Kabul edilmiş DTH indüksiyonu sonra Kulak Görüntüleme Efektör Bellek T hücreleri

Merhaba, ben Melanie Matthew. California Üniversitesi Irvine'deki Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nde, Micah Hollins laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Bugün, Dr. Christine Beaton ile birlikte, sıçan kulağındaki yanıt veren efektör veya bellek T hücresi popülasyonunu nasıl görüntülediğimizi size göstereceğiz.

Dr. Christine Beaton öncelikle sıçan kulağında gecikmiş tip aşırı duyarlılık DTH oluşturacaktır. Ardından, iki foton mikroskobu ile sıçan kulağının in situ görüntülemesine geçeceğiz. İki gün önce, bir Lewis sıçanına GFP etiketli albümin spesifik T hücreleri enjekte ettim.

Ve bugün aynı sıçanın kulağına uygulama yapacağım. Sağ kulağa albümin enjekte edeceğim ve sol kulağa ise sadece PBS enjekte edeceğim.

Enjekte ettiğim albümin dozu 20 µL içerisinde 20 µg'dır. Kullandığım albümin, Texas Red ile işaretlenmiş albümin ve işaretlenmemiş albüminin bir bire bir karışımıdır. Bu, enjeksiyonu nasıl gerçekleştireceğimi göstereceğim olan sağ taraftır.

Ben sağ elimi kullanıyorum. Bu yüzden, kulağın altına bir parmağımı, üstüne ise diğer parmağımı koyarak cildi gerebilmek için sol elimdeki eldiveni çıkardım; böylece iğneyle tam olarak nerede olduğumu görebilir ve iki cilt tabakası arasındaki hava boşluğuna, ki burası çok incedir, girebilirim. Bunun için, oraya girebilecek kadar son derece ince bir şey olması adına 27 gauge iğneler kullanıyorum.

Yani, ters çevirdiğimde, Texas red'in nereye ve PBS'nin nereye gittiğini kesinlikle görebiliyorsunuz. Şu an burada challenge işleminin üzerinden 42 saat geçti ve kulak kalınlığını ölçmek için yaylı bir mikrometre kullanacağım. Hem sağ kulağı (albumin ile challenge edilen) hem de sol kulağı (challenge edilmeyen) ölçeceğim ve kulak kalınlığı arasındaki fark bize inflamasyonun şiddeti hakkında bir fikir verecek.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 veya 58 veya 57 veya 57. Ve diğer kulak 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Merhaba. Christine Beaton, DTH yanıtını ölçtükten sonra çıkardığı sıçanı bize yeni verdi.

Bunları buraya buz üzerinde taşıdık. Bu, sıçanın sol kulağıdır. Ve şu an Ian Parker'ın laboratuvarında iki foton mikroskobisi yapıyoruz.

Şimdi bu kulakları in situ iki foton görüntüleme için hazırlayacağım. Sıçan kulaklarından birinin taban kısmını hazırlayacağım. Doku burada çok daha kalın ve yukarı doğru uzanan bazı tüyler var; eğer doğrudan kesmeye başlarsam bu durum biraz karmaşaya yol açacaktır.

Öncelikle yapacağım ilk şey, bu tüylerin bir kısmını kesmek olacak. Kulağı nazikçe tutuyorum. Dokuyu başparmağınız ve işaret parmağınız arasında tuttuğunuzda, parmağınızla kontrol etmeniz çok daha kolay olur.

Pens kullanmaya tercih ediyorum çünkü pensle dokunun ne yaptığını pek kolayca hissedemiyorum ve dokuya zarar vermekten her zaman endişe ediyoruz. Bu yüzden yaptığımız işlemi hissedebilmek istiyoruz. Bu nedenle parmaklarımı kullanmayı seviyorum.

Sıçan kulağında dermal tabakanın buradan soyulmuş halini görüyorsunuz. Tüylerin bir kısmını kırparken, dermisin bazı kısımlarını nazikçe kırpabildim, böylece deri bir şekilde soyuluyor. Bunu yapmak için kullanılan çok küçük diseksiyon makasları, yani güzel kavisli makaslar mevcuttur.

Dokuyu delmek istemezsiniz; kulağın tabanından yukarıya doğru, dermal tabakayı nazikçe keserek ilerleyebilirsiniz. Görüntüleme için çok büyük bir pencereye ihtiyacımız yok. Tam buradaki bu alan, dokuya sızan hücrelerin güzel görüntülerini elde etmek için yeterli olacaktır.

Gördüğünüz gibi, kulağın tabanında ve neredeyse kulağın ucuna kadar uzanan bazı sağlam kan damarlarımız hâlâ mevcut. Bu bölgenin tamamı, DTH görüntüleme için oldukça uygun olacaktır. Bu nedenle, görüntüleme tablasına yapıştırabileceğimiz küçük bir doku parçası oluşturmak için açığa çıkardığım bu doku parçasını keseceğim.

