiğimiz için, üst fazı alıp 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktaracağız. Ardından, her örneğe 2 µL glikojen ve 50 µL 3 M sodyum asetat karışımı ile birlikte 1,375 ml %100 etanol eklenir.

Tüm örnekler kuvvetlice vortekslenir ve gece boyunca -80 °C'de bekletilir. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, örnekler çözünmeleri için buz üzerine yerleştirilir. Ardından, 4 °C'de 10 dakika boyunca 15 RCF'de yüksek hızlı santrifüj işlemine tabi tutulurlar.

Santrifüjden sonra, tüpün altındaki peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, her örneğe 1 mL soğuk %75 etanol ekleyin ve hepsini dört ila altı kez altüst ederek karıştırın. Tüpler daha sonra 4 °C'de, 18 RCF'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjlenir.

Süpernatan tekrar uzaklaştırılır ve pelletlerin havada kuruması beklenir. Pelletler kuruduktan sonra, pH 8 değerine sahip 4 mM iz miktarda HCl içeren 50 µL çözeltide çözülür ve -80 °C'de saklanır. Bir sonraki kullanım aşamasına kadar bu şekilde tutulur; böylece dondurulmuş insan postmortem beyin dokusu üzerinde kromatin immünopresipitasyonunun nasıl yapılacağını göstermiş oldum.

Ve unutmayın, bu prosedürü uygularken insan beyin dokusuyla çalışırken gerekli tüm önlemleri almak önemlidir; kromatin immünopresipitasyon analizleri, hem normal hem de hastalıklı insan beynindeki gen ekspresyonuna dair ek bir anlayış katmanı eklemek için kullanılabilir. İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.