Name: Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: Öğrenin, Matrigel üzerinde insan embriyonik kök hücrelerinin besleyici hücre içermeyen koşullarda pasajlanmasını ve çoğaltılmasını. İmmünofloresan mikroskopi ile çok yönlülük doğrulaması yapılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teitell laboratuar İnsan embriyonik kök hücre çalışmaları California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tohum hibe RS1-00313 tarafından desteklenmektedir. Geniş, UCLA, özellikle Dr. Amander Clark, Dr Jerome Zack ve verdikleri destek için çalışmalarımız UCLA Broad Enstitüsü Kök Hücre Çekirdek Tesis üyeleri Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi üyelerine teşekkür ederiz.

Matrigel Matrigel için Yarma hESC Genellikle Matrigel üzerinde hESC bir konfluent 6 plaka, kuyu, yarma, 4-5 gün sonra tekrar konfluent olma, başka bir Matrigel plaka 1:5 için 1:3 bölünmüş olabilir. <ol><li> Yarma önce yukarıda açıklandığı gibi, CM ve Matrigel plakaları hazırlanır. </li><li> Bölme gününde, × 1 ile bölme PBS, pH7.4 her iyi yıkayın iyi 1mg/ml Dispase (DMEM/F12 medya ile seyreltilmiş 5mg/ml stok solüsyonu) 1 ml ve 37 inkübe ° C 3 dk. </li><li> 1 ile her iyi üç kez yıkayın × PBS, pH7.4,, ES medya, 1ml bFGF olmadan eklemek iyi alt kapalı koloniler kazımak için bir hücre kazıyıcı, 50ml şahin tüp askıya hESC toplamak ve santrifüj yoluyla pelet 200g oda sıcaklığında 5 dakika. </li><li> Matrigel plakalar üzerinde yeniden plakalı hESC, ilk DMEM/F12 ile Matrigel tabak yıkama ve başına 10 ng bFGF ile desteklenmiş CM 2.5ml ekleyin. 10 ng bFGF, pipet hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı üç kez ile desteklenmiş CM uygun bir hacmi hESC pelletini tekrar. (NOT: yarma için hESC Matrigel plakaları geldiğinde, yığınları kırmak için çok kolay, bu nedenle üç tur pipetleme yeterli ve daha koloniler üzerinde bozabilir ve tek hücre yapabilir pipetleme.) Temsili miktar 0.5 ml ortalama hESC kümeleri süspansiyon 6-iyi Matrigel plaka nihai bir birim olarak ortalama 3ml ulaşmak için. 37 ° C inkübatör plaka koyun. </li></ol> Immünofloresan mikroskopi pluripotency belirteçlerin saptanması İmmünofloresan mikroskopi, kültür sırasında hESC pluripotency belirteçlerinin Ekim-4 ve SSEA-4 ifadesi incelemek için kullanılır. <ol><li> Iyi bir medya aspire ve 1 ile yıkayın × PBS, pH 7.4. 10 dakika düzeltmek için iyi,% 3.7 formaldehit 2ml ekle. </li><li> 2 dakika süreyle iyi yer ve -20 ° C 2 ml metanol eklemek, 1xPBS pH 7.4 ile durulayın. </li><li> 5 dakika süreyle% 0.2 sığır serume albumin (BSA) 1ml 1xPBS, pH 7.4 ve blok ile durulayın. </li><li> Ekim-4 veya anti-h/mSSEA-4 antikor (% 0,2 BSA 1:200 dilüsyon) 1 ml ekleyin ve 1 saat veya 4 ° C&#39;de gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. (NOT: SSEA-4 boyama, doğrudan 6. adıma gidin) </li><li> 1xPBS, pH 7.4 ile üç kez durulayın FITC-konjuge tavşan IgG (% 0,2 BSA 1:500 dilüsyon), ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe ekleyin. </li><li> 1xPBS, pH 7.4 ile 3 kez durulayın ve iyi merkezi montaj çözümü bir damla koymak (nükleer görselleştirme isteniyorsa DAPI içerebilir). Oje mühür, hücrelerin üstüne lamel koyun, ve immünofloresan mikroskobu ile değerlendirmek. </li></ol> İnsan embriyonik kök hücre makbuzlar ES medya (Embriyonik Kök hücre ortam): DMEM/F12 - 400ml Nakavt Serum Replacer - 100ml Non-Essential Amino Asitler - 5ml 200mm GlutaMax / BME Çözüm - 5ml Penisilin / Streptomisin - 5ml 4 iyice karıştırınız ve 500ml şişelerde son hESC Kültür Medya saklamak ° C En fazla bir iki hafta iyi. MEF Kültür Medya: DMEM - 1000ml FBS - 100ml Non-Essential Amino Asitler - 10ml Glutamin - 10ml Penicllin / Streptomisin - 10ml İyice karıştırın ve 4 final MEF Kültür Medya saklamak ° C. 200mm Glutamax / BME Çözüm: Glutamax - 100ml β-mercaptoethanol (14.3M Stok çözelti) - 140 μ1 Iki ve sonra çözümler kısım 10ml bölümlerini karıştırın. -20 ° C&#39;de alikotları tutun bFGF Çözümü (stok nihai konsantrasyonu: 10 mikrogram / ml): bFGF (FGF2) - 50 mikrogram 1xPBS% 0,1 BSA, pH: 7.4 - 5ml 10 mg / ml stok yapmak için 50 mikrogram olarak 5ml% 0.1 BSA bFGF eritin. 500 ul parçaya kısım. -80 ° C saklayınız Kollajenaz IV Çözümü (1mg/ml): Kollajenaz IV - 50mg DMEM/F12 Medya - 50ml 50ml şahin tüp kollajenaz IV tozu ekleyin. Kaput, 50ml steril DMEM/F12 medya karıştırın. &lt;1 dakika vorteksleyin çözüm. toz çözülmüş olduğundan emin olun. Kaputu, yeni bir steril 50ml şahin tüp içine filtresi 0.22 mikron geçmesi. Bu çözüm için iyi saklanan 2 hafta, 4 ° C maksimum Dispase Çözüm (1mg/ml): Dispase 5mg/ml - 2ml DMEM/F12 Medya - 8 ml -20 ° C&#39;de kısım ticari, 5mg/ml Dispase çözüm ve mağaza DMEM/F12 kullanarak 1mg/ml dispase sulandırınız. Bu çözüm, 1 hafta, 4 tutulmalıdır ° C.