Buradan bir kesik atın ve çevirin. Buradan kesebilirim. Görüntüleme için iki fotonlu mikroskobumuzda hazırlayabileceğimiz güzel, küçük bir doku parçamız oldu.

Bunlar, dokumuzun boyutuna göre kestiğimiz kırılmaz plastik lamellerdir. Ardından, bet bond kullanarak dokuyu bunların üzerine monte ederiz. Sonrasında, bu kırılmaz plastik lamelleri silikon gres yardımıyla in situ görüntüleme tablasına sabitleriz.

Hafif kavisli olan bu küçük kulak dokusu parçasını alacağım, bu yüzden yapıştırırken düzeltmem gerekecek. İdeal değil ama işe yarayacaktır. Bu lamellerden birini alıp, kulağınızın boyutunu yaklaşık olarak tahmin ederek, olması gerektiğini düşündüğünüzden biraz daha büyük bir parça kesin.

Dokumuzu lamelle sabitlemek için, bet long adı verilen dokuya güvenli bir süper yapıştırıcı kullanıyoruz. Bunu 3M firmasından temin ediyoruz ve lamellimizin üzerine bundan birkaç damla damlatıyoruz.

Çok fazla kullanmak istemiyorum. Ayrıca yapıştırıcının eşit şekilde yayıldığından da emin olmanız gerekir. Bu nedenle, küçük bir parça lens kağıdı alacağım ve köşesini kullanarak yapıştırıcıyı buradaki lameli boyunca yayacağım.

Ekstra yapıştırıcıyı biraz süreceğim ve bu yapıştırıcı suya değdiği anda kürlenecektir. Bu yüzden doku örneğinize karşı çok dikkatli olmalısınız. Bu nedenle, kavisli kısımda olduğu için muhtemelen görüntülemeyeceğimiz dokunun şu köşesinden tutacağım.

Hafifçe kurulayacağım. Alt kısmını, tamamen kuruması için sadece lens kağıdıyla sileceğim. Ardından, bu sıçan kulak dokusunun köşesini lamelin üzerine değdireceğim.

Dokunduğum yerler hemen kürlenmelidir. Geri kalan kısımları, kenarlarına nazikçe bastırarak biraz düzleştireceğim. Böylece umarım güzel bir görüntüleme çerçevesine sahip olabiliriz.

Şimdi yapacağım işlem, yapıştırıcıyı medyuma daldırarak kürlemektir. Yapıştırıcının dokunun üst kısmına bulaşmasını önlemek için dokuyu ters çeviriyoruz ve önce bir köşesinden başlayarak yavaşça medyum rezervuarına daldırıyoruz; böylece doku güzelce yapışacaktır ve doku görüntüleme haznemizde görüntüleyebileceğiz. Şimdi, in situ görüntüleme için hazırladığımız beyin dokusu parçasını sahneye monte edeceğiz.

İşte alt kısmında silikon gres bulunan doku parçamız; bunu nazikçe besiyeri akışına yerleştiriyoruz. Şu an silikon gres sayesinde sahnenin altına yapışmış durumdadır. Sıcaklık probumuz hemen yanındayken besiyeri akışını başlatıyoruz.

Şimdi odaklanmaya geçiyoruz. Bu yüzden odaklamayı, yeni ışığımızı, yani parlak alan aydınlatmasını açacağım. Ardından 20x objektifimizi alıp hazneye doğru indireceğim.

Dokuya temas etmediğinden emin olun. Okülerden bakarak kulak dokusuna odaklanın. İşte orada.

Burada, sıçan kulağının dermal tabakasındaki otofloresan yeşil kıl foliküllerini görüyorsunuz. Bu kıl foliküllerini yoğun bir kolajen tabakası çevrelemektedir. Bu tabaka, T efektör bellek hücrelerinin T foton görüntülemesi için tarafından bizim tarafımızdan uzaklaştırılan tabakadır.

Otofloresan kıl folikülleri, üst dermal tabakanın parlak kollajeni gibi görüntüyü perdeleyecektir. Tamam, burada Texas red konjuge volin almış APC'leri görebilirsiniz ve bunlar mavi kollajen lifleri boyunca yerleşmiş durumdalar. Kollajen lifleri, kollajen lifleri boyunca elde ettiğimiz foton görüntülemedeki ikinci harmonik üretimi nedeniyle mavidir.

Oldukça hareketli T hücrelerimiz var. Bunlar kollajen liflerin üzerinde ileri geri hareket eder ve APC'lerle etkileşime girerler. Bu videoda Dr. Christine Beaton'ın, Lewis sıçanında adaptif DTH indüklediğini gördünüz.

Ardından, görüntüleme için kulak hazırlığımızı, yanıt veren T efektör hafıza hücrelerini, sıçan kulağını ve bunu gerçekleştirmek için kullandığımız iki fotonlu teknikleri gösterdik.