Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Kemik iliğinden dendritik hücrelerin hazırlanması, bağışıklık sisteminin iki alt görüntülemesinde in vitro veya in vivo deneyler için kullanılabilecek mükemmel bir antijen sunan hücre kaynağı sağlar. Antijen sunan hücrelerin tanıtılması, canlı lenf nodu bağlamında antijene özgü hücre hücre etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Burada kemik iliğinin steril izolasyonunu ve olgun dendritik hücrelerin üretimi için kültür tekniklerini gösteriyoruz.

Ayrıca, dendritik hücrelerin gelişimini birinci günden 11. güne kadar takip ediyoruz. Bu gelişme, koku teknolojileri kullanılarak yapılan hareketsiz görüntüler ve kuluçka videolarıyla tasvir edilmiştir. Son olarak, aynalayıcı lenf nodunda OT iki T hücresine koy antijeni sunan kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri gösterdik.

Merhaba, ben Melanie Matthew, yakınlardaki California Üniversitesi'nde Micah Halen'ın laboratuvarındayım. Hücreleriniz büyürken prober sırasında içeride neler olduğunu hiç merak ettiniz mi? Bugün?

Protokolümüzün bir parçası olarak, size bazı enstrümanları sitede nasıl kullanacağınızı göstereceğiz. Mürekkepli site, inkübatörünüzde hücre kültürü büyümesini izlemenizi sağlar. Bu protokolde, fareden elde edilen kemik iliği ve gruplandırma hücrelerini nasıl izole edeceğinizi ve hazırlayacağınızı göstereceğiz.

Size nasıl yapılacağını göstereceğim ilk şey, uyluk kemiğini çıkarmak ve kemik iliğini izole etmek. Önce hayvanı iğneleyin. Daha sonra, hayvanı% 70 etanol ile ıslatın. Hayvanın orta hattı boyunca ilk kesinizi yapın.

Sonra size burada gösterdiğim gibi bacağınızın içini kesin. Femurun üzerindeki kas dokusunu ortaya çıkarmak için, kası bir kenara çekebilmeli ve diseksiyon cımbızınızla büyük femur kemiğini kavrayabilmelisiniz. Diseksiyon cımbızınızla kemiği tutarken, kemiği aşağı doğru hareket ettirin ve ilk kesiminizi eklemin hemen altından yapın.

Ardından makasınızı uyluk kemiğinin uzunluğu boyunca çalıştırın ve vücuda mümkün olduğunca yakın kesmesini sağlayın. Bu, özellikle femoral arteri keserseniz, biraz kana neden olabilir. Femuru çıkarırken, kemiğin sağlam tutulması son derece önemlidir.

Burada gördüğünüz gibi kemik uçları kesilmemiş veya bozulmamıştır. Uyluk kemiği çıkarıldıktan sonra, ek dokuları kesin ve uyluk kemiğini PMI ortamımızın küçük bir tabağına yerleştirin. Ek dokuyu çıkarırken, femur kemiğinin kurumadığından emin olun.

Bu noktada femur kemikleri %70 etanol içeren bir kaba aktarılmalı ve beş ila 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirilmelidir. Bu videonun amacı doğrultusunda, laboratuvar tezgahında devam edeceğiz. Bununla birlikte, deneyin bu aşamasında, her şey bir doku kültürü başlığına aktarılmalıdır.

Kemikler etanole batırıldıktan sonra, kemik iliğinin çıkarılması için onları steril ortamdan oluşan daha büyük bir tabağa taşıyabilirsiniz. Şimdi kemik iliğini çıkarmaya ve yeniden askıya almaya hazırız. Bir insülin şırıngasını steril ortamla doldurun ve daha sonra kullanmak üzere yan tarafa yerleştirin.

Steril cımbızınızla kemiği kavrayın. Atılan parçalar için küçük bir tabağın üzerinde tutun ve epifizi veya kemiğin uçlarını her iki taraftan kesin. İnsülin şırınganızı kemiğin bir tarafına yerleştirin ve iliği kemikten 15 mil ortama boşaltın.

İliğin tamamı dışarı atılana kadar kemiği bir veya iki kez daha yıkayın. İlik kemikten atıldıktan sonra neredeyse tamamen beyaz olacaktır. Temiz kemiği atılan kabın içine yerleştirin ve diğer uyluk kemiğinin işlemini tekrarlayın.

Bu tamamlandıktan sonra, tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için yıkama işlemiyle parçalanmayan ilik parçalarını nazikçe parçalayın. Bu, beş ila 10 dakikalık pipetleme gerektirecektir. 50 millik konik bir tüpe tek hücreli bir süspansiyon yerleştirin, plakayı 10 mil ortam ile en az üç kez yıkayın.

Her seferinde hücreleri döndürün, ortamı çıkarın ve parmaklarınızı tüpün dibine sıkıca ve hızlı bir şekilde sürterek hücreleri yeniden süspanse edin. Kırmızı kan hücrelerini veya eritrositleri çıkarmak için bir su lizisi gerçekleştiriyoruz. Kırmızı kan hücresinin uzaklaştırılması için başka bir yöntem bir amonyum klorür lizizidir.

Her iki yöntem de önceki JoVE video makalelerinde açıklanmıştır. Milan max saflaştırma JoVE sayı dokuzda kullanılarak fare lenf düğümlerinden CD dört pozitif T hücresinin izolasyonu ve sıçan sitleri JoVE'den T hücresi büyüme faktörünün hazırlanması. Sayı 10.

RBC'lerinizi çıkardıktan sonra, artık kendinizi kültürlemeye hazırsınız. Bu yüzden sizi dendri hücre kültürüne götürmeden önce, sizi incus bölgesi ile tanıştırmak istiyorum. Incus bölgesi, inkübatördeki hücre kültürü büyümesinin çıkarılmasına izin verecek, tahmin etmeye izin verecek, böylece nasıl davrandıklarını veya yanlış davrandıklarını kendimiz izleyebileceğiz.

Bir kültür kurulduktan sonra, onu uygun boyuttaki tepsiye yerleştirir ve incus bölgesini kaydırarak kapatırsınız. Ardından, bilgisayarınızda zaman aralığını ayarlamanız ve ardından görüntü almak istediğiniz kuyuları seçmeniz ve mürekkepli sitenin sizin için veri toplamasına izin vermeniz yeterlidir. Filmler size bu protokolde gösterilecek, in vitro olarak dendritik hücre morfolojisi değişikliklerini gösterecektir.

Bu videolar doğrudan Incus site programından dışa aktarılmıştır. Dendritik hücreler birinci günden 11. güne kadar geliştikçe, büyüdükçe ve dendritik hücre fenotipini aldıkça gerçek bir morfoloji değişikliği görebilirsiniz. RBC'ler parçalandıktan ve çıkarıldıktan sonra, hücreler birincil dendritik hücre ortamında yıkanır ve mil başına 5 milyonda kaplanır.

Bu hücreler başlangıçta birincil dendritik hücre kültürü ortamında kültürlenmelidir ve daha sonra bunları mil IL dört başına 40 nanogram ve mil TNF alfa başına yüz nanogram ile desteklenen ikincil DC ortamında kültürlemeliyiz. Bu sitokinler, monositten türetilmiş dendritik hücrelere benzeyen olgun dendritik hücrelerin gelişmesine yardımcı olacaktır. Şimdi size kültürlerin geliştikçe neye benzediğini ve zaman içinde nasıl korunacağını göstereceğim.

Hücreleri kapladıktan sonra, ilk ortam değişikliğinizden önce 72 saat boyunca dendritik hücreleri kültürleyebilirsiniz. İşte ilk gün hücreleri plakaladıktan hemen sonra tipik kültürünüzün nasıl görüneceği. Ve işte hücrelere bir bakış.

Üçüncü günde, hücrelerin plakaya yapışmaya başladığını ancak klasik dendritik hücre fenotipini almadığını görebilirsiniz. Dördüncü günde, medyayı çıkarın ve medyanın 10 mil taze birincil DC medya aspirasyonunu ekleyin. Dördüncü günde, yapışık olmayan diğer hücrelerdeki lenfositleri çıkaracağız.

Şimdi, ilk kaplamanızdan yedi gün sonra, üç gün daha inkübatöre geri koyabilirsiniz. İşte tipik kültürünüzün nasıl görüneceği. Hücreleri bölme ve yeniden doldurma zamanının geldiğini söyleyebilirsiniz.