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Bu dizi 3 video (MEF) besleyici hücreler (video 1), geçit onları besleyici hücre-levhalar (Video 2) Matrigel nasıl ve ne kadar korumak için fare embriyonik fibroblast insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümeye nasıl gösterir Matrigel besleyici hücre koşulları (video 3) Pasajlanması hESC. Birçok önceki çalışmalar, bu bakım yaşayabilir, farklılaşmamış hESC inaktive MEF besleyici hücreler kültür gerektirir gösterdi. Ancak, pek çok deney, besleyici hücre kontaminasyon ücretsiz hESC saf bir nüfus gerekmektedir. Bu amaca ulaşmak için, biz nas...

<table><tbody><tr><td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Temel Olmayan Amino Asitler</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reaktif</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reaktif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reaktif</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin </td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Reaktif</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reaktif</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 antikoru</td><td>Reaktif</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;rythrin Konjuge Fare IgG3</td><td>Reaktif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITCI-konjuge antitavşan IgG</td><td>Reaktif</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

matrigel mefs matrigel 3: matrigel üzerine gelen pasajlanması hesc

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir.

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm 3

Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESK'ler) besleyici hücre içermeyen koşullarda büyümesinin nasıl sürdürüleceğini ve nasıl sürekli pasajlanacağını göstermektedir...

