Kabul edilmiş DTH indüksiyonu sonra Kulak Görüntüleme Efektör Bellek T hücreleri
August 14th, 2008
Burada uyaran ve sıçan kulak gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) reaksiyon ilerleme kaydetmek için bir yöntem gösteriyor. Bu sıçan kulak doku hazırlanması / bellek efektör T hücre yanıtının iki foton görüntüleme için bir gösteri izledi.
Merhaba, ben Melanie Matthew. California Irvine Üniversitesi'ndeki Micah Hollins laboratuvarında Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nde yüksek lisans öğrencisiyim. Ve bugün, Dr. Christine Beaton ile birlikte, size sıçan kulağındaki yanıt verme etkisini veya hafıza T hücresi popülasyonunu nasıl görüntülediğimizi göstereceğiz.
Dr.Christine Beaton ilk olarak sıçan kulağında gecikmiş tip aşırı duyarlılık DTH'sini indükleyecektir. Ve sonra iki fotomikroskopi ile sıçan kulağının yerinde görüntülenmesine geçeceğiz. İki gün önce, hiper halde albümine özgü T hücrelerinin GFP'sini bir Lewis'e enjekte ettim.
Ve bugün aynı kulağıma gelen fareye meydan okuyacağım. Sağ kulağıma albümin enjekte edeceğim. Ve sol kulağıma sadece biraz PBS enjekte edeceğim.
Enjekte ettiğim albüminin dozu 20 mikrolitrede 20 mikrogram. Ve kullandığım albümin, albümin etiketli ve albümin etiketsiz Texas Red'in bire bir karışımı. İşte bu, size nasıl enjekte edeceğimi göstereceğim doğru nokta.
Yani sol elim var, sağ elimi kullanıyorum. Bu yüzden sol elimle eldiveni çıkardım, bir parmağımı kulağın altına, diğerini de üstüne koyup cildi gerebilmem için iğneyle tam olarak nerede olduğumu görebilmek ve havadaki iki deri tabakasının arasına girebilmek için, ki bu çok ince. Bunun için 27 gauge iğne kullanıyorum ve oraya son derece ince bir şey girmesini sağlıyorum.
Yani eğer tersine çevirirsem, kesinlikle Teksas kırmızısının nereye gittiğini ve PBS'nin nereye gittiğini görürsünüz. Şimdi buradaki meydan okumadan 42 saat sonrayız ve kulak kalınlığını ölçmek için yaylı bir mikrometre kullanacağım. Bu yüzden her iki kulağı da ölçeceğim, albümin ile mücadele edilen sağ kulak ve itiraz edilmeyen sol kulak ve kalınlığınızdaki fark bize iltihabın yoğunluğu hakkında bir fikir verecek.
Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 veya 58 veya 57 veya 57. Ve diğer kulak 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Hi.So Christine Beaton, DTH tepkisini ölçtükten sonra çıkardığı fareyi bize az önce verdi.
Onları buraya, buzun üzerinde taşıdık. Bu, farenin sol kulağıdır. Ve şimdi burada Ian Parker'ın laboratuvarında iki foton mikroskobu yapıyoruz.
Bu yüzden bu kulakları yerinde iki foton görüntüleme için hazırlayacağım. Bu yüzden kulağın dibinde fare kulaklarından birini hazırlayacağım. Doku çok daha kalın ve biraz saçımız var, eğer kesmeye başlarsam biraz dağınık olacak.
Bu yüzden yapacağım ilk şey saçların bir kısmını kesmek. Sadece nazikçe kulağımı tutuyorum. Parmağım, başparmağınız ve işaret parmağınız arasında tuttuğunuzda dokuyu gerçekten kontrol etmeyi çok daha kolay hale getiriyor.
Forseps kullanmaya tercih ederim çünkü forseps, sadece, dokunun ne yaptığını o kadar kolay hissedemiyorum ve her zaman dokuya zarar vermekten endişe ediyoruz. Bu yüzden onunla ne yaptığımızı hissedebilmek istiyoruz. Bu yüzden parmaklarımı kullanmayı seviyorum.
Bu, sıçan kulağında buradan soyulan dermal tabakadır. Bu yüzden saçların bir kısmını keserken, bu dermisin bir kısmını nazikçe kesebildim. Bunu yapmak için çok küçük bir diseksiyon makası var, sadece güzel bir kavisli makas.
Dokuyu yumruklamak istemezsiniz ve kulağın tabanından tepeye doğru ilerleyebilir, sadece bazı dermal tabakayı nazikçe kesebilirsiniz. Yani görüntüleme için çok büyük bir pencereye ihtiyacımız yok. Tam buradaki bu alan, dokuya sızan hücrelerin bazı güzel görüntülerini elde etmek için yeterli olacaktır.