Yedinci günde, dendritik hücreler, ortamı aspire ederek ve daha sonra 300 milimolar steril EDTA ekleyerek ve bunu beş dakika inkübe ederek plakadan çıkarılır. Daha sonra plaka, 45 derecelik bir açıyla tutularak ve EDTA solüsyonu plakanın arkasına pipetlenerek tekrar tekrar durulanır. Bu, tüm yapışkan dendritik hücreleri çıkardığınızdan emin olmak için birkaç dakika boyunca yapılır.

Hücreler 50 mililik konik bir tüpte toplanır ve ikincil DC ortamı ile iki kez yıkanır. Hücreler daha sonra yeniden süspanse edilir ve plaka başına 5 milyon hücrede kaplanır. Yeni kaplanmış yedi gün dendritik hücreler hızla plakanın dibine yerleşir, yapışır ve yayılmaya başlar.

Zichy site videosunda görebileceğiniz gibi, bu video size yedinci günde yapılan ilk yeniden kaplamadan dokuzuncu günün başlarına kadar dendritik hücre gelişimini göstermek için iki gün boyunca inkübatörde çekildi. Morfoloji dendritik hücreler, antijen darbesinde, LLPS başına iki mikrogram eklenerek, burada ova için yüz mikrogram ve ovaya özgü CD dört pozitif T hücresine sahip OT iki fareden saflaştırılmış T hücresi ile aktive edilebilir. Farklı bir antijen kullanıyorsanız, burada dcs'nizi nabızlamak için optimal bir antijen konsantrasyonu kullandığınızdan emin olmanız önemlidir, OV ve LPS, LPS'nin nihai konsantrasyonu 20 milde mil başına iki mikrogram olacak şekilde birincil ortama eklenir ve ova, 20 milde mil başına yüz mikrogram olacaktır.

İşte tipik bir 10. gün dendritik hücre kültürünün nasıl göründüğüne dair bir fotoğraf. Bu fotoğrafta, morfolojinin antijen sunan bir hücrenin çok tipik olduğunu görebilirsiniz. CD 11 C pozitif dendritik hücrelerin yüzdesini her zaman faks ile kontrol etmelisiniz.

Bu, deneylerinizde kullanmak için nispeten saf bir dendritik hücre kültürüne sahip olduğunuzdan emin olmak içindir. Burada, 10. günde antijen darbeli olarak LPS ile tedavi edilen dendritik hücrelerin aktivasyonunu izlemek için SEN cihazlarından mürekkepli bölgeyi kullanıyoruz. Bu video, LPS ve val ve peptidin eklenmesinden hemen sonra 24 saatlik bir süreyi kapsar ve içinde dendritik hücreler daha aktif hale gelir ve bazı belirgin morfolojik değişiklikler vardır.

Dendritik hücreleriniz antijen nabzında aktive edildikten sonra, 300 milimolar EDTA ile inkübe ederek ve plakayı yıkayarak tekrar toplayabilirsiniz. Şimdi hücrelerinizi döndürün, herhangi bir ek antijeni çıkarmak için 50 mil RPMI ortamıyla iki kez yıkayın ve bunları uygun hücre izleyici boyası ile etiketleyin. Bu deneyde kasık lenf bezindeki hücreleri görüntüleyeceğim.

Burada gösterilen farenin yan bölgesine dermal olarak iki ila 5 milyon dendritik hücre enjekte etmemiz gerekecek. Daha sonra dendritik hücrelerin eğitim lenf noduna ev sahipliği yapması için 24 saat izin veriyoruz. İşte bu videoda, dendritik hücreler bir mavi hücre izleyici boyası olan CMF iki hc ile etiketlenmiştir.

Dendritik hücrelerin, volin için antijene özgü etiketli T hücreleri ile etkileşime girdiğini görebilirsiniz. Bu T hücreleri ccf SE ile etiketlenir. Moleküler problar için C-M-T-M-R veya diğer hücre izleyici boyalardan herhangi birini de kullanabilirsiniz. Bu, dcs ile etkileşime giren T hücrelerinin erken aktivasyon aşamasıdır.

Antijene özgü oldukları için, T hücrelerinin mavi etiketli dc'lerin dallarına yapıştığını görebilirsiniz. Bu, iki bottonluk bir görüntüleme deneyinde fare kaynaklı kemik iliği dendritik hücrelerinin hazırlanmasını ve kullanımını gösteren protokolümüzü sonlandırıyor. İzlediğiniz için teşekkürler ve kendi deneylerinizde iyi şanslar.