Matrigel üzerinde büyütülen insan embriyonik kök hücrelerini iki Matrigel plakasına bölmek için; Matrigel üzerindeki konfluent bir altı kuyucuklu embriyonik kök hücre plakası ile başlanır; bu hücreler başka bir Matrigel plakasına bir e üç veya bir e beş oranında bölünebilir. Bu işlem, bölme işleminden dört ila beş gün sonra kuyucukların yeniden konfluent hale gelmesini sağlar.Bölünecek her bir kuyucuğu bir kez XPBS pH 7.4 ile yıkayın. Ardından, her kuyucuğa bir mililitre 1 mg/mL'lik dis past ekleyin ve 37 °C'de üç dakika inkübe edin. Her bir kuyucuğu üç kez XPBS pH 7.4 ile yıkayın.Ardından, BF GF içermeyen bir mililitre embriyonik kök hücre besiyeri ekleyin ve kolonileri kuyucuk tabanından sıyırmak için bir hücre sıyırıcı kullanın. Resüspande edilen embriyonik kök hücreleri 15 mililitrelik bir Falcon tüpüne toplayın ve oda sıcaklığında, beş dakika boyunca 200 ×g'de santrifüj ederek pellete dönüştürün. İnsan embriyonik kök hücrelerini matrigel plaklarda yeniden yaymak için öncelikle matrigel plakları D-M-E-M-F 12 ile yıkayın ve 10 ng/mL ile desteklenmiş 2,5 mililitre meth condition besiyeri ekleyin.Hücreler santrifüj edildikten sonra, insan kulak kök hücre peletini, mililitre başına 10 nanogram BFGF ile takviye edilmiş uygun hacimdeki medya koşullu ortamında süspande edin. Hücre süspansiyonunu pipetle üç kez aşağı yukarı çekin.Matrigel'den elde edilen kök hücre kümelerinin kolayca dağıldığını unutmayın. Bu nedenle, kolonileri çok fazla küçültmeden kümeleri dağıtmak için üç kez pipetlemek yeterli olacaktır. Son olarak, her kuyukta 3 ml hacme ulaşmak için kuyu başına 0,5 mililitre insan amry kök hücre süspansiyonu ekleyin.Final hacim olarak, hücre kümelerinin eşit şekilde dağıldığından emin olun ve ardından plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Kullanılan spesifik amry kök hücre hattına bağlı olarak, amry kök hücreleri bölünmeden dört ila beş gün sonra tekrar konfluens hale gelecektir. Koloniler birbirine değmeye başladığında, insan amry kök hücrelerinizin kültürde pluripotensini veya kök hücre özelliklerini koruyup korumadığını bilmek önemlidir.Amry kök hücre kültürü sırasında hücrelerin pluripotensini kontrol etmek için, kuyucuklardan birinde pluripotens belirteçleri olan OCT four ve SSEA four ekspresyonunu incelemek amacıyla immünofloresan mikroskopi kullanıyoruz. Altı kuyucuklu plakamız OCT four ve SSEA four için fikse edilip boyanmıştır. Hücrelerin her iki belirteç için de floresan olarak etiketlendiğini görürsek, insan embriyonik kök hücrelerimizin pluripotensini koruduğunu ve deneylerimizde kullanılabileceğini anlarız.Size, insan embriyonik kök hücrelerinin embriyonik hücreler, fibroblastlar, besleyici hücreler ile metro job üzerinde alan gerektirmeyen koşullar altında nasıl büyütüleceğini ve sürdürüleceğini göstermiş olduk. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video laboratuarımızda rutin tripsin tonlar insan embriyonik kök hücre hatları geçişleri nasıl göstermektedir.

Tripsin ile Pasajlanması tonlar İnsan Embriyonik Kök Hücre hatları

Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir. Part 1 3.

MEFS I Matrigel: MEFS Durum Pasajlanması hESC

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm...

MEFS Matrigel 2 Matrigel üzerine MEFS Yarma hESC:

Belirli hücrelerin içine hESC Yönetmen farklılaşma, rejeneratif tıp alanında büyük ilgi yarattı. Biz belirlemek için bir özlü, adım-adım...

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Geçiş kültürlere besleyici-özgür koşullarda devam eden çabalarına rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve türetme ve kültürü fare embriyonik besleyiciler (MEFS) ile işbirliği kültürler büyük oranda bağımlı kalır. Burada, biz hızla öncesi deneylere hESC kültürlerden besleyiciler kaldırmak için yeni bir metodoloji göstermektedir.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Biz, gelişimsel biyolojiden elde edilen bilgilere ve yayınlanmış araştırmalara dayanarak, hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden A9 orta beyin dopaminerjik nöronlarını verimli bir şekilde üretmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirdik, bu da Parkinson hastalığı için hastalık modellemesi ve hücre replasman tedavisi için yararlı olacaktır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Besleyici hücrelerde kültürlenen insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) enzimatik veya mekanik geçişiyle ilişkili sınırlamalardan kaçınmak için, EDTA aracılı yapışma bozukluğu kullanılarak insan sünnet derisi fibroblastlarının besleyici hücre tabakasında tutulan hESC veya hiPSC kolonilerinin toplanması için hızlı, etkili, uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem oluşturduk.

İnsan pluripotent kök hücrelerinin besleyici hücreler üzerinde etilendiamintetraasetik asit aracılı yapışma ile hızlı, uygun maliyetli, enzimsiz geçişi

Öğrenin, Matrigel üzerinde insan embriyonik kök hücrelerinin besleyici hücre içermeyen koşullarda pasajlanmasını ve çoğaltılmasını. İmmünofloresan mikroskopi ile çok yönlülük doğrulaması yapılır.

Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC

Daha fazla video keşfet