Gördüğünüz gibi, kulağın dibinde hala sağlam kan damarlarımız var ve hemen hemen kulağın ucuna kadar uzanıyor. Tüm bu alan DTH'yi görüntülemek için gerçekten iyi olacaktır. Bu yüzden devam edeceğim ve açığa çıkardığım o doku parçasını kesip küçük bir doku parçası yapacağım, böylece görüntüleme aşamamıza kadar yapıştırabiliriz.
Bu yüzden burada bir kesim yapın, ters çevirin. Burayı kesebilirim. Görüntüleme için iki foton dürbünümüzde hazırlayabileceğimiz güzel bir küçük doku parçamız var.
Dokumuzun boyutuna göre kestiğimiz kırılmaz plastik lamellerdir. Ve sonra dokuyu bahis bağını kullanarak bunların üzerine monte ediyoruz. Daha sonra bu kırılmaz plastik lamerleri silikon gres kullanarak insitu görüntüleme aşamamıza sabitliyoruz.
Bu küçük hava dokusu parçasını alacağım, biraz eğriliği var, bu yüzden yapıştırırken düzleştirmem gerekecek. İdeal değil, ama işe yarayacak. Yani bu kapaklardan birini alıyorsunuz ve kesiyorsunuz, kulağınızın boyutunu tahmin ediyorsunuz ve düşündüğünüzden biraz daha büyük kesiyorsunuz.
Mendilimizi kapak kızağına monte etmek için. Bet long adı verilen doku için güvenli bir süper yapıştırıcı kullanıyoruz. Bunu 3M'den alıyoruz ve bundan sadece birkaç damla kapak fişimize koyuyoruz.
Çok fazla sahip olmak istemiyorum. Ayrıca eşit olarak yayıldığından emin olmak istersiniz. Bu yüzden küçük bir parça lens kağıdı alacağım ve köşesini yapıştırıcıyı kapak fişinin üzerine fitillemek için kullanacağım.
Ekstra yapıştırıcıda biraz yukarı çıkacak ve bu yapıştırıcı suya temas ettiği anda sertleşecektir. Bu yüzden doku örneğinizde çok dikkatli olmak istersiniz. Bu yüzden burada doku köşesini tutacağım, muhtemelen kavisli kısımda olduğu için görüntülemeyeceğiz.
Biraz kurutacağım. Alt kısmı, sadece lens kağıdının üzerinde, böylece hepsi kurudu. Ve onun köşesine dokunacağım, bu sıçan kulağı dokusuna kapak fişine.
Ve dokunduğum yerde hemen iyileşmeli. Geri kalanını, kenarlarına hafifçe bastırarak biraz düzleştireceğim. Umarım güzel bir görüntüleme çerçevesine sahip olabiliriz.
Şimdi yapacağım şey, yapıştırıcıyı medyaya batırarak iyileştirmek. Bu nedenle, yapıştırıcının dokunun üzerine çıkmasını önlemek için, baş aşağı çeviriyoruz ve önce medya rezervuarımıza yavaşça bir köşeye daldırıyoruz ve güzelce yapıştırılmalı ve doku görüntüleme odamızda görüntüleyebilmeliyiz. Şimdi in situ görüntüleme için hazırladığımız doku parçasını, bira mendili parçasını sahneye monte edeceğiz.
İşte burada bizim doku parçamız, altında silikon yağ var, ve biz onu nazikçe medya akışına yerleştiriyoruz. Şimdi sahnenin dibine yapışmış silikon yağıdır. Hemen yanındaki sıcaklık probumuzla ortam akışını aydınlatın.
Ve şimdi odaklanacağız. Bu yüzden odağımızı, yeni ışığımızı, parlak kabuğumuzu açacağım. Bu yüzden 20 x hedefimizi alacağım ve onu odanın içine indireceğim.
Dokuya temas etmediğinden emin olun. Göz merceğinden bakın ve kulak dokumuza odaklanın. Ve işte burada.
Burada sıçan kulağının dermal tabakasında otofloresan yeşil saç foliküllerini görüyorsunuz. Bu saç foliküllerini çevreleyen yoğun bir kollajen tabakasıdır. Bu, T fektör hafıza hücrelerinin T foton görüntülemesi için çıkardığımız bir katmandır.
Otofloresan saç folikülleri, üst dermal tabakanın parlak kollajeni gibi görüntüyü gizleyecektir. Tamam, burada gördüğünüz gibi Teksas kırmızısı konjuge volin almış APC'lerimiz var ve bunlar mavi kollajen lifleri boyunca yuvalanmışlar. Kollajen lifleri, kollajen lifleri boyunca foton görüntülemeye aldığımız ikinci harmonik nesil nedeniyle mavidir.
Son derece hareketli tcell'imiz var. Kollajen liflerini yukarı ve aşağı sürünürler ve APC'lerle etkileşime girerler. Bu videoda Dr.Christine Beaton'ı gördünüz, Lewis faresinde evlat edinen DTH'yi indükledi.
Ve sonra size görüntüleme için kulak hazırlığımızı, duyarlı T efektör hafıza hücrelerini, ve sıçan kulağını ve bunu yapmak için iki foton tekniğimizi gösterdik.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, sıçan kulağında gecikmeli tip aşırı duyarlılık (DTH) reaksiyonlarının indüksiyonu ve kaydı yöntemini gösterir ve bunu, T hücre tepkilerinin iki-foton görüntüleme için sıçan kulağı dokusunun hazırlanması izlemektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Nörobilim
- Biyofizik
Arka Plan
- Gecikmeli tip aşırı duyarlılık (DTH) önemli bir bağışıklık tepkisidir.
- T hücre dinamiklerini anlamak, immünolojik araştırmalar için kritik öneme sahiptir.
- İki-foton mikroskobu, hücresel tepkilerin in situ görüntülemesine izin verir.
- Sıçan modelleri, bağışıklık tepkilerini incelemek için yaygın olarak kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Sıçan kulaklarındaki DTH reaksiyonlarını indüklemek ve kaydetmek.
- Efektör ve bellek T hücre popülasyonlarını görselleştirmek.
- Vivo T hücre davranışı hakkındaki anlayışı artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Sıçan kulağı dokusunda DTH indüksiyonu.
- GFP etiketli T hücrelerinin enjeksiyonu.
- Görüntüleme için iki-foton mikroskobu.
- T hücre tepkilerinin in situ analizi.
Ana Sonuçlar
- Sıçan kulak modelinde DTH'nin başarılı bir şekilde indüksiyonu.
- İki-foton mikroskobu kullanarak T hücre popülasyonlarının görselleştirilmesi.
- Vivo bağışıklık tepkilerinin dinamiği hakkında bilgiler.
- Bu yöntem, daha fazla immünolojik çalışmaya uygulanabilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, DTH reaksiyonlarını incelemek için güvenilir bir yaklaşım sağlar.
- İki-foton görüntüleme, T hücre davranışı gözlemlemenin etkili olduğunu gösterir.
- Bu araştırma, bağışıklık tepkilerinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of effector memory T cell dynamics in a tissue-specific immune response, supporting mechanistic de-risking in immunology target validation. By combining adoptive DTH induction with two-photon imaging, it provides quantitative, spatially resolved data on T cell motility and antigen-presenting cell interactions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular behavior to functional immune outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing CCR7- effector/memory T cell recruitment and activation in vivo.
- Operational Value: Enables functional validation of immunomodulatory targets through direct observation of T cell-APC interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating T cell motility patterns with inflammatory intensity in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized tissue explants for consistent, reproducible imaging of immune cell dynamics.
- Operational Value: Establishes a platform for quantitative readouts such as cell tracking, interaction frequency, and infiltration depth.
- Scalability: Uses minimally processed ear tissue compatible with high-resolution imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains immunological relevance by preserving native tissue architecture and cell-cell interactions during imaging.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal tracking of immune responses in the same model.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity in lead identification by providing direct evidence of target engagement in tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative refinement of immunomodulatory candidates based on real-time immune cell behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing T cell responses to antigen challenge in a controlled DTH model.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with standardized thickness and mounting for reproducible two-photon imaging.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cell velocity, track length, and spatial distribution relative to collagen and APCs.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical by using the same rat model for both induction and imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple immunology targets and antigen-specific T cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking through direct visualization of effector memory T cell function in tissue.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging conditions to improve reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking T cell dynamics to inflammatory outcomes in a predictive model.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by validating target effects on immune cell behavior prior to costly in vivo studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in adoptive T cell transfer, DTH induction, and two-photon microscopy.
- Dependent on access to two-photon microscopes with second harmonic generation capability for collagen visualization.
- Necessitates standardized tissue handling protocols to ensure consistent mounting and viability during imaging.
- Involves adaptation considerations when applying the ear preparation method to other tissue types or disease models.
- Limited by the need for antigen-specific T cell lines and appropriate controls to distinguish specific from nonspecific inflammation